Summary
Ce travail décrit deux méthodes pour étudier le développement d’organes, une configuration améliorée de xénotransplantation sur la membrane chorioallantoïque (CAM) des embryons aviaires qui permet la vascularisation des organes embryonnaires et des organoïdes cultivés et une nouvelle z-direction fixe méthode de culture d’organe avec des conditions expérimentales modifiées qui permet l’imagerie confocale de time-lapse à haute résolution.
Abstract
Les cultures organotypiques rénales embryonnaires, et en particulier les organoïdes rénaux pluripotents dérivés de cellules souches, sont d’excellents outils pour suivre les processus développementaux et modéliser les maladies rénales. Cependant, les modèles sont limités par un manque de vascularisation et de fonctionnalité. Pour remédier à cela, un protocole amélioré pour la méthode des cellules et des tissus de xenografting à la membrane chorioallantoïque (CAM) d’un embryon aviaire pour gagner la vascularisation et la restauration du flux sanguin a été développé. Les greffes sont recouvertes de minireservoirs sur mesure qui réparent les échantillons à la CAM et leur fournissent un milieu de culture qui protège les greffes du séchage. La méthode de culture améliorée permet aux xénogreffes de croître jusqu’à 9 jours. Le manuscrit décrit également comment fournir des conditions optimales pour l’imagerie confocale à long terme des organoïdes rénaux et des cultures organotypiques en utilisant la méthode précédemment publiée Fixed Z-Direction (FiZD). Cette méthode comprime doucement un organe embryonnaire ou un organoïde entre un housse de verre et une membrane dans une grande quantité de milieu et fournit d’excellentes conditions pour l’imagerie pendant jusqu’à 12 jours. Ensemble, ces méthodes permettent la vascularisation et le flux sanguin vers les organoïdes rénaux et les cultures rénales organotypiques avec l’imagerie confocale améliorée. Les méthodes décrites ici sont très bénéfiques pour étudier les fonctions fondamentales et appliquées des reins ex vivo. Les deux méthodes s’appliquent à divers types de tissus et d’organoïdes.
Introduction
La culture organotypique des reins embryonnaires est devenue un modèle important pour étudier la néphrogenèse il y a des décennies1,2,3. Les organoïdes rénaux représentent un système modèle avancé pour étudier le développement des reins sains et malades4. Le principal inconvénient pour les deux méthodes, cependant, est que ni l’une ni l’autre méthode ne récapitule la fonction principale du rein: la filtration sanguine. Les néphrons et la vascularisation rénale se développent dans les organoïdes rénaux et les cultures organotypiques de la même façon qu’au développement in vivo à un stade précoce; cependant, le glomeruli formé in vitro restent avascular5. La vascularisation des reins embryonnaires ex vivo et des organoïdes rénaux a été précédemment démontrée dans des expériences de transplantation seulement dans des conditions in vivo. Par exemple, la transplantation d’organoïdes rénals pluripotents humains dérivés de cellules souches sous une capsule rénale de souris permet le développement des néphrons dans l’organoïde à un stade fonctionnel6.
Une approche intermédiaire entre les cultures purement in vitro et les méthodes de transplantation in vivo est la xénotransplantation à l’ACM des embryons aviaires. La vascularisation de la primordia rénale de souris intacte a été démontrée précédemment utilisant ce système7,8. Cependant, il a également été démontré que la vascularisation rénale dans le rein murin xénotransplanted a été dérivée de l’endothélium hôte, et non de la greffe9. Cette observation a réduit de manière significative le potentiel des modèles chimériques (mammifères aviaires) du rein embryonnaire pour étudier le développement de la vascularisation rénale, parce que les conditions expérimentales étaient non permémissives pour la survie des cellules endothéliales de donneur-dérivé.
Présenté dans la première partie de ce protocole est une méthode améliorée pour la culture des reins embryonnaires de souris sur CAM des oeufs aviaires, combinant des conditions microenvironmentales de la culture organotypic et la xénotransplantation. La principale amélioration des méthodes précédentes est qu’au lieu de placer les reins embryonnaires de souris et les organoïdes rénaux directement sur le CAM, la zone d’implantation est recouverte de minireservoirs perméables remplis de milieu de culture qui fournissent le tissu transplanté avec des nutriments et le protéger contre le séchage. Le taux de réussite des expériences augmente considérablement et les conditions de développement de la vascularisation dérivée du donateur s’améliorent. L’application de cette méthode aux cultures xénotransplantes entraîne le développement de la vascularisation glomerulaire composée des cellules endogènes endothéliales des reins de donneur.
L’analyse détaillée de la morphogenèse cellulaire est une autre application importante des modèles de culture rénale. Les méthodes précédemment rapportées d’acquisition d’image en time-lapse des cultures rénales ne sont suffisantes que pour l’analyse de la morphologie globale et le modelage des reins embryonnaires, mais pas pour le suivi des cellules individuelles10. Récemment, une nouvelle méthode fixe Z-Direction (FiZD) visant à la formation à temps 3D confocale haute résolution des organoïdes rénaux et des cultures organotypiques a été décrite11. Dans cette méthode, les organoïdes et les organes embryonnaires sont doucement comprimés entre un housse en verre et une membrane perméable d’un insert transwell dans une plaque conçue sur mesure jusqu’à ce que l’épaisseur de l’échantillon atteigne 70 m, offrant des conditions optiques optimales pour l’imagerie. Dans la deuxième partie des méthodes, un protocole détaillé pour la fabrication d’une plaque conçue sur mesure et la configuration d’expériences FiZD pour l’imagerie organoïde à long terme est décrit.
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Protocol
Les soins et procédures des animaux étaient conformes à la législation nationale finlandaise pour l’utilisation d’animaux de laboratoire, à la Convention européenne pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales et autres scientifiques (ETS 123) et à la directive 86/609/CEE de l’UE.
1. Fabrication de minireservoirs pour la culture de reins embryonnaires de souris et d’organoïdes rénaux sur le poulet CAM et mise en place d’expériences de xénotransplantation
- Utilisez des inserts de culture cellulaire transwell conçus pour 6 plaques de puits ou 12.
REMARQUE : Selon l’expérience particulière, de grands ou de petits minireservoirs peuvent être utilisés. Il est préférable d’utiliser de petits minireservoirs pour le xenografting jusqu’à huit reins embryonnaires ou lorsque plusieurs minireservoirs seront placés sur le même embryon de poulet (p. ex., des échantillons d’expérience et de contrôle sur le même MCA de poulet). - Couper les côtés des inserts à l’aide d’un multi-courant rotatif avec une lame de scie circulaire ou une scie à main pour créer un anneau en plastique de 2 mm de haut avec une membrane perméable attachée à elle.
- Polonais les bords de ces minireservoirs avec un scalpel ou un couteau pointu.
- Stériliser les minireservoirs dans 70% d’éthanol pour au moins 1 h.
- Laver les minireservoirs dans de l’eau autoclaved à double distillation et les laisser sécher dans une hotte laminar.
- Rincez les minireservoirs en PBS et milieu de culture (haute teneur en glucose DMEM/10% FBS/1% pénicilline-streptomycine).
- Placer le réservoir dans un plat Petri, au-dessus d’une goutte (600 L/400 l) de milieu de culture avec la membrane face vers le haut.
- Disposer les reins embryonnaires ex vivo disséqués ou les organoïdes rénaux uniformément sur la membrane à l’aide d’une pipette ou d’un tube capillaire en verre. Évitez de laisser beaucoup de liquide autour des reins.
- Laissez les échantillons se fixer à la membrane pendant 2 à 24 h dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC et 5% de CO2.
REMARQUE : Jusqu’à huit reins de souris embryonnaires ou organoïdes de rein d’E11.5 peuvent être disposés sur le petit insert. Le grand insert est recommandé si soit de plus gros morceaux de tissu embryonnaire seront utilisés pour le xénotransplant ou un mélange de cellules-hydrogel sur une plus grande surface de la CAM. - Prenez 8-day-old ex ovo cultivé poulets embryonnaires préparés selon les méthodes publiées précédemment de l’incubateur de culture cellulaire12,13.
- Transférer les minireservoirs au CAM afin que les greffes soient face au CAM, et la membrane les recouvre. Placez les minireservoirs à la périphérie de l’ACM, afin qu’ils ne couvrent pas l’embryon de poulet.
