Summary
Эта работа описывает два метода для изучения развития органов, улучшенная установка ксенотрансплантации на хориоаллантоической мембране (CAM) из птичьих эмбрионов, что позволяет васкуляризировать культивированные эмбриональные органы и органоиды и новый фиксированный z-направление метод культуры органов с измененными экспериментальными условиями, который позволяет с высоким разрешением замедленной конфокальной визуализации.
Abstract
Эмбриональные почечные органотипические культуры, и особенно плюрипотентные органоиды почек, полученные из стволовых клеток, являются отличными инструментами для следующих процессов развития и моделирования заболеваний почек. Однако модели ограничены отсутствием васкуляризации и функциональности. Для решения этой проблемы был разработан усовершенствованный протокол для метода ксенотрансплантации клеток и тканей к хориоаллантоической мембране (CAM) птичьего эмбриона для получения васкуляризации и восстановления кровотока. Прививки накладываются на заказ мини-водохранилища, которые фиксируют образцы CAM и поставляют их с культурой среды, которая защищает трансплантаты от сушки. Улучшенный метод культуры позволяет ксенотрансвтатам расти до 9 дней. В рукописи также описывается, как обеспечить оптимальные условия для долгосрочной конфокальной визуализации почечных органоидов и органотипических культур с использованием ранее опубликованного метода Fixed -Direction (ФИЗД). Этот метод мягко сжимает эмбриональный орган или органоид между стеклянным крышкой и мембраной в большом количестве среды и обеспечивает отличные условия для визуализации на срок до 12 дней. Вместе эти методы позволяют васкуляризации и приток крови к почечной органоидов и органотипических культур почек с улучшенной конфокальной визуализации. Описанные здесь методы очень полезны для изучения фундаментальных и прикладных функций почек ex vivo. Оба метода применимы к различным типам тканей и органоидов.
Introduction
Органотипическая культура эмбриональных почек стала важной моделью для изучения нефрогенеза десятилетия назад1,,2,,3. Почечные органоиды представляют собой передовую модельсистему для изучения развития здоровых и больных почек4. Основным недостатком обоих методов, однако, является то, что ни один метод не переоценивает основную функцию почек: фильтрацию крови. Нефроны и почечные сосуды развиваются в почечных органоидах и органотипических культурах подобно ранней стадии развития виво; однако, glomeruli формируется в пробирке остаются сосудистые5. Васкуляризация эмбриональных почек ex vivo и почечных органоидов ранее была продемонстрирована в экспериментах по трансплантации только в условиях in vivo. Например, трансплантация плюрипотентных стволовых клеток человека полученных почечных органоидов под капсулой мышиной почки позволяет развитие нефронов в органоидов к функциональной стадии6.
Промежуточный подход между чисто культурами in vitro и методами трансплантации in vivo – это ксенотрансплантация к CAM птичьих эмбрионов. Васкуляризация нетронутой мышиной почки примордии была продемонстрирована ранее с помощью этой системы7,,8. Тем не менее, было также показано, что почечные сосуды в ксенотрансплантации морин почки был получен из принимающей эндотелия, а не трансплантат9. Это наблюдение значительно снизило потенциал химерных (авиано-млекопитающих) моделей эмбриональных почек для изучения развития почечной сосуды, поскольку экспериментальные условия были недопустимыми для выживания эндотелиальных клеток, полученных донорами.
В первой части этого протокола представлен усовершенствованный метод выращивания эмбриональных почек мыши на CAM из птичьих яиц, сочетающий микроэкологические условия орханотипической культуры и ксенотрансплантации. Основное улучшение по сравнению с предыдущими методами заключается в том, что вместо размещения мыши эмбриональных почек и почечных органоидов непосредственно на CAM, область имплантации накладывается проницаемыми минивоилидами, заполненными культурой среды, которые поставляют пересаженную ткань с питательными веществами и защитить его от высыхания. Успешность экспериментов значительно возрастает, а условия для развития сосуд, полученных донорами, улучшаются. Применение этого метода ксенотрансплантационным культурам приводит к развитию гломерулярной сосуды, состоящей из эндогенных эндотелиальных клеток донорских почек.
Детальный анализ клеточного морфогенеза является еще одним важным применением моделей культуры почек. Ранее сообщенные методы замедленного получения изображений культур почек достаточны только для анализа общей морфологии и узорства эмбриональных почек, но не для отслеживания отдельных клеток10. Недавно былописанновый метод Fixed-Direction (ФИЗД), направленный на высокое разрешение конфокальной 3D-замедленной визуализации почечных органоидов и органотипических культур. В этом методе органоиды и эмбриональные органы аккуратно сжимаются между стеклянным покрытием и проницаемой мембраной вставки трансвелл в специально разработанной пластине до тех пор, пока толщина образца не достигнет 70 мкм, обеспечивая оптимальные оптические условия для визуализации. Во второй части методов описан подробный протокол для изготовления специально разработанной пластины и настройки экспериментов по физподготовке для долгосрочного органоидного изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход за животными и процедуры соответствовали финскому национальному законодательству об использовании лабораторных животных, Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (ETS 123), и Директивы ЕС 86/609/EEC.
1. Изготовление минивоилидляций для выращивания эмбриональных почек мыши и почечных органоидов на курином CAM и создание экспериментов по ксенотрансплантации
- Используйте вставки культуры клеток Transwell, предназначенные для 6 скважин или 12 колодцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от конкретного эксперимента можно использовать большие или малые минивоили. Лучше всего использовать небольшие минивомеры для ксенотрансплантации до восьми эмбриональных почек или когда несколько минивоберных будет помещено на тот же куриный эмбрион (например, экспериментируйте и контролируют образцы на том же курином CAM). - Урежьте стороны вставок с помощью роторного мультиинструмента с круговым лезвием пилы или ручной пилой, чтобы создать пластиковое кольцо высотой 2 мм с прилагаемой к нему проницаемой мембраной.
- Польский края этих минивоили скальпелем или острым ножом.
- Стерилизовать минивоидоки в 70% этанола, по крайней мере 1 ч.
- Вымойте минивоили в автоклавированной двойной дистиллированной воде и дайте им высохнуть в ламинарном капюшоне.
- Промыть минивоили в PBS и культуры среды (высокоглюкозный DMEM/10% FBS/1% пенициллин-стрептомицин).
- Поместите резервуар в чашку Петри, на вершине капли (600 л/400 л) культуры среды с мембраной вверх.
- Равномерно расположите всхождные эмбриональные почки ex vivo или почечные органоиды на мембране с помощью пипетки или стеклянной капиллярной трубки. Не оставляйте много жидкости вокруг почек.
- Пусть образцы прикрепляются к мембране для 2-24 ч в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: До восьми E11.5 эмбриональных почек мыши или почек органоидов могут быть расположены на небольшой вставке. Большая вставка рекомендуется, если либо большие куски эмбриональной ткани будут использоваться для ксенотрансплантации или клеточной гидрогеля смеси на большей площади CAM. - Возьмите 8-дневный ex ovo культивированных эмбриональных кур, подготовленных в соответствии с ранее опубликованными методами из инкубатора клеточной культуры12,13.
- Передача минивоиликов в CAM так, что трансплантаты сталкиваются CAM, и мембрана накладывает их. Поместите минивоили на периферию CAM, чтобы они не покрывали куриный эмбрион.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании небольших минивоиливодов, изготовленных из вставок Transwell для 12 скважин ных пластин, до трех минивоберных вод можно разместить на одном CAM. - Добавьте 500 кЛ (6 хорошо вставить) или 300 кЛ (12 хорошо вставить) культуры среды для мини-водохранилища.
- Культивировать образцы на куриный CAM в течение максимум 9 дней. Заменить среду культуры в минивоили ежедневно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Васкуляризация образцов может наблюдаться, как только 24-48 ч после трансплантации.
2. Изготовление специально разработанных пластин и создание культур ФИЗД
- Просверлите отверстия диаметром 20 мм в нижней части 6 скважины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов с ФИЗД используйте 6 пластин скважин с глубиной 16 мм (указано в таблице материалов). - Польский ободки отверстий (особенно на верхней стороне) с помощью электрического сверла с контрсверлом бит, скальпель, или острый нож.
- Стерилизовать пластины в 70% этанола, по крайней мере 1 ч.
- Вымойте пластины в автоматической двойной дистиллированной воды и дайте им высохнуть в стерильных условиях.
- Тщательно мыть 22 мм х 22 мм стекла охватывает с 70% этанола или очистить их в соответствии с опубликованным протоколом Saarela et al.11.
- Клей крышкискользит к верхней стороне отверстия в 6 хорошо пластин с помощью нетоксичные ткани клея. Нанесите клей вокруг отверстия и аккуратно поместите крышку, чтобы покрыть его. Дайте клею высохнуть.
- Осмотрите пластины под стереомикроскопом и удалите избыток сушеного клея с поверхности покрывал, если это необходимо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что нет никакого клея над крышкой, чтобы обеспечить даже сжатие образцов. - Смешайте полистирол-бусин (размер частиц 70 мкм) с равным объемом гидрогеля. Достаточно объема 50-100 л на скважину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите смесь гидрогеля и полистирола шарики на льду. - Поместите трансвелл вставить под рассекающий микроскоп с мембраной вверх.
