Summary
פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד החומר הצמחי לאימונולוקליזציה של חלבונים ופקטינים ערבינוגלקטניים קבוע, מוטבע בשרף אקרילי הידרופילי, חתוכה ומורכבת על מגלשות זכוכית. אנו מראים אפיטופים הקשורים לקיר התא יזוהו עם נוגדנים ספציפיים.
Abstract
פיתוח הצמח כרוך בהתאמות מתמידות של הרכב ומבנה דופן התא בתגובה לגירויים פנימיים וחיצוניים כאחד. קירות התא מורכבים מפוליסכרידים תאיים ולא צלולוסיים יחד עם חלבונים, תרכובות פנוליות ומים. 90% מקיר התא מורכב מפוליסכרידים (למשל, פקטינים) וחלבונים ערבינוגלקטים (AGPs). האימונולוקליזציה הפלואורסצנטית של אפיטופים גליקן ספציפיים בחלקים היסטולוגיים של הצמח נותרה כלי מרכזי לחשיפת שיפוץ של רשתות פוליסכריד בקיר, מבנה ורכיבים.
כאן, אנו מדווחים על הליך אימונולוקליזציה פלואורסצנטי אופטימיזציה לגילוי אפיטופים גליקן מ- AGPs ופקטינים ברקמות הצמח. קיבוע Paraformaldehyde / glutaraldehyde שימש יחד עם הטמעת LR-לבן של דגימות הצמח, המאפשר שימור טוב יותר של מבנה הרקמה והרכב. חלקים דקים של הדגימות המוטבעות שהושגו עם אולטרה מיקרוטום שימשו לאימונולוקליזציה עם נוגדנים ספציפיים. טכניקה זו מציעה רזולוציה רבה, ספציפיות גבוהה, ואת ההזדמנות לזהות אפיטופים גליקן מרובים באותה דגימה. טכניקה זו מאפשרת לוקליזציה תת-תאית של גליצנים ומזהה את רמת ההצטברות שלהם בקיר התא. זה גם מאפשר קביעת דפוסים מרחביים-זמניים של הפצת AGP ופסטין במהלך תהליכים התפתחותיים. השימוש בכלי זה עשוי בסופו של דבר להנחות כיווני מחקר ולקשר גליצנים לפונקציות ספציפיות בצמחים. יתר על כן, המידע המתקבל יכול להשלים מחקרים ביוכימיים וביטוי גנים.
Introduction
קירות תאי הצמח הם מבנים מורכבים המורכבים מפוליסכרידים וגליקופרוטאינים. קירות התא הם מבנים דינמיים ביותר שהארכיטקטורה, הארגון וההרכב שלהם משתנים בהתאם לסוג התא, לוקליזציה, שלב התפתחותי, גירויים חיצוניים ופנימיים1. חלבונים ערבינוגלקטנים (AGPs) ופקטינים הם מרכיבים חשובים של דופן תאי הצמח. AGPs הם חלבונים glycosylated מאוד פקטינים הם פוליסכרידים homogalacturonan אשר הרכב, כמות ומבנה להשתנות מאוד בשלבים התפתחותיים שונים של הצמח2,3,4. AGPs ומחקרי פקטין חשפו את מעורבותם במספר תהליכים צמחיים כגון מוות תאי מתוכנת, תגובה ללחצים אביוטיים, רבייה של צמחים מיניים, בין רבים אחרים5. רוב המחקרים הללו החלו עם מידע שהתקבל ממחקרי אימונולוקליזציה.
בהתחשב במורכבותו, חקר קירות התא דורש כלים רבים ושונים. זיהוי אפיטופים גליקן באמצעות נוגדנים חד שבטיים (mAbs) היא גישה חשובה כדי לפתור את התפלגות פוליסכריד וגליקופרוטאין לאורך מבנה זה. יש אוסף גדול של mAbs זמין כדי לזהות אפיטופים גליצן ואת הספציפיות של כל mAb הוא ללא הרף להיות משופר גם6. הטכניקה המתוארת כאן חלה על כל מיני הצמחים, והיא כלי מושלם להנחיית כיווני מחקר עתידיים שעשויים לכלול טכניקות יקרות ומורכבות יותר.
בטכניקה זו, נוגדנים ספציפיים הם מצומדים כימית צבעים פלואורסצנטיים כגון FITC (פלואורסצנטין isothiocyanate), TRITC (tetramethylrhodamine-5-(ו 6)-isothiocyanate) או כמה צבעי אלקסה פלואור. אימונופלואורסצנטיות מציעה מספר יתרונות, המאפשר לוקליזציה תת-תאית ברורה ומהירה של גליצנים שניתן לצפות בהם ישירות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. זה מאוד ספציפי ורגיש, שכן הכנת המדגם יכול להגן ביעילות על המבנה הטבעי של האנטיגן, גם אם קיים בכמויות נמוכות יותר. זה מאפשר זיהוי של אנטיגנים מרובים באותה מדגם והכי חשוב, מציע תוצאות באיכות גבוהה ויפה ויזואלית. למרות הכוח הרב שמציעים מחקרי אימונולוקליזציה פלואורסצנטיים, הם נחשבים לעתים קרובות כקשים לביצוע וליישם ככל הנראה בשל היעדר פרוטוקולים מפורטים המאפשרים הדמיה של השלבים השונים של ההליך. כאן, אנו מספקים כמה הנחיות פשוטות על איך לבצע טכניקה זו וכיצד להשיג תמונות באיכות גבוהה.
עבור הפרוטוקול המוצג כאן, יש לתקן ולהטבע תחילה דוגמאות באמצעות התיקון המתאים ביותר. למרות נחשב טכניקה זמן רב ומייגע יחסית, קיבעון נאות והטבעה של מדגם הצמח הוא המפתח כדי להבטיח מבחני אימונולוקליזציה מוצלחת. לשם כך, הרגיל ביותר הוא קיבעון כימי באמצעות קיבועים crosslinking, כמו אלדהידים. תיקונים חוצי קישורים יוצרים קשרים כימיים בין מולקולות של הרקמה, מייצבים ומקשיחים את המדגם. פורמלדהיד וגולדארלדהיד הם מתקנים מקשרים צולבים, ולפעמים נעשה שימוש בשילוב של שני התיקונים7. פורמלדהיד מציע שימור מבני נהדר של רקמות ולמשך פרקי זמן ממושכים, לייצר נסיגות רקמות קטנות ולהיות תואם immunostaining. Glutaraldehyde הוא תיקון חזק ויציב המשמש בדרך כלל בשילוב עם פורמלדהיד. השימוש glutaraldehyde יש כמה חסרונות שיש לקחת בחשבון כפי שהוא מציג כמה קבוצות אלדהיד חינם לתוך הרקמה הקבועה, אשר עשוי ליצור כמה תיוג לא ספציפי. גם ההצלבה בין חלבונים ומולקולות אחרות מדי פעם עלולה להפוך כמה אפיטופים היעד נגיש עבור הנוגדנים. כדי להימנע מכך, יש להגדיר בזהירות את הכמות ומשך הקיבעון.
לאחר הקיבעון, הדוגמאות מוטבעות בשוחלת המתאימה כדי להקשיח לפני קבלת המקטעים. שרף לונדון (LR-לבן) שרף אקרילי הוא השרף של בחירה עבור מחקרים immunolocalization. שלא כמו שרפים אחרים, LR-White הוא הידרופילי, המאפשר לנוגדנים להגיע לאנטיגנים שלהם, ללא צורך בטיפול כלשהו כדי להקל עליו. LR-White יש גם את היתרון של הצעת פלואורסצנטיות אוטומטית נמוכה, המאפשר ירידה ברעש רקע במהלך הדמיה immunofluorescence.