REMARQUE : Lors de l’utilisation des minireservoirs plus petits fabriqués à partir d’inserts transwell pour 12 plaques de puits, jusqu’à trois minireservoirs peuvent être placés sur un CAM. - Ajouter 500 L (6 insert de puits) ou 300 L (12 insert de puits) de milieu de culture aux minireservoirs.
- Cultiver les échantillons sur le poulet CAM pendant un maximum de 9 jours. Remplacer le milieu de culture dans les minireservoirs tous les jours.
REMARQUE : La vascularisation des échantillons peut être observée dès 24-48 h après la transplantation.
2. Fabrication de plaques conçues sur mesure et mise en place de cultures FiZD
- Percer des trous de 20 mm de diamètre dans le fond d’une plaque de 6 puits.
REMARQUE : Pour les expériences FiZD, utilisez 6 plaques de puits avec une profondeur de puits de 16 mm (spécifiée dans le tableau des matériaux). - Polonais les jantes des trous (en particulier sur le côté supérieur) à l’aide d’une perceuse électrique avec un bit de perceuse à vis- à effet de compteur, d’un scalpel ou d’un couteau tranchant.
- Stériliser les plaques dans 70% d’éthanol pendant au moins 1 h.
- Laver les assiettes dans de l’eau autoclaved à double distillation et les laisser sécher dans des conditions stériles.
- Laver complètement les couvertures en verre de 22 mm x 22 mm avec 70 % d’éthanol ou les nettoyer selon le protocole publié par Saarela et al.11.
- Collez les couvertures sur le côté supérieur des trous dans 6 plaques de puits à l’aide d’une colle de tissu non toxique. Appliquer de la colle autour du trou et placer délicatement le coverlip pour le couvrir. Laisser sécher la colle.
- Inspectez les plaques sous un stéréomicroscope et retirez l’excès de colle séchée de la surface des coverlips si nécessaire.
REMARQUE : Vérifiez qu’il n’y a pas de colle au-dessus du coverlip pour assurer même la compression des échantillons. - Mélanger les perles de polystyrène (70 m de taille de particules) avec un volume égal d’hydrogel. Un volume de 50 à 100 ll par puits est suffisant.
REMARQUE : Gardez le mélange de perles d’hydrogel et de polystyrène sur la glace. - Placer un insert transwell sous un microscope disséquant avec la membrane vers le haut.
- Disposer les échantillons (p. ex., reins embryonnaires ex vivo ou organoïdes rénaux) uniformément sur la membrane.
- Ajouter le mélange de perles d’hydrogel/polystyrène à côté des échantillons soigneusement pour éviter des dommages aux tissus fragiles.
- Retourner l’insert transwell de sorte que la membrane avec les échantillons assemblés sur elle est orientée vers le bas.
- Placez doucement l’insert dans un puits de la plaque de puits modifiée de 6 et appuyez doucement vers le bas afin que les échantillons soient comprimés au niveau des perles.
REMARQUE : Suivez l’évolution de la compression à l’aide d’un microscope. - Gardez l’insert légèrement pressé au puits avec une main et fixez-le à la plaque en faisant fondre le plastique avec un fer à souder à trois points à la périphérie de l’insert.
- Lorsque l’insert est fixé à la plaque, ajouter 2 ml de milieu de culture (DMEM/10% FBS/1% pénicilline-streptomycine) au puits et continuer à assembler les puits restants dans la plaque de la même manière.
- Transférer la plaque finie dans un incubateur sur scène d’un microscope inversé pour l’imagerie par time-lapse.
- Effectuez l’imagerie en accéléré des échantillons à l’aide de paramètres expérimentaux appropriés.
REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de changer le milieu de culture dans les puits de la plaque pendant les expériences en time-lapse, mais il peut être facilement fait à travers les trous sur les côtés de l’insert.
