Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) is een zeer gevoelige, betrouwbare en gemakkelijk uit te voeren methode om omkeerbare lipidemodificatie van cysteïneresiduen (S-acylation) in een verscheidenheid van biologische monsters op te sporen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie van eiwit s-acylation met behulp van Acyl-Hars Assisted Capture
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Eiwit S-acylation, ook wel S-palmitoylation genoemd, is een omkeerbare posttranslationele modificatie van cysteïneresten met lange-keten vetzuren via een labiele thioesterbinding. S-acylation, die in opkomst is als een wijdverbreid regelgevend mechanisme, kan bijna alle aspecten van de biologische activiteit van eiwitten moduleren, van complexe vorming tot eiwithandel en eiwitstabiliteit. De recente vooruitgang in het begrijpen van de biologische functie van eiwit S-acylation werd grotendeels bereikt door de ontwikkeling van nieuwe biochemische instrumenten waardoor robuuste en gevoelige detectie van eiwit S-acylation in een verscheidenheid van biologische monsters. Hier beschrijven we acyl hars-ondersteunde vangst (Acyl-RAC), een recent ontwikkelde methode gebaseerd op selectieve vangst van endogene S-acylated eiwitten door thiol-reactieve Sepharose kralen. In vergelijking met bestaande benaderingen vereist Acyl-RAC minder stappen en kan het betrouwbaardere resultaten opleveren in combinatie met massaspectrometrie voor de identificatie van nieuwe S-acylation-doelen. Een belangrijke beperking in deze techniek is het gebrek aan vermogen om onderscheid te maken tussen vetzuursoorten die via dezelfde thioesterbinding aan cysteïnes zijn verbonden.
Inleiding
S-acylation is een omkeerbare posttranslationele modificatie waarbij een vetacylketen wordt toegedeeld aan een intern cysteïneresidu op een doeleiwit via een labiele thioesterbinding1. Het werd voor het eerst gemeld als een wijziging van eiwitten met palmitaat, een verzadigd 16-koolstofvetzuur2, en daarom wordt deze wijziging vaak aangeduid als S-palmitoylation. Naast palmitaat kunnen eiwitten omkeerbaar worden gewijzigd door een verscheidenheid aan langere en kortere verzadigde (myristaat en stearate), enkelvoudig onverzadigd (oleaat) en meervoudig onverzadigd (arachidonaat en eicosapentanoaat) vetzuren
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Muizen gebruikt in dit protocol werden geëuthanaseerd volgens NIH richtlijnen. Het Comité voor dierenwelzijn van de University of Texas Health Science Center in Houston keurde al het dierenwerk goed.
1. Bereiding van cellysataten
- Bereid de lysisbuffer voor zoals beschreven in tabel 1. Voeg 0,1 g n-dodecyl β-D-maltoside wasmiddel (DDM) toe en draai om op te lossen tot 10 mL PBS. Voeg 100 μL fosforremmercocktail 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) en proteaseremmercocktail (1x) toe en koel de buffer voor gebruik op ijs.
- Breng de vereiste media met cellen uit de couveuse over in conische buizen van 15 mL of 50 m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Naar aanleiding van het hierboven beschreven protocol, gebruikten we eerst acyl-RAC om tegelijkertijd s-acylation van verschillende eiwitten in Jurkat cellen te detecteren, een vereeuwigde T-cellijn oorspronkelijk afgeleid van het perifere bloed van een T-cel leukemie patiënt27. Regulerende T-celeiwitten die eerder als S-acylated9,28,,29 werden geïdentificeerd om het nut van deze methode aan te tonen. Zoa.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier hebben we met succes gebruik gemaakt van de acyl-RAC test om S-acylation van geselecteerde eiwitten te detecteren in zowel gekweekte menselijke cellen en primaire cellen afgeleid van muisweefsel. Deze methode is eenvoudig, gevoelig, en kan gemakkelijk worden uitgevoerd met minimale apparatuur eisen met behulp van standaard biochemie technieken. Deze methode is aangetoond dat het met succes nieuwe S-acylated eiwitten te identificeren, zoals de β-subeenheid van het eiwit translocating systeem (Sec61b),Sriboso.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidies 5R01GM115446 en 1R01GM130840.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets | Sigma | 11836170001 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| Hydroxylamine (HAM) | Sigma | 159417 | |
| Methyl methanethiosulfonate (MMTS) | Sigma | 64306 | |
| Mini tube rotator | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) | Sigma | D641 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
| Ultrasonics Quantrex Sonicator | L & R |
Referenties
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
- Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5)....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