ישנן טכניקות כתמים רבות הזמינות לגילוי רכיבים שונים של דופן התא, כגון כתמים כחולים אלסיאניים, כתמי כחול טולואידין או כתמי חומצה תקופתית-שיף (PAS). אף אחד מאלה אינו מציע את הכוח של ניתוחי אימונולוקליזציה8. גישה זו מעניקה ספציפיות רבה יותר בזיהוי הגליקנים, ומציעה מידע נרחב יותר לגבי הרכב ומבנה דופן התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מדגם: קיבעון, התייבשות, הטבעה LR-לבן
- קיבוע והתייבשות
הערה: תהליך הקיבעון הוא קריטי לשמירה על הדגימה; על ידי הצלבת מולקולות חילוף החומרים התאי נעצר, הבטחת שלמות הסלולר ומניעת דיפוזיה מולקולרית. סוכנים מתקנים ואת הריכוז בשימוש חייב להיות מותאם למטרה זו, משאיר את האנטיגנים חשופים מספיק כדי לקיים אינטראקציה עם הנוגדנים. הפרוטוקול הבא משלב את היכולת הקיבעון המתון של paraformaldehyde, עם ההשפעה החזקה יותר של גלוטארלדהיד. הפרופורציות שלהם היו ממוטבות עבור AGPs ורכיבי קיר התא, אבל זה מתאים חלבונים אחרים ומבני תאים. תהליך ההתייבשות הבא יכין את הדגימות להטמעה LR-לבן. בניסוי זה נעשה שימוש ברקמות צמחים ממספר מיני צמחים. דגימות משנה Quercus נאספו מעצים הגדלים בשדה. דגימות שקיעה טריתוריה חולקו איתנו בחביבות על ידי פאולה רודול (גני קיו, לונדון, בריטניה).- לזרוע את כל הצמחים Arabidopsis ישירות על הקרקע ולגדול במתקן צמיחה מקורה עם 60% לחות יחסית ומחזור יום / לילה של 16 שעות אור ב 21 °C (66 °F) ו 8 שעות חושך ב 18 °C (60 °F). בחר את רקמות הצמח שיש לנתח, לקצץ דגימות להיות לא יותר מ 16 מ"מ2 בגודל.
- מיד להעביר את המדגם בקבוקון זכוכית מלא בעבר עם פתרון קיבוע קר מספיק (2% פורמלדהיד (w / v), 2.5% glutaraldehyde (w / v), 25 mM PIPES pH 7 ו 0.001% Tween-20 (v / v)) כדי להטביע לחלוטין את הדגימות (איור 1A).
התראה: פורמלדהיד וגולדלדהיד הם סוכנים קיבעוניים שיכולים להזיק על ידי שאיפה ומגע. בצע את צעד הקיבעון על מכסה המנוע אדים וללבוש בגדים מגן נאותה כפפות ניטריל. כל הפתרונות משלב זה ואילך, כולל סדרת אלכוהול עד 70%, יש לאחסן לטיהור מאוחר יותר על ידי צוות מיוחד. - לאחר איסוף כל הדגימות, רענן את התיקון.
- מעבירים את הבקבוקונים לתא ואקום, ולאט לאט מורים ואקום. עם ההגעה ל-60 קילוואט-אפ, החומר הצף יתחיל לשקוע לתחתית הבקבוקון (איור 1B).
- יש לשמור תחת ואקום של לא יותר מ-80 קילוואט למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
- משחררים לאט את הוואקום, אוטמים את בקבוקון הזכוכית ומניחים לילה ב-4 מעלות צלזיוס.
- השלך את כל הדגימות שלא שקעו במהלך הקיבעון בן הלילה. לשטוף את הדגימות הנותרות עם 25 mM PBS pH 7 במשך 10 דקות, ואחריו לשטוף 20 דקות ב 25 mM PIPES מאגר pH 7.2.
- לייבש את הדגימות בסדרת אתנול (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, ו 3x 100% אתנול) במשך 20 דקות כל אחד. מעבירים מיד את הדגימות המיובשות לבקבוקוני זכוכית מסומנים להטבעה (איור 1C).
הערה: ניתן להשהות את תהליך ההתייבשות בשלב 70% האתנול.
- הטבעת שרף LR-לבן
הערה: LR-לבן הוא שרף אקרילי לא הידרופובי עם צמיגות נמוכה, מה שהופך אותו אידיאלי עבור רקמות חודרות עם שכבות רבות של קירות תאים עבים. LR-לבן מגיע גם בכמה ציונים קשיות תואם לחיתוך רוב דגימות הצמח. אנא ודא כי שוסף משומש כבר מסופק עם הזרז הנכון מעורבב, או בצע את הוראות הספק כדי להכין את הרשף. תהליך ההטבעה הבא איטי אך התוצאות מצדיקות במידה רבה את האמצעים.- לחלחל הדגימות על ידי דגירה עם שרף LR-לבן בסדרה של ריכוז חצי סהר של שרף (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) באתנול, דגירה במשך 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס בכל צעד.
התראה: שרף LR-לבן הוא שרף אקרילי רעילות נמוכה; עם זאת, זה עשוי להיות מגרה לעור על ידי מגע ושאיפת. מומלץ מאוד לעבוד באזור מאוורר היטב או מתחת למכסה אדים עם בגדי מגן מתאימים וכפפות ניטריל. - רענן את שרף LR לבן דגירה עבור 12 שעות נוספות ב 4 °C (60 °F).
