Acyl-RAC(アシル-レジンアシストキャプチャ)は、様々な生物学的サンプル中のシステイン残基の可逆的脂質修飾(S-acylation)を検出する方法を非常に敏感で、信頼性が高く、実行しやすいです。
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方法論記事
アシル樹脂アシスト捕捉によるプロテインS-アシル化の検出
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
プロテインS-アシル化は、S-パルミトイル化とも呼ばれ、陰茎チオエステル結合を介して長鎖脂肪酸を有するシステイン残基の可逆的な翻訳後修飾である。広範囲にわたる調節機構として出現するS-acylationは、複雑な形成からタンパク質の密売およびタンパク質安定性に至る、タンパク質の生物学的活性のほぼすべての側面を調節することができる。タンパク質S-アシル化の生物学的機能の理解の最近の進歩は、様々な生物学的サンプルにおけるタンパク質S-acylationの堅牢かつ敏感な検出を可能にする新しい生化学的ツールの開発によって大きく達成された。ここでは、チオール反応性セファロースビーズによる内因性S-acylatedタンパク質の選択的捕捉に基づく最近開発された方法であるアシル樹脂支援捕捉(Acyl-RAC)について述べている。既存のアプローチと比較して、Acyl-RACは、より少ないステップを必要とし、新しいS-アシル化ターゲットの同定のための質量分析と結合された場合、より信頼性の高い結果を得ることができます。この技術の主な制限は、同じチオスター結合を介してシステインに結合した脂肪酸種を区別する能力の欠如である。
概要
S-アシル化は、陰唇チオエステル結合1を介して標的タンパク質上のシステイン残基に脂肪アシル鎖を付加することを含む可逆的な翻訳後修飾である。それはパルミテ酸塩、飽和16-炭素脂肪酸2を有するタンパク質の修飾として最初に報告された、したがって、この修飾は、しばしばS-パルミトイル化と呼ばれる。パルミチン酸に加えて、タンパク質は、様々な長く短い飽和(ミリステイトおよびステアレート)、一価不飽和(オレ酸塩)および多価不飽和(アラキドキおよびエイコサペンタノエート)脂肪酸33、4、5、6、74,5,6,7によって可逆的に修飾することができる。真核細胞において、S-アシル化はDHHCタンパク質アシルトランスセラーゼとして知られる酵素ファミリーによって触媒され、システイン脱アシル化の逆反応はタンパク質チオエステラーゼによって触媒され、そのほとんどは依然として謎8のままである。
チオスター結合の可射性により、この脂質修飾を可逆的....
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プロトコル
このプロトコルで使用されたマウスは、NIHガイドラインに従って安楽死させた。ヒューストンのテキサス大学保健科学センターの動物福祉委員会は、すべての動物の仕事を承認しました。
1. 細胞ライセートの調製
- 表1に記載されているように、リシスバッファを準備する。PBSを10mLに、0.1gのn-ドデシルβ-D-マルトシド洗剤(DDM)を加え、溶解させて回転させます。100 μL のホスファターゼ阻害剤カクテル 2、ML211(10 μM)、PMSF (10 mM)、プロテアーゼ阻害剤カクテル (1x) を加え、使用前に氷上でバッファーを冷やします。
- 培養器から細胞を含む必要な培地を、350 x gで15mLまたは50 mLの円錐形チューブおよびスピン細胞に移し、細胞の破片を取り除くために吸気します。
注:我々は実行される各アシル-RAC反応のために1 x 107細胞を使用しました。 - ペレットをPBS 5 mL に再懸濁し、350 x gで 5 分間回転させて洗浄します。
注:PBSの拡張インキュベーションによる細胞溶菌を避けるために、ステップ1.3を迅速に実行してください。 - ステップ1.1で調製した600μLのリシスバッファーをペレットに加え、4°Cで30分間サーマルシェーカーで1500rpmで振って....
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結果
上述したプロトコルに従って、我々は最初に、T細胞白血病患者27の末梢血に由来する不死化T細胞株であるJurkat細胞における複数のタンパク質のS-アシル化を同時に検出するために、acyl-RACを用いた。この方法の有用性を実証するために、以前にS-acylated9,289,28,2929と同定された調節性T細胞タンパク質が選択された。図2Aに示すように、チロシンキナーゼLckは、システイン残基と脂肪酸部分(+HAMレーン)との間のチオエステル結合を切断するために中性2Mヒドロキシラミンで処理されたライセートで検出することができる。2M NaCl(-HAMレーン)で処理した試料は重要な陰性対照を表し、チオエステル結合の検出に対するアッセイの選択性を示す。入力レーンは、シグナルの特異性をさらに確認し、目的のタンパク質がS-acylatedでない場合.......
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ディスカッション
ここで、マウス組織由来の培養ヒト細胞および一次細胞の両方で選択したタンパク質のS-アシル化を検出するために、アシル-RACアッセイを利用することに成功しました。この方法は、単純で敏感であり、標準的な生化学技術を使用して最小限の装置要件で簡単に行うことができます。この方法は、タンパク質転写系のβサブユニット(Sec61b)、リボソームタンパク質S11(Rps11)、およびミクロソームグルタチオン-S-トランストランスファーゼ3(MGST3)22のような新規S-acylate化タンパク質22を同定することに成功することが示されている。アシルRACの感度と適応性は、様々な生物学的サンプル中のタンパク質S-アシル化を研究するのに適しています。
S-acylatedタンパク質のかなりの割合は、脂質いかだとしても知られている原形質膜のグリコスフィンゴ脂質濃縮部分と関連付けることができます。したがって、トリトンX-100、NP-40またはBrij58のような中性洗剤がリシス30に使用.......
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
謝辞
この研究は、国立衛生研究所の助成金5R01GM115446と1R01GM130840によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| cOmpleteプロテアーゼ阻害剤カクテル錠 | Sigma | 11836170001 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| Hydroxylamine (HAM) | Sigma | 159417 | |
| Methyl methanethiosulfonate (MMTS) | Sigma | 64306 | |
| Miniチューブローテ | ーターLabForce | ||
| ML211 | ケイマン | 17630 | |
| サームクールヒートシェイク | ベンチマーク | H5000-HCn | |
| -ドデシル&β;-D-マルトシド(DDM) | シグマ | D641 | |
| ホスファターゼ阻害剤カクテル2 | グマ | P5726 | |
| チオプロピルセファロース6B(TS) | シグマ | T8387 | |
| オントレックスソニケーターL | &;アール |
参考文献
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
- Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5)....
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再版と許可
