아실-PEGyl 교환 젤 시프트 분석은 뇌막 단백질의 팔미토일화의 정량적 측정을 위한 것입니다.

Summary

팔미토일화는 가역적인 방식으로 표적 단백질의 시스테인 잔류물까지 16탄소 팔미네이트 모이티의 혼입을 수반한다. 여기서, 우리는 생화학적 접근법, 아실-PEGyl 교환 겔 시프트(APEGS) 분석법을 설명하고, 마우스 뇌 용해액에 관심 있는 임의의 단백질의 팔미토일화 상태를 조사한다.

Abstract

시 냅 스 AMPA 수용 체의 수준에서 활동 의존 변경 (AMPARs) 후 층 내 밀도 (PSD) 학습 및 메모리에 대 한 세포 메커니즘을 나타내는 것으로 생각 된다. 팔미토일화는 AMPA-Rs, 보조 인자 및 시냅스 스캐폴드를 포함한 많은 시냅스 단백질의 국소화 및 기능을 활성 의존적 방식으로 조절합니다. 우리는 4개의 유전자의 시냅스 분화 유도한 유전자 (SynDIG1-4) AMPA와 연관되고 시냅스 강도를 통제하는 두뇌 특정 막 막 단백질을 인코딩하는 것을 확인했습니다. SynDIG1은 활성 의존적 흥분성 시냅스 개발에 중요한 병타-트랜스멤브레인 영역에서 위치하는 2개의 시스테인 잔기에서 191 및 192에 위치한다. 여기에서, 우리는 혁신적인 생화확적인 접근법, 아실-PEGyl 교환 젤 시프트(APEGS) 분석법을 기술하여, 관심 있는 단백질의 팔미토일화 상태를 조사하고 마우스 뇌 용해액에 있는 단백질의 SynDIG 제품군과 그 유용성을 입증한다.

Introduction

S-팔미토일화는 안정적인 막 연관성, 단백질 인신 매매 및 단백질-단백질 상호작용을 조절하는 표적 단백질의 가역적 번역 후^변형1. 그것은 팔미토일 아실 트랜스퍼 라제 (PAT) 효소에 의해 촉매 티오 에스터 링키지를 통해 시스테인 잔기에 16 탄소 팔미테 모티의 추가를 포함한다. 뇌의 많은 시냅스 단백질은 AMPA-Rs 및 PSD-95를 포함하는, 안정성, 국소화 및 기능^2,,3,,4를조절하는 활성 의존적 방식으로 팔미토틸화된다. PSD-95와 같은 시냅스 스캐폴드와 보조 요인의 상호 작용을 통해 PSD에 있는 시냅스 AMPARs의 수준에 있는 변경은 시냅스 가소성을 기초로 합니다; 따라서, 시냅스 단백질의 팔미토일화 상태를 결정하는 방법은 시냅스 가소성의 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공한다.

이전에는 AMPARs^5와연관된 뇌 특이적 막 간 단백질을 코딩하는 4개의 유전자(SynDIG1-4)의 SynDIG 제품군을 확인했습니다. 해리된 랫트 해마 뉴런에서 SynDIG1의 과발현 또는 노크....

Protocol

모든 동물 절차는 국립 보건원 (NIH)에 의해 명시된 지침을 따르고 캘리포니아 대학, 데이비스에 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 마우스 뇌막의 준비

1. 기요틴 장치를 사용하여 마우스를 참수하고 뇌를 빠르게 해부하십시오 (<1 분, 가능하면 해부 절차 중에 발생할 수있는 팔미토일화 변화를 최소화하십시오). 얼음 에 유리 균질화 제 (~12 스트로크)에서 균질화 완충제(표 1)의10 mL에서 즉시 균질화.
2. 원심분리기는 4°C에서 1,400 x g에서 15분 동안 용해됩니다. 상급체를 얼음에 새 튜브로 옮김. 펠릿(~6 스트로크)을 균질화 완충제와 원심분리기의 동일한 부피에서 710 x g에서 4°C에서 10분 동안 재중단합니다.
3. 4°C에서 20분 동안 40,000 x g에서 1.2단계와 원심분리기를 결합합니다.
4. 상판(cytosolic 분획)을 폐기하고 균질화 완충제에서 펠릿막(P2) 분획을 재중단한다.
   참고: 시료는 플래시 냉동 및 -80°C에서 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다.
5. 단백질 수준을 정량화하기 위해 비신코닌산(BCA) 분석기를 수행합니다....

Results

관심 있는 단백질에 대하여 항체를 가진 면역 blotting은 HAM가 포함되지 않은 견본과 비교된 이동성 교대에 의해 결정된 마우스 두뇌에 있는 palmitoylated 상태 (비, singly, 이중 등)를 제시합니다. 이전에는 SynDIG1이 ABE 분석^6을사용하여 두 사이트에서 팔미토틸화되었다는 것을 입증했습니다. 그러나, 우리는 두 사이트가 뇌 조직에서 수정되었는지 여부를 확인할 수 없습니다. 여기서 우리는 SynDIG1, SynDIG4/Prrt1 및 Prrt2가 마우스 뇌에서 팔미토화되어 있고 두 개의 잠재적인 팔미토일화 부위가 있다는 것을보여줍니다(그림 1). 흥미롭게도, 각 단백질은 비, 단리 및 이중 팔미토일화 단백질에 대한 신호에 기초하여 마우스 뇌에서 상이한 팔미토일화 상태를 가지고 있다. 블롯의 밀도 측정 분석은 손바닥에 절인 상태에 대한 정량적 정보를 .......

Discussion

전작에서는 ABE 분석서를 활용하여 SynDIG1이 안정성, 국소화 및 기능^6을조절하는 활성 의존적 방식으로 보존된 두 개의 병치-막간 시스 잔류물(모든 SynDIG 단백질에서 발견)에서 팔미토화된다는 것을 입증했습니다. 한계는 ABE 분석이 절차의 마지막 단계로 아비딘 모에티에 공액 된 아가로즈 수지와의 친화정화가 필요하며, 이로 인해 정량적 분석이 복잡해지는 신호의 상당한 손실이 발생한다는 것입니다. 더욱이, ABE 분석은 단백질이 한 번 또는 다중 사이트에 손바닥에 박혀 있는지 구별할 수 없습니다.

여기서 우리는 APEGS^{8분석8,9,10,,,11,,12.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
하이드록실아민(HAM)	ThermoFisher	26103
메톡시-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)	NOF	ME-050MA	MW ~5000 kDa
Microfuge	Eppendorf	5415R	또는 동급 장비
N-에틸말레미드(NEM)	Calbiochem	34115	독성이 강합니다.
밀도 측정용 광학 이미저	Azure Biosystems	Sapphire Biomolecular Imager	또는 동급 장비
캡이 있는 폴리프로필렌 튜브	Fisher Scientific	14-956-1D
혈청학 피펫(유리)	Fisher Scientific	13-678-27D
탁상용 원심분리기	Beckman	Allegra X-15R	또는 동급 장비
트리스 (2- 카르 복시 에틸) 포스 핀 - 염산염 (TCEP)	EMD 밀리 포어	580560