- Равномерно расположите образцы (например, эмбриональные почки ex vivo или почечные органоиды) равномерно.
- Добавить смесь гидрогеля / полистирола рядом с образцами тщательно, чтобы избежать повреждения хрупких тканей.
- Переверните вставку Transwell так, чтобы мембрана с собранными на ней образцами оказалась вниз.
- Аккуратно поместите вставку в колодец из модифицированной 6 хорошо пластины и аккуратно нажмите его вниз, чтобы образцы сжаты до уровня бисера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за ходом сжатия с помощью микроскопа. - Держите вставку слегка прижатой к колодцу одной рукой и зафиксировать ее к пластине, плавя пластик с паяльником в трех точках на периферии вставки.
- Когда вставка крепится к пластине, добавьте 2 мл культуры среды (DMEM/10% FBS/1% пенициллин-стрептомицин) в колодец и продолжить сборку оставшихся скважин в пластине таким же образом.
- Перенос готовой пластины в инкубатор на сцене перевернутого микроскопа для визуализации замедленного действия.
- Выполняйте замедленное изображение образцов с использованием соответствующих экспериментальных настроек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение культуры среды в колодцах пластины во время замедленного экспериментов не требуется, но может быть легко сделано через отверстия по бокам вставки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленный здесь протокол культуры CAM позволил высокоэффективной васкуляризации почечных органоидов и эмбриональных почек в результате ксенотрансплантации на курином CAM(рисунок 1, Фильм 1). Минивоили, содержащие культурную среду, поставляли питательные вещества в донорскую ткань и защищали их от высыхания в период, предшествующий надлежащей васкуляризации. Этот метод обеспечил разрешительные условия для роста эндотелиальных клеток, полученных донорами. Таким образом, почечные сосуды в пересаженных почках и органоидах были представлены в основном, хотя и не исключительно, донорскими клетками(рисунок 2B,C,F). Более зрелые гломерулярные сосуды были получены в почках и почечных органоидов, пересаженных в CAM, чем в почечных органотипических культур(Рисунок 2D,E).
ФИЗД-протокол является методом, предназначенным для долгосрочного замедленного изображения эмбриональных почек и почечных органоидов с высоким разрешением конфокальной микроскопии. В классическом протоколе органотипической культуры, разработанном Trowell14,образец помещается на пористый фильтр, поддерживаемый металлической сеткой, и хранится в воздушно-жидком интерфейсе(рисунок 3A). Этот метод не является оптимальным ни для вертикального, ни для перевернутого типа микроскопа. Представленный здесь метод был специально разработан для работы с перевернутым микроскопом для визуализации. Образец был обездвижен между стеклянным крышкой снизу и пористой мембраной вставки Transwell (см. выше)(рисунок 3B). Оптимальное расстояние между мембраной и крышкой составляло 70 мкм. Полистироновые шарики использовались в качестве прокладок для определения толщины образца в этом диапазоне(рисунок 3B).
На верхней поверхности скважины нет коммерчески доступных 6 колодцев. Таким образом, был разработан протокол для изготовления специально разработанных пластин, которые имеют эту функцию(рисунок 3B). На рисунке 4 показана репрезентативная морфология эмбриональной культуры почек(рисунок 4A,D-F) и почечных органоидов(рисунок 4B,C). Фильм 2 представляет собой результаты высокой разрешения замедленной визуализации эндотелиальных клеток в эмбриональной почки мыши, культивированной в установке ФИЗД. Правильная панель в фильме 2 показывает, что с помощью этого метода можно наблюдать как распределение, так и миграцию отдельных ячеек.