- הכינו כמוסות ג'לטין בגודל המתאים (גודל 1 (0.5 מ"ל) לדגימות של עד 3 מ"מ, 2 x 0.37 מ"ל לדגימות של עד 5 מ"מ או 3 x 0.3 מ"ל לדגימות עד 8 מ"מ ותגי נייר (איור 1D).
הערה: בחר את גודל הקפסולה להיות מעט גדול יותר מאשר המדגם, כך הדגימה יכולה להיות סגורה לחלוטין שרף. כמו כן, זכור לתייג את התגים בעיפרון, מכיוון שעט או צבעי דיו מודפסים יזהמו את שף, ויהרסו את הדגימה. - יש למרוח טיפה אחת של שרף LR-לבן טרי על החלק התחתון של כל כמוסה.
- מניחים דגימה בכל כמוסת ג'לטין וממלאים לקיבולת מקסימלית עם שף טרי. מניחים את מכסה הקפסולה ונולחים בעדינות ליצירת חותם הרמטי(איור 1E).
- פולמריזציה של שף במשך 24 עד 48 שעות ב 58 מעלות צלזיוס, או עד התקשות מלאה.
- אחסן דגימות בטמפרטורת החדר.
הערה: שרף LR-לבן לאחר פולמורציה הוא אינרטי.
- לחלחל הדגימות על ידי דגירה עם שרף LR-לבן בסדרה של ריכוז חצי סהר של שרף (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) באתנול, דגירה במשך 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס בכל צעד.
2. הכנת שקופיות
הערה: שקופיות זכוכית חייבות להיות נקיות, ללא כל אבק, גריז או כל מזהם אחר. אפילו שקופיות חדשות יש לנקות כמו ספקים מסוימים להשתמש בשמנים וחומרי ניקוי כדי למנוע את השקופיות מלהידבק יחד. כל גריז או חומר ניקוי יפריע הידבקות החלק לשקופית, גם אם מטופלים עם פולי-L-לידין. מוך ואבק ישפיעו על תצפיות הדגימה וייתכן מאוד יהרסו את הניסוי. שקופיות מצופות טפלון עם בארות תגובה מושלמות למשימה זו. הם סבירים, לשימוש חוזר ולהפחית באופן דרסטי את כמות פתרון הנוגדנים הדרוש. עם ניקוי נכון, אימונולוקליזציה פלואורסצנטית באיכות מעולה יכולה להתבצע בעלות סבירה מאוד.
-
שטיפת שקופיות
- מניחים את השקופיות בארון תקשורת מכתים ומכסים בתמיסת ניקוי (0.1% SDS (w/v), 1% חומצה אצטית (v/v), 10% אתנול (v/v)).
- לשמור על תסיסה קלה במשך 20 דקות.
- מעבירים את מדפי הכתמים לאמבט DDH2O עם תסיסה קלה במשך 10 דקות. חזור על הפעולה 4 פעמים.
- מסננים בזהירות את המדפים לפני טבילה קצרה באתנול של 100% ומניחים למגלשות להתייבש בסביבה נטולת אבק.
- יש לאחסן עד השימוש.
-
ציפוי פולי-ל-ליצין (אופציונלי)
הערה: חלקים קטנים בדרך כלל מקל טוב מאוד כדי לנקות שקופיות זכוכית. שלב זה מומלץ רק עבור מקטעים גדולים יותר (>2 מ"מ2). חלקים גדולים יותר נוטים לקפל ולהתקמט, ואינם מומלצים. עם זאת, במידת הצורך להשתמש שקופיות תגובה עם חורים גדולים יותר. נקה אותם כאמור לעיל והמשך כדלקמן.- מניחים שקופיות נקיות בצלחת פטרי מרובעת. פיפט 0.001% פולי-L-ליסין פתרון (w/v) כדי לכסות את החורים של השקופיות, מבלי לעלות על גדותיו.
- תן את המגלשות להתייבש לילה ב 40 מעלות צלזיוס במנות פטרי סגורות.
הערה: המגלשות המצופה מוכנות לשימוש מיידי וניתן לאחסן אותן בסביבה נטולת אבק בטמפרטורת החדר, למשך מספר חודשים.
3. חיתוך וחיתוך לדוגמה
-
חיתוך לדוגמה
- בעזרת סכין גילוח חד, חותכים את גושי LR-White תחת סטריאומיקרוסקופ כדי ליצור מבנה בצורת פירמידה שבו השיא ניצב לאזור העניין של המדגם(איור 1A משלים).
הערה: מחזיק הדגימה האולטרה-מיקרוטומי הוא כלי מצוין לאבטחת הבלוק. אם להתקן אין מחזיק דגימה אוניברסלי, השתמש בדגימה המתאימה ביותר לבלוקים עגולים. - לקצץ את המבנה הפירמידלי על ידי הסרת פרוסות עדינות של עודף שף בניצב לציר הראשי הפירמידה.
- ממשיכים עד שהדגימה מגיעה ויוצרים את משטח החיתוך. בתוך משטח החיתוך, מדגם היעד צריך להיות מוקף באופן אידיאלי בצורת טרפז.
הערה: ניתן לחתוך עוד יותר את בלוק שרף בזווית חתך כדי להפחית את שטח הפנים של המקטע עם להב חד(איור 1F).
- בעזרת סכין גילוח חד, חותכים את גושי LR-White תחת סטריאומיקרוסקופ כדי ליצור מבנה בצורת פירמידה שבו השיא ניצב לאזור העניין של המדגם(איור 1A משלים).
-
חתך דק למחצה
הערה: ייעשה שימוש במיקרוטום עם סכיני זכוכית. היכולת של הנוגדן להיקשר לאפיטופ תותנה את הצלחת התגובה האימונולהבלקטיבית. האופי ההידרופילי של שרף LR-לבן יאפשר מגע טוב של הנוגדנים עם קטעי המדגם. חלקים דקים יותר יציגו צבע קלקופלור עמום שישמש כדי לסייע באיתור החלקים ולסייע בתהליך ההדמיה. אותו הדבר נכון לגבי כתמים אחרים שעשויים להיות מיושמים מאוחר יותר. גם עובי מוגזם ישפיע על איכות רכישת התמונה. פשרה טובה לעובי קטע ניתן למצוא בין 200 ל 700 ננומטר, בהתאם למאפייני הרקמה. הר את הבלוקים בחוזקה על מחזיק הדגימה של אולטרה מיקרוטום.- עם מיקרוטום אולטרה-מיקרו-אטומי, יש ליצור מקטעים בעובי שבין 200 ל-700 ננומטר (איור 1G).
- בדוק את אזור המקטע על-ידי העברת מקטעים מסוימים לנפילת ddH2O בשקופית זכוכית. מניחים את המגלשה על צלחת חמה של 50 מעלות צלזיוס עד שהמים מתאדים. כתם הצבת טיפה של 1% טולוידין כחול O (w / v) ב 1% תמיסת חומצה בורית (w / v) על החלקים במשך 30 s. לשטוף ולהתבונן תחת המיקרוסקופ.
- לאחר מציאת המבנה הרצוי, להעביר קטע אחד או שניים לכל טיפה של ddH2O להציב בעבר על כל באר של שקופית תגובה נקייה.
- מניחים כל שקופית בצלחת פטרי מרובעת נקייה סגורה בגודל 10 ס"מ ומניחים לה להתייבש ב-50 מעלות צלזיוס.
- אחסן שקופיות בתיבת ארכיון נקייה עד לשימוש.
4. אימונולוקליזציה
הערה: הליך האימונולוקליזציה הפלואורסצנטית מסתמך על שימוש רציף בשני נוגדנים. הנוגדן העיקרי מועלה נגד אנטיגן מטרה ספציפי. הנוגדן המשני מועלה במיוחד נגד הנוגדן העיקרי ולטכניקות פלואורסצנטיות הוא מצומד פלואורופור (FITC בפרוטוקול ספציפי זה). הנוגדן העיקרי ישמש לגילוי אנטיגן היעד במדגם, והנוגדן המשני ישמש לסימון המיקום שבו הנוגדן העיקרי המחובר לדגימה לאחר שטיפת עודף הנוגדן העיקרי. פקדים הם חלק חשוב של מבחנים אלה ויש לבצעם תמיד כדי להבטיח את דיוק התצפיות. באר אחת בשקופית צריכה להיות שמורה לשימוש כבקרה שלילית, שם ידלגו על הטיפול העיקרי בנוגדנים, ולכן אין לראות אות בסוף הניסוי. שליטה חיובית חייבת להיכלל בניסוי על ידי טיפול בבאר אחת עם נוגדן אשר תיוג כבר ידוע ובטוח. הבקרה החיובית משמשת לאישור יעילות תיוג הנוגדנים המשניים ותנאי התגובה בעוד שהבקרה השלילית בודקