Summary
Dette arbeidet beskriver to metoder for å studere organutvikling, et forbedret xenotransplantasjonsoppsett på chorioallantoic membran (CAM) fra fugleembryoer som gjør det mulig for vaskularisering av kultiverte embryonale organer og organoider og en ny fast z-retning organkulturmetode med modifiserte eksperimentelle forhold som gjør det mulig å høyoppløsnings tidsforløp konfokal avbildning.
Abstract
Embryonale nyreorganotypic kulturer, og spesielt pluripotent stamcelle-avledet nyre organoider, er gode verktøy for å følge utviklingsprosesser og modellering nyresykdom. Modellene er imidlertid begrenset av mangel på vaskularisering og funksjonalitet. For å løse dette ble det utviklet en forbedret protokoll for metoden for xenograftingceller og vev til chorioallantoic membranen (CAM) av et fugleembryo for å få vaskularisering og restaurering av blodstrømmen. Grafts er overlaid med skreddersydde minireservoarer som fikser prøvene til CAM og forsyner dem med kulturmedium som beskytter grafts fra tørking. Den forbedrede kulturmetoden gjør det mulig for xenografts å vokse i opptil 9 dager. Manuskriptet beskriver også hvordan man kan gi optimale forhold for langsiktig konfokal avbildning av nyreorganoider og organotypic kulturer ved hjelp av den tidligere publiserte Fixed Z-Direction (FiZD) metoden. Denne metoden komprimerer forsiktig et embryonisk organ eller organoid mellom en glasscoverslip og membran i en stor mengde medium og gir gode forhold for avbildning i opptil 12 dager. Sammen tillater disse metodene vaskularisering og blodstrøm til nyreorganoider og organotypic nyrekulturer med forbedret konfokal avbildning. Metodene som er beskrevet her er svært gunstige for å studere grunnleggende og anvendte funksjoner av nyrer ex vivo. Begge metodene gjelder for ulike typer vev og organoider.
Introduction
Organotypic kultur av embryonale nyrer ble en viktig modell for å studere nefrogenesis tiår siden1,2,3. Nyreorganoider representerer et avansert modellsystem for å studere utvikling av friske og syke nyrer4. Den viktigste ulempen for begge metodene er imidlertid at ingen av metodene rekapitulerer nyrens hovedfunksjon: blodfiltrering. Nephrons og nyrevaskulatur utvikler seg i nyreorganoider og organotypic kulturer på samme måte som tidlig stadium in vivo utvikling; Imidlertid forblir glomeruli dannet in vitro avaskulær5. Vaskelse av ex vivo embryonale nyrer og nyreorganoider ble tidligere vist i transplantasjonseksperimenter bare under in vivo-forhold. For eksempel tillater transplantasjon av humane pluripotente stamcelleavledede nyreorganoider under en musnyrekapsel utvikling av nefronene i organoiden til et funksjonelt stadium6.
En mellomliggende tilnærming mellom rent in vitro kulturer og in vivo transplantasjon metoder er xenotransplantasjon til CAM av fugleembryoer. Vascularization av intakt mus nyre primordia har blitt vist tidligere ved hjelp av dette systemet7,8. Det ble imidlertid også vist at nyrevaskulaturen i xenotransplantert murine nyre ble avledet fra verten endotelet, ikke graft9. Denne observasjonen reduserte signifikant potensialet til kimeiske (fugle-pattedyr) modeller av embryonal nyre for å studere utvikling av nyrevaskulaturen, fordi de eksperimentelle forholdene var ikke tillatte for overlevelsen av donor-avledede endotelceller.
Presentert i den første delen av denne protokollen er en forbedret metode for dyrking av mus embryonale nyrer på CAM av fugleegg, kombinere mikromiljøforhold av organotypic kultur og xenotransplantasjon. Den viktigste forbedringen til tidligere metoder er at i stedet for å plassere musen embryonale nyrer og nyreorganoider direkte på CAM, implantasjonområdet er overlaid med gjennomtrengelige minireservoarer fylt med kultur medium som leverer transplantert vev med næringsstoffer og beskytte den mot tørking. Suksessraten for forsøkene øker betydelig og betingelsene for utvikling av donor-avledet vaskulatur forbedres. Anvendelse av denne metoden til xenotransplant kulturer resulterer i utvikling av glomerulær vaskulatur består av endogene endotelceller fra donor nyrer.
Detaljert analyse av cellulær morfodinese er en annen viktig anvendelse av nyrekulturmodeller. Tidligere rapporterte metoder for tidsforløp bilde oppkjøp av nyrekulturer er tilstrekkelig bare for analyse av generell morfologi og mønster av embryonalnyre, men ikke for å spore individuelle celler10. Nylig ble en ny Fixed Z-Direction (FiZD) metode rettet mot høyoppløselig konfokal 3D-tidsforløpsavbildning av nyreorganoider og organotypic kulturer beskrevet11. I denne metoden komprimeres organoider og embryonale organer forsiktig mellom en glasscoverslip og en gjennomtrengelig membran av en transwell-innsats i en spesialdesignet plate til tykkelsen på prøven når 70 μm, noe som gir optimale optiske forhold for bildebehandling. I den andre delen av metodene er en detaljert protokoll for fabrikasjon av en spesialdesignet plate og oppsett av FiZD-eksperimenter for langsiktig organoid avbildning beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrepleie og prosedyrer var i samsvar med finsk nasjonal lovgivning for bruk av laboratoriedyr, Den europeiske konvensjon om beskyttelse av virveldyr dyr som brukes til eksperimentelle og andre vitenskapelige formål (ETS 123), og EU-direktiv86/609/EØF.
1. Fabrikasjon av minireservoarer for dyrking av mus embryonale nyrer og nyreorganoider på kylling CAM og sette opp xenotransplantering eksperimenter
- Bruk transwell celle kultur innsatser designet for 6 brønn eller 12 brønnplater.
MERK: Avhengig av det spesielle eksperimentet kan store eller små minireservoarer brukes. Det er best å bruke små minireservoarer for xenografting opptil åtte embryonale nyrer eller når flere minireservoarer vil bli plassert på samme kylling embryo (f.eks eksperimenterog kontroll prøver på samme kylling CAM). - Klipp ned sidene av innsatsene ved hjelp av en roterende multiverktøy med et sirkelsagblad eller en håndsag for å skape en 2 mm høy plastring med en gjennomtrengelig membran festet til den.
- Poler kantene på disse minireservoarene med skalpell eller en skarp kniv.
- Steriliser minireservoarene i 70% etanol i minst 1 t.
- Vask minireservoarene i autoklet dobbeltdestillert vann og la dem tørke i en lamitarhette.
- Skyll minireservoarene i PBS og kulturmedium (høyglukose DMEM/10 % FBS/1 % penicillin-streptomycin).
- Plasser reservoaret i en petriskål, på toppen av en dråpe (600 μL/400 μL) av kulturmedium med membranen vendt opp.
- Ordne dissekert ex vivo embryonale nyrer eller nyreorganoider jevnt på membranen ved hjelp av en pipette eller et glasskapillærrør. Unngå å forlate mye væske rundt nyrene.
- La prøvene feste seg til membranen i 2–24 timer i en cellekulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
MERK: Opptil åtte E11.5 embryonale musnyrer eller nyreorganoider kan ordnes på den lille innsatsen. Den store innsatsen anbefales hvis enten større biter av embryonalt vil bli brukt til xenotransplant eller en cellehydrogelblanding på et større område av CAM. - Ta 8-dagers gamle ex ovo kultiverte embryonale kyllinger tilberedt i henhold til tidligere publiserte metoder ut av cellekulturinkubatoren12,13.
- Overfør minireservoarene til CAM slik at transplantatene vender mot CAM, og membranen overlegger dem. Plasser minireservoarene i periferien av CAM, slik at de ikke dekker kyllingembryoet.
MERK: Ved bruk av de mindre minireservoarene som er fabrikkert fra transwell-innsatser for 12 brønnplater, kan opptil tre minireservoarer plasseres på ett CAM. - Tilsett 500 μL (6 brønninnsats) eller 300 μL (12 brønninnsats) av kulturmedium til minireservoarene.
- Dyrke prøvene på kylling CAM i maksimalt 9 dager. Bytt ut kulturmediet i minireservoarene daglig.
MERK: Vasking av prøvene kan observeres så snart som 24–48 timer etter transplantasjon.
2. Fabrikasjon av spesialdesignede plater og oppsett av FiZD-kulturer
- Bor 20 mm diameter hull i bunnen av en 6 brønnplate.
MERK: For FiZD-eksperimenter bruker du 6 brønnplater med en brønndybde på 16 mm (spesifisert i materialtabellen). - Poler felgene på hullene (spesielt på oversiden) ved hjelp av en elektrisk drill med en motvask borkrone, en skalpell, eller en skarp kniv.
- Steriliser platene i 70% etanol i minst 1 t.
- Vask platene i autoklet dobbeltdestillert vann og la dem tørke under sterile forhold.
- Vask 22 mm x 22 mm glassdekselslips grundig med 70 % etanol eller rengjør dem i henhold til den publiserte protokollen fra Saarela et al.11.
- Lim dekkleppene til oversiden av hullene i 6 brønnplater ved hjelp av et giftfritt vevlim. Påfør lim rundt hullet og plasser forsiktig dekselet slip for å dekke den. La limet tørke.
- Inspiser platene under et stereomikroskop og fjern overflødig tørket lim fra overflaten av dekkslips om nødvendig.
MERK: Kontroller at det ikke er lim over dekkseddelen for å sikre jevn komprimering av prøvene. - Bland polystyrenperler (70 μm partikkelstørrelse) med et likt volum hydrogel. Et volum på 50–100 μL per brønn er tilstrekkelig.
MERK: Hold blandingen av hydrogel og polystyrenperler på is. - Plasser en transwell innsats under et dissekerende mikroskop med membranen opp.
- Ordne prøvene (f.eks vivo embryonale nyrer eller nyreorganoider) jevnt på membranen.
- Tilsett hydrogel/polystyrenperleblandingen ved siden av prøvene nøye for å unngå skade på skjøre vev.
- Vend transwell innsatsen slik at membranen med prøvene montert på den vender ned.
- Plasser innsatsen forsiktig i en brønn på den modifiserte 6 brønnplaten og trykk den forsiktig ned slik at prøvene komprimeres til nivået på perlene.
MERK: Følg fremdriften av kompresjonen ved hjelp av et mikroskop. - Hold innsatsen litt presset til brønnen med den ene hånden og fest den til platen ved å smelte plast med loddejern på tre punkter i periferien av innsatsen.
- Når innsatsen er festet til platen, tilsett 2 ml kulturmedium (DMEM/10% FBS/1% penicillin-streptomycin) til brønnen og fortsett å montere de resterende brønnene i platen på samme måte.
- Overfør den ferdige platen til en inkubator på scenen av et invertert mikroskop for tidsforløpsavbildning.
- Utfør tidsforløpsavbildning av prøvene ved hjelp av passende eksperimentelle innstillinger.
MERK: Det er ikke nødvendig å endre kulturmediet i platens brønner under tidsforløpsforsøk, men kan enkelt gjøres gjennom hullene på sidene av innsatsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CAM kultur protokollen presentert her aktivert svært effektiv vaskularisering av nyreorganoider og embryonale nyrer som følge av xenotransplantasjon på kylling CAM (Figur 1, Movie 1). Minireservoarer som inneholder kulturmedium leverte næringsstoffer til donorvev og beskyttet det mot tørking i tidsperioden før riktig vaskularisering. Denne metoden ga tillatte forhold for donor-avledede endotelceller å vokse. Derfor var nyrevaskulatur i transplanterte nyrer og organoider representert for det meste, men ikke utelukkende, av donorspesifikke celler (Figur 2B,C,F). Mer moden glomerulær vaskulatur ble oppnådd i nyrer og nyreorganoider transplantert til CAM enn i nyre organotypic kulturer (Figur 2D,E).
FiZD-protokollen er en metode designet for langsiktig tidsforløpavbildning av ex vivo embryonale nyrer og nyreorganoider ved hjelp av høyoppløsnings konfokal mikroskopi. I den klassiske organotypic kultur protokollen designet av Trowell14, en prøve er plassert på et porøs filter, støttet av et metallgitter, og holdes på luft-væske grensesnitt (Figur 3A). Denne metoden er ikke optimal verken for en oppreist eller invertert type mikroskop. Metoden som presenteres her var spesielt designet for å fungere med et omvendt mikroskop for bildebehandling. Prøven ble immobilisert mellom en glassdekselslip nedenfra og en porøs membran av transwell innsats (se ovenfor) (Figur 3B). Den optimale avstanden mellom membranen og dekkslip var ~ 70 μm. Polystyren perler ble brukt som avstandsglass for å sette tykkelsen på prøven i dette området (Figur 3B).
Det er ingen kommersielt tilgjengelige 6 brønnplater hvor glassdekselet ligger på den øvre overflaten av brønnen. Derfor ble det utviklet en protokoll for fabrikasjon av spesialdesignede plater som har denne funksjonen (Figur 3B). Figur 4 viser den representative morfologien til en embryonisk nyrekultur (Figur 4A,D–F) og nyreorganoider (Figur 4B,C). Film 2 representerer resultatene av høyoppløsnings tidsforløpavbildning av endotelceller i musembryonal nyre dyrket i et FiZD-oppsett. Det høyre panelet i movie 2 viser at både distribusjon og overføring av individuelle celler kan observeres ved hjelp av denne metoden.
Figur 1: Murine embryonal nyre xenotransplantert til kylling embryo CAM. Xenotransplantasjon av E11.5 embryonale mus nyrer i 8-dagers ex ovo kylling embryo; en murine embryonal nyre ble dyrket i 7 dager på CAM. Skala bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Film 1: Blodstrømmen i murine embryonal nyre etter xenotransplantasjon til kylling embryo CAM. En murine E11.5 embryonal nyre ble xenotransplantert til CAM av en 8-dagers gammel kylling embryo og dyrket i 7 dager. Filmen viser kylling blodstrøm i xenograft på dag 7. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Figur 2: Murine embryonal nyre xenotransplantasjon på kylling embryo CAM. Murine E11.5 embryonale nyrer (m) ble dyrket som en organotypic kultur (dvs. kontroll) eller xenotransplantert til en 8-dagers-gammel embryonisk kylling CAM (c) (dvs. eksperiment). Etter 5 dager med embryonisk nyredyrking ble kontroll- og eksperimentelle prøver festet og farget for endotelmarkøren CD31 (rød) (A–E) og kjerner (Hoechst; blå) (D, E). (C) Anastomoses mellom kylling og mus blodkar (pilspisser). -DJeg har ikke noe åsi. En enkelt konfokal skive fra midten av nephron er vist. (F) Xenotransplantasjon av murine E11.5 embryonalnyre til transgen GFP-kylling CAM i 7 dager, farget for CD-31 (rød). Skala barer = A-B 100 μm; C-E 20 μm; F 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fast Z-retning kulturmetode. (A) Tradisjonell kulturmetode hvor prøven vokser på en porøs membran som støttes av et rutenett og holder utplanten ved luftvæskegrensesnittet. (B) I det nye FiZD-oppsettet ble prøven forsiktig komprimert mellom glassdekselet og en transwell porøs membran. Polyesterperler kontrollerte tykkelsen på prøven justert i z-retning. Dette tallet ble endret fra Saarela et al.11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Embryonale nyrer og nyreorganoidutvikling i den nye FiZD-kulturmetoden. Embryonale nyrer (A, D–F) og nyreorganoider (B–C) ble dyrket ved hjelp av det nye FiZD-oppsettet. (A) Brightfield bilde av en intakt embryonisk mus nyre på dag 7 av FiZD kultur. (B) Brightfield bilde av en mus nyre organoid på dag 7 av FiZD kultur. (C) MtmG (rød) mus nyre organoid ble dyrket i 4 dager ved hjelp av den nye FiZD oppsett. Øyeblikksbilde av bildestakken for tidsforløp viser Wnt4Cre-aktivertGFP --aktivert e-post (grønn) uttrykk i de utviklende nephronene. (D) Mus embryonale nyre ble dyrket i 7 dager ved hjelp av den nye FiZD oppsett. Seks2 (grønn) og Troma-1 (Krt8, rød) farging viste nephron forløpere og ureterbud (UB) bifurcations, henholdsvis. (E) Mus embryonale nyre rudiment ble dyrket i 12 dager ved hjelp av den nye FiZD oppsett. Den var farget med Troma-1 (rød) og Nephrin (grønn), og viste UB bifurcations og podocytes, henholdsvis. (F) Den samme prøven som i (E) med høyeffekts forstørrelse av Troma-1+ (rød) UB og Nephrin (grønn) + podocytes. Dette tallet ble endret fra Saarela et al.11. Skala barer = A-D, F 100 μm; E 1000 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Film 2: Nyreendotelceller merket med GFP vokser i det nye FiZD-oppsettet og kan observeres med høyoppløselig konfokal mikroskopi. Embryonale nyrer fra E11,5 mTmG; Tie1Cre mus ble dissekert og vokst 6 dager ved hjelp av det nye FiZD-oppsettet. Filmen viser Tie1Cre-indusert GFP uttrykk i endotelceller. En stabel med 20 z-lag ble tatt med en 10x/0.45 mål, med bilder innhentet hver 15 min. I filmen slås fem GFP z-lag og ett lyst feltbrennvidde sammen. Panelet til høyre viser et nærbilde av en utviklende nyre. Endotelceller som migrerer inn i vaskulær kløft av S-form stadium nefrroner kan sees. I panelet til høyre slås GFP z-lag og ett lyst feltbrennplan sammen. De raskt bevegelige cellene er sannsynligvis makrofager15. GFP-signal ble også uttrykt av noen blodceller. Voxel størrelse 0,69 μm x 0,69 μm x 4,13 μm. Denne filmen er endret fra Saarela et al.11. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
To detaljerte protokoller presenteres som avgrense den klassiske renal organotypic kultur metoden, og aktivere vaskularisering, utvidet utvikling, og optimal 4D (dvs. 3D bilde og tid) avbildning av ex vivo embryonale nyrer og organoider. Denne delen fremhever de kritiske trinnene i metodene og diskuterer feilsøking.
Den betydelige forskjellen mellom andre CAM kulturmetoder og denne forbedrede kylling CAM kultur metoden er bruk av skreddersydde minireservoarer i xenografting av embryonale nyrer og nyre organoider til CAM. Membranbunnen av den modifiserte transwell innsatsen presser prøvene mot kylling CAM og holder dem på plass. Sidene av innsatsen fungerer som et reservoar for kulturmedium som beskytter transplantatet mot tørking. Xenografting til ex ovo kultivert embryonalkylling CAM anbefales sterkt, da denne metoden eksponerer et større område av CAM hvor minireservoaret kan plasseres og gjør det enkelt å visuelt følge vasken prosessen12,13.
En ulempe med kylling CAM kultur metoden er at tidsvinduet for å utføre xenotransplantasjon er begrenset til 8-9 dager når CAM av kylling embryo funksjoner før den begynner nedverdigende. Grafts som trenger lengre tid til å utvikle bør derfor bli vascularized ved xenotransplantasjon til et annet vev (f.eks mus nyre kapsel)6. Seriell xenotransplantasjon av donorvev kan være en løsning på dette lange inkubasjonstidsproblemet. Metoden kan tilpasses for tidsforløpsavbildning av vaskularisering og utvikling av transplantatet, men først må kravet om stabilisering av minireservoaret og CAM for langsiktig bildebehandling tas opp. Den største fordelen med denne forbedrede nyre xenotransplantering protokollen til kylling CAM er at metoden gir betingelser for donor-avledet endotelceller å trives.
FiZD-protokollen beskriver en metode designet for langvarig tidsforløpavbildning av ex vivo embryonale nyrer og nyreorganoider ved hjelp av høyoppløsnings konfokal mikroskopi. For oppsettet er det avgjørende at dimensjonene på brønnen og sett inn samsvar. Når en dekkslip limes til bunnen av en 6 brønnplate og innsatsen er plassert på brønnen, skal membranen på innsatsen berøre glasset. Deretter, når kulturen er satt opp, vil avstandsperlene bestemme membranens posisjon og dermed tykkelsen på det kultiverte organet eller organoid. Av denne grunn er det viktig å fjerne overflødig lim og kontrollere at ingen materiale begrenser innsatsen fra å berøre dekselet glass. Det er også viktig å bruke giftfritt vevlim for å feste dekkglasset. Vær oppmerksom på at limet ikke festes veldig sterkt, så det er viktig å håndtere platene nøye. Platene kan brukes på nytt, og hvis dekkglasset løsner under vasketrinn, kan det limes på igjen.
FiZD-bildemetoden tillater studie av nefrogenese på et encellede nivå. Den høye kvaliteten på høyoppløselige tidsforløpsbilder gjør det mulig å bruke automatisert cellesegmentering for å studere cellulær atferd i nyreorganoider og nyrekulturer. Flere prøver i forskjellige brønner av en 6 brønnplate kan studeres samtidig under ulike kulturforhold. Teknikken kan lett endres for forskjellige størrelser og typer vev og organoider ved å endre størrelsen på avstandsperlene; dette ble demonstrert med ovariecellekulturer14. Som en ytterligere optimalisering av denne metoden, kombinere FiZD oppsettet med nylig publiserte mikrofluidiske tilnærminger16 kan være svært gunstig for høyoppløselig mikroskopisk analyse av cellulær morfogenese på senere stadier av nyreutvikling.
En fordel med FiZD-metoden er at det er rikelig med kulturmedium tilgjengelig, og det er ikke nødvendig å endre det i løpet av 1 uke med bildebehandling. Likevel, hvis en medieendring er nødvendig, kan mediet enkelt endres fra en åpning i veggen av innsatsen. FiZD-metoden er også bedre enn andre organkulturmetoder ved at den bringer prøven nærmere mikroskopmålet. I andre mye brukte kulturmetoder er det en membran eller filter og en glassplatebunn mellom den avbildede prøven og målet, og forbyr nøyaktig høyoppløselig bildebehandling17. Med FiZD-metoden er det mulig å skaffe høyoppløselige bilder av levende vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet økonomisk av Suomen Akatemia (Academy of Finland) (206038, 121647, 250900, 260056; Senter for fremragende forskning 2012-2017 251314), Munuaissäätiö - Finsk nyre- og leverforening, Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, Den svenske kulturstiftelsen i Finland, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Kreftforeningen i Finland), Det europeiske fellesskaps syvende rammeprogram (FP7/2007-2013; gi FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) og H2020 Marie Sklodowska-Curie Actions Innovative Training Network "RENALTRACT" Project ID 642937. Forfatterne takker Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias og Hannele Härkman for teknisk assistanse.
Figur 3, 4 og Film 2 er gjengitt med tillatelse fra Utvikling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).
- Saxen, L. Organogenesis of the Kidney. 1st ed. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 536 (7615), 238 (2016).
- Halt, K. J., et al. CD146+ cells are essential for kidney vasculature development. Kidney International. 90, 311-324 (2016).
- van den Berg, C. W., et al. Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane. Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).
- Sariola, H. Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli. Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).
- Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. The origin of the glomerular endothelium. Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).
- Short, K. M., et al. Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney. Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).
- Saarela, U., et al. Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging. Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. 44, e2154 (2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
- Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract. Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).
- Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice. Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