Рисунок 1: Murine эмбриональной почки xenoтрансната в куриный эмбрион CAM. Ксенотрансплантация e11.5 эмбриональных почек мыши в 8-дневный бывший быва куриный эмбрион; морин эмбриональной почки культивировался в течение 7 дней на CAM. Шкала бар 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Фильм 1: Кровоток в морин эмбриональной почки после ксенотрансплантации в куриный эмбрион CAM. Эмбриональная почка E11.5 была ксенотранспланирована в CAM 8-дневного куриного эмбриона и культивируется в течение 7 дней. Фильм показывает поток крови курицы в ксенотрансплантат на 7-й день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Рисунок 2: Murine эмбриональной ксенотрансплантации почек на куриный эмбрион CAM. Murine E11.5 эмбриональных почек (м) культивировались как органотипическая культура (т.е. контроль) или ксенотранспланировали 8-дневной эмбриональной курицы CAM (c) (т.е. эксперимент). После 5 дней эмбрионального культивирования почек, контрольные и экспериментальные образцы были зафиксированы и окрашены для эндотелиального маркера CD31 (красный)(A-E) и ядер (Hoechst; синий) (D, E). (C) Анастомозы между сосудами крови курицы и мыши (наконечники стрел). (D,E) Один конфокальный ломтик от середины нефрона показано. (F) Ксенотрансплантация морин E11.5 эмбриональной почки трансгенных GFP-курица CAM в течение 7 дней, окрашенные для CD-31 (красный). Шкала баров - A-B 100 мкм; C-E 20 мкм; F 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Фиксированный метод культуры на режиссуре. (A)Традиционный метод культуры, где образец растет на пористой мембране, поддерживаемой сеткой и удерживающей эксплант на воздушно-жидком интерфейсе. (B) В новой установке ФИЗД, образец был аккуратно сжат между стеклянным покрытием и пористой мембраной Transwell. Посослы контролировали толщину образца, скорректированного в z-направлении. Эта цифра была изменена с Saarela et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Эмбриональные почки и органоидное развитие почек в новом методе культуры ФИЗД. Эмбриональные почки(A, D-F) и органоиды почек(B-C) были культивированы с помощью новой установки ФИЗД. (A) Брайтфилд изображение нетронутой эмбриональной мышиной почки на 7-й день культуры ФИЗД. (B) Брайтфилд изображение мыши почки органоида на 7-й день культуры ФИЗД. (C) Органоид почки мыши MtmG (красный) был культивирован в течение 4 дней с помощью новой установки ФИЗД. Снимок стека изображений замедленного времени показывает gFP -активированное Выражение Wnt4Cre(зеленый) в развивающихся нефронах. (D) Мышь эмбриональной почки культивировалась в течение 7 дней с помощью новой установки ФИЗД. Шесть2 (зеленый) и Трома-1 (Krt8, красный) окрашивание показали нефрон предшественников и уретерики бутон (UB) бифуркации, соответственно. (E) Мышь эмбрионального зачатка почек была культивирована в течение 12 дней с помощью новой установки ФИЗД. Он был окрашен тромом-1 (красный) и Нефрин (зеленый), и показал UB бифуркации и podocytes, соответственно. (F) Тот же образец, что и в (E) с высокой мощностью увеличения Трома-1 "(красный) UB и Нефрин (зеленый) и podocytes. Эта цифра была изменена с Saarela et al.11. Шкала баров -D, F 100 мкм; E 1000 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Фильм 2: Почечные эндотелиальные клетки, помеченные GFP, растут в новой установке ФИЗД и могут наблюдаться с помощью конфокальной микроскопии с высоким разрешением. Эмбриональные почки от E11.5 mTmG; Мыши Tie1Cre были вскрыты и выросли 6 дней с помощью новой установки ФИЗД. Фильм показывает Tie1Cre-индуцированной GFP выражение в эндотелиальных клеток. Tie1Cre Стек из 20 z-слоев был сделан с использованием цели 10x/0.45, с изображениями, полученными каждые 15 минут. В фильме сливаются пять GFP z-слоев и один яркий фокусный фокусный фокус. Панель справа показывает крупным планом развивающуюся почку. Можно увидеть эндотелиальные клетки, мигрирующие в сосудистую расщелину S-образных сценических нефронов. В панели справа сливаются GFP z-слой и одна яркая полевая фокусная плоскость. Быстро движущихся клеток, вероятно, макрофаги15. Сигнал GFP был также выражен некоторыми клетками крови. Размер Voxel 0,69 мкм х 0,69 мкм x 4,13 мкм. Этот фильм был изменен из Saarela и др.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представлены два подробных протокола, которые усовершенствуют классический метод почечной арганотипической культуры и позволяют васкуляризировать, расширенное развитие и оптимальное 4D-изображение и время изображения эмбриональных почек и органоидов. В этом разделе освещаются критические шаги в методах и обсуждаются устранение неполадок.
Существенное различие между другими методами CAM культуры и этот улучшенный метод культуры куриного CAM является использование пользовательских минивоилив в ксенотрансплантации эмбриональных почек и органов почек к CAM. Мембранное дно модифицированной вставки Transwell прижимает образцы против цыпленка CAM и держит их в месте. Стороны вставки служат резервуаром для культуры среды, которая защищает трансплантат от сушки. Xenografting к ex ovo культивированный эмбриональный cam настоятельно рекомендуется, так как этот метод предоставляет большую площадь CAM, где мини-водохранилище может быть помещен и позволяет легко визуально следить за процессом васкуляризации12,13.
Недостатком куриного метода cam культуры является то, что временное окно для выполнения ксенотрансплантации ограничивается 8-9 дней, когда CAM куриного эмбриона функции, прежде чем он начинает деградации. Поэтому прививки, нуждающиеся в более длительном времени для развития, должны быть васкуляризованы путем ксенотрансплантации в другую ткань (например, капсулу мышиной почки)6. Серийная ксенотрансплантация донорской ткани может быть решением этой долгой проблемы инкубационного времени. Этот метод можно было бы адаптировать для замедленной визуализации васкуляризации и развития трансплантата, но сначала необходимо решить проблему требования к стабилизации минивообразного и CAM для долгосрочной визуализации. Основным преимуществом этого улучшенного протокола почечной ксенотрансплантации для куриного CAM является то, что метод обеспечивает условия для донорских эндотелиальных клеток, чтобы процветать.
В физпротоколе физиограф описывается метод, предназначенный для долгосрочной замедленной визуализации эмбриональных почек и почечных органоидов с высоким разрешением. Для установки очень важно, чтобы размеры скважины и вставить совпадают. Когда крышка приклеивается к нижней части 6 хорошо пластины и вставка помещается на хорошо, мембрана вставки должны коснуться стекла. Затем, когда культура настроена, бусы-прокладки определят положение мембраны и, следовательно, толщину культивированных органов или органоидов. По этой причине, очень важно, чтобы удалить избыток клея и проверить, что ни один материал не ограничивает вставку от прикосновения крышки стекла. Важно также использовать нетоксичный клей ткани, чтобы прикрепить крышку стекла. Обратите внимание, что клей не прикрепляется очень сильно, поэтому очень важно тщательно обращаться с пластинами. Пластины могут быть использованы повторно, и если крышка стекла отделяется во время стирки шаги, он может быть приклеен обратно.
Метод визуализации ФИЗД позволяет изучать нефрогенез на одноклеточном уровне. Высокое качество изображений с высоким разрешением позволяет применять автоматизированную сегментацию клеток для изучения клеточного поведения в почечных органоидах и культурах почек. Несколько образцов, расположенных в разных колодцах 6 скважинной пластины, могут быть изучены одновременно в различных условиях культуры. Техника может быть легко изменена для различных размеров и типов тканей и органоидов, изменив размер бусинок прокладки; это было продемонстрировано с культурами клетки яичников14. В качестве дальнейшей оптимизации этого метода, сочетание установки ФИЗД с недавно опубликованными микрофлюидными подходами16 может быть весьма полезным для микроскопического анализа клеточного морфогенеза с высоким разрешением на более поздних стадиях развития почек.
Одним из преимуществ метода ФИЗД является то, что существует множество культуры среды доступны и не нужно менять его в течение 1 недели изображения. Тем не менее, если требуется изменение мультимедиа, среда может быть легко изменена с отверстия в стене вставки. Метод ФИЗД также превосходит другие методы культуры органов в том, что он приближает образец к цели микроскопа. В других широко используемых методах культуры есть мембрана или фильтр и дно стеклянной пластины между изображенным образцом и целью, запрещающей точное изображение высокого разрешения17. С помощью метода ФИЗД можно получить изображения живых тканей с высоким разрешением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана финансово Suomen Akatemia (Академия Финляндии) (206038, 121647, 250900, 260056; Грант Центра Передового Опыта 2012-2017 251314), Мунуаиссютич - Финская ассоциация почек и печени, Сигрид Джуселиуксен Сютио, Викториастифтельсен, Шведский культурный фонд в Финляндии, Ново Нордиск, Сюпейярхештет (Онкологическое общество Финляндии), Седьмая рамочная программа Европейского сообщества (FP7/2007-2013; грант FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) и H2020 Мари Склодов-Кюри Инновационная сеть Авторы благодарят Паулу Хайпус, Джоанну Кеколахти-Лияс и Ханнеле Хёркман за техническую помощь.
Цифры 3, 4 и Movie 2 перепечатываются с разрешения разработки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).
- Saxen, L. Organogenesis of the Kidney. 1st ed. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 536 (7615), 238 (2016).
- Halt, K. J., et al. CD146+ cells are essential for kidney vasculature development. Kidney International. 90, 311-324 (2016).
- van den Berg, C. W., et al. Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane. Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).
- Sariola, H. Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli. Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).
- Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. The origin of the glomerular endothelium. Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).
- Short, K. M., et al. Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney. Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).
- Saarela, U., et al. Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging. Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. 44, e2154 (2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
- Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract. Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).
- Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice. Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