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Representative Results
Le protocole de culture CAM présenté ici a permis une vascularisation très efficace des organoïdes rénaux et des reins embryonnaires à la suite de la xénotransplantation sur le poulet CAM(figure 1, Film 1). Les minireservoirs contenant le milieu de culture fournissaient des éléments nutritifs au tissu de distributeur et les protégeaient du séchage pendant la période précédant la vascularisation appropriée. Cette méthode a fourni des conditions permissives pour que les cellules endothéliales de donneur-dérivées se développent. Par conséquent, la vascularisation rénale dans les reins et les organoïdes transplantés a été représentée principalement, mais pas exclusivement, par des cellules spécifiques aux donneurs(figure 2B,C,F). Une vascularisation gloméulare plus mature a été obtenue dans les reins et les organoïdes rénaux transplantés à l’ACM que dans les cultures organotypiques rénales(figure 2D,E).
Le protocole FiZD est une méthode conçue pour l’imagerie à long terme en time-lapse des reins embryonnaires ex vivo et des organoïdes rénaux à l’aide de microscopie confocale haute résolution. Dans le protocole de culture organotypique classique conçu par Trowell14, un spécimen est placé sur un filtre poreux, soutenu par une grille métallique, et conservé à l’interface air-liquide (figure 3A). Cette méthode n’est pas optimale non plus pour un type de microscope droit ni inversé. La méthode présentée ici a été spécifiquement conçue pour fonctionner avec un microscope inversé pour l’imagerie. L’échantillon a été immobilisé entre un housse de verre d’en bas et une membrane poreuse d’insert transwell (voir ci-dessus) (figure 3B). La distance optimale entre la membrane et le housse était de 70 m. Les perles de polystyrène ont été utilisées comme espaceurs pour définir l’épaisseur du spécimen dans cette gamme(figure 3B).
Il n’y a pas de 6 assiettes de puits disponibles dans le commerce où le housse en verre est situé à la surface supérieure du fond du puits. Par conséquent, un protocole a été développé pour la fabrication de plaques conçues sur mesure qui ont cette fonctionnalité (figure 3B). La figure 4 montre la morphologie représentative d’une culture rénale embryonnaire(figure 4A,DetF) et les organoïdes rénaux(figure 4B,C). Le film 2 représente les résultats de l’imagerie en time-lapse haute résolution des cellules endothéliales dans le rein embryonnaire de souris cultivé dans une configuration de FiZD. Le panneau de droite dans le film 2 démontre que la distribution et la migration des cellules individuelles ont pu être observées à l’aide de cette méthode.
Figure 1 : Xénotransplans rénaux embryonnaires murines à l’embryon de poulet CAM. Xénotransplantation des reins de souris embryonnaires E11.5 en embryon de poulet ex ovo de 8 jours; un rein embryonnaire murine a été cultivé pendant 7 jours sur CAM. Barre d’échelle de 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Film 1 : Flux sanguin dans le rein embryonnaire murin après xénotransplantation à l’embryon de poulet CAM. Un rein embryonnaire murine E11.5 a été xénotransplanted à l’CAM d’un embryon de poulet de 8 jours et cultivé pendant 7 jours. Le film montre le flux sanguin de poulet dans le xénogreffe au jour 7. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit à télécharger.)
Figure 2 : Xénotransplantation embryonnaire de rein de Murine sur l’embryon de poulet CAM. Les reins embryonnaires (m) de Murine E11.5 ont été cultivés comme culture organotypic (c.-à-d. le contrôle) ou xénotransplanted à un MCM embryonnaire de 8 jours (c) (c.-à-d., expérience). Après 5 jours de culture des reins embryonnaires, les échantillons de contrôle et d’expérimentation ont été fixés et tachés pour le marqueur endothélial CD31 (rouge) (A-E) et les noyaux (Hoechst; bleu) (D, E). (C) Anastomoses entre les vaisseaux sanguins de poulet et de souris (pointes de flèche). (D,E) Une seule tranche confocale du milieu du néphron est montrée. (F) Xenotransplantation de rein embryonnaire murine E11.5 à GFP-poulet CAM transgénique pendant 7 jours, taché pour CD-31 (rouge). Barres d’échelle ' A'B 100 'm; C-E 20 m; F 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Méthode de culture Z-direction fixe. (A) Méthode de culture traditionnelle où l’échantillon se développe sur une membrane poreuse soutenue par une grille et tenant l’explant à l’interface air-liquide. (B) Dans la nouvelle configuration FiZD, l’échantillon a été doucement comprimé entre le housse en verre et une membrane poreuse transwell. Les perles de polyester contrôlaient l’épaisseur de l’échantillon ajusté dans la direction z. Ce chiffre a été modifié à partir de Saarela et al.11. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Reins embryonnaires et développement d’organoïdes rénaux dans la nouvelle méthode de culture FiZD. Les reins embryonnaires (A, D-F) et les organoïdes rénaux (B-C) ont été cultivés à l’aide de la nouvelle configuration FiZD. (A) Image Brightfield d’un rein de souris embryonnaire intact le jour 7 de la culture FiZD. (B) Image Brightfield d’un organoïde de rein de souris le jour 7 de la culture FiZD. (C) MtmG (rouge) organoïde de rein de souris a été cultivé pendant 4 jours en utilisant la nouvelle configuration FiZD. L’instantané de la pile d’images time-lapse montre l’expression GFP (verte) activée par Wnt4Credans les néphrons en développement. (D) Le rein embryonnaire de souris a été cultivé pendant 7 jours utilisant la nouvelle configuration de FiZD. Six2 (vert) et Troma-1 (Krt8, rouge) colorants ont montré des précurseurs de nephron et des bifurcations de bourgeons uréteriques (UB), respectivement. (E) Le rudiment embryonnaire de rein de souris a été cultivé pendant 12 jours utilisant la nouvelle configuration de FiZD. Il a été taché avec Troma-1 (rouge) et Nephrin (vert), et a montré des bifurcations UB et podocytes, respectivement. (F) Le même échantillon que dans (E) avec grossissement de haute puissance de Troma-1 (rouge) UB et la Nephrin (vert) podocytes. Ce chiffre a été modifié à partir de Saarela et al.11. Barres d’échelle A-D, F 100 m; E 1.000 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus large de ce chiffre.
Film 2 : Les cellules endothéliales rénales étiquetées avec GFP se développent dans la nouvelle configuration FiZD et peuvent être observées avec la microscopie confocale haute résolution. Reins embryonnaires de E11.5 mTmG; Les souris Tie1Cre ont été disséquées et cultivées 6 jours à l’aide de la nouvelle configuration FiZD. Le film montre l’expression de GFPinduite par Tie1Cre dans des cellules endothéliales. Une pile de 20 z-couches a été prise à l’aide d’un objectif 10x/0.45, avec des images obtenues toutes les 15 minutes. Dans le film, cinq cales de Z de GFP et un plan focal de champ lumineux sont fusionnés. Le panneau de droite montre un gros plan d’un rein en développement. On peut voir des cellules endothéliales migrer dans la fente vasculaire des néphrons de stade en forme de S. Dans le panneau sur la droite, GFP z-couche et un plan focal de champ lumineux sont fusionnés. Les cellules qui se déplacent rapidement sont probablement des macrophages15. Le signal de GFP a également été exprimé par quelques cellules sanguines. Taille Voxel 0,69 m x 0,69 m x 4,13 m. Ce film a été modifié de Saarela et al.11. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit à télécharger.)
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Discussion
Deux protocoles détaillés sont présentés qui affinent la méthode classique de culture organotypique rénale, et permettent la vascularisation, le développement prolongé, et l’imagerie optimale 4D (c.-à-d. image et temps 3D) des reins embryonnaires ex vivo et des organoïdes. Cette section met en évidence les étapes critiques des méthodes et traite du dépannage.
La différence significative entre d’autres méthodes de culture DE CAM et cette méthode améliorée de culture de CAM de poulet est l’utilisation des minireservoirs sur mesure dans le xenografting des reins embryonnaires et des organoïdes de rein à l’CAM. Le fond de la membrane de l’insert transwell modifié presse les échantillons contre le MCM de poulet et les maintient en place. Les côtés de l’insert servent de réservoir pour le milieu de culture qui protège la greffe contre le séchage. Xenografting à l’ex ovo cultivé poulet embryonnaire CAM est fortement recommandé, que cette méthode expose une plus grande zone de la CAM où le minireservoir peut être placé et le rend facile de suivre visuellement le processus de vascularisation12,13.
Un inconvénient de la méthode de culture CAM de poulet est que la fenêtre de temps pour effectuer la xénotransplantation est limitée aux 8-9 jours où le CAM de l’embryon de poulet fonctionne avant qu’il commence dégradant. Les greffes nécessitant plus de temps pour se développer devraient donc être vascularisées par xénotransplantation à un tissu différent (p. ex., capsule rénale de souris)6. La xénotransplantation sérielle du tissu de distributeur pourrait être une solution à ce long problème de temps d’incubation. La méthode pourrait être adaptée pour l’imagerie en accéléré de la vascularisation et du développement de la greffe, mais d’abord l’exigence de stabilisation du minireservoir et de l’ACM pour l’imagerie à long terme doit être abordée. Le principal avantage de ce protocole amélioré de xénotransplantation rénale au MCA de poulet est que la méthode fournit des conditions pour que les cellules endothéliales de donneur-dérivées prospèrent.
Le protocole FiZD décrit une méthode conçue pour l’imagerie à long terme en time-lapse des reins embryonnaires ex vivo et des organoïdes rénaux à l’aide de microscopie confocale haute résolution. Pour la configuration, il est essentiel que les dimensions du puits et insérer match. Lorsqu’un coverlip est collé au fond d’une plaque de 6 puits et que l’insert est placé sur le puits, la membrane de l’insert doit toucher le verre. Ensuite, lorsque la culture est mise en place, les perles d’espace déterminera la position de la membrane et, par conséquent, l’épaisseur de l’organe ou de l’organoïde cultivé. Pour cette raison, il est essentiel d’enlever l’excès de colle et de vérifier qu’aucun matériau ne limite l’insert de toucher le verre de couverture. Il est également important d’utiliser de la colle de tissu non toxique pour attacher le verre de couverture. S’il vous plaît noter que la colle ne se fixe pas très fortement, il est donc essentiel de manipuler les plaques avec soin. Les plaques peuvent être réutilisées, et si le verre de couverture se détache pendant les étapes de lavage, il peut être collé en arrière.
La méthode d’imagerie FiZD permet l’étude de la néphrogenèse à un niveau unicellulaire. La haute qualité des images en time-lapse haute résolution permet l’application de la segmentation cellulaire automatisée pour étudier le comportement cellulaire dans les organoïdes rénaux et les cultures rénales. Plusieurs échantillons situés dans différents puits d’une plaque de 6 puits peuvent être étudiés simultanément dans des conditions de culture différentes. La technique peut être facilement modifiée pour différentes tailles et types de tissus et d’organoïdes en changeant la taille des perles d’espaceur; cela a été démontré avec les cultures de cellules ovariennes14. Comme une optimisation supplémentaire de cette méthode, combinant la configuration FiZD avec des approches microfluidiques récemment publiées16 pourrait être très bénéfique pour l’analyse microscopique haute résolution de la morphogenèse cellulaire aux étapes ultérieures du développement de rein.
Un avantage de la méthode FiZD est qu’il ya beaucoup de milieu de culture disponible et il n’est pas nécessaire de le changer au cours de la semaine de 1 semaine d’imagerie. Pourtant, si un changement de support est nécessaire, le milieu peut facilement être changé à partir d’une ouverture dans le mur de l’insert. La méthode FiZD est également supérieure à d’autres méthodes de culture d’organes en ce qu’elle rapproche le spécimen de l’objectif du microscope. Dans d’autres méthodes de culture largement utilisées il ya une membrane ou un filtre et un fond de plaque de verre entre l’échantillon d’image et l’objectif, interdisant l’imagerie à haute résolution précise17. Avec la méthode FiZD, il est possible d’acquérir des images à haute résolution de tissus vivants.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu financièrement par l’Akatemia Suomen (Académie de Finlande) (206038, 121647, 250900, 260056; Subvention du Centre d’excellence 2012-2017 251314), Munuaiss-iti - Association finlandaise des reins et du foie, sigrid Juseliuksen S’iti, Victoriastiftelsen, La Fondation culturelle suédoise en Finlande, Novo Nordisk, Septième Programme-cadre de la Communauté européenne (FP7/2007-2013; subvention FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608), et H2020 Marie Sklodowska-Actions Curie Innovative Training Network "RENALTRACT" Project ID 64297. Les auteurs remercient Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias et Hannele Hôrkman pour leur assistance technique.
Les figures 3, 4 et le film 2 sont réimprimées avec la permission de Développement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
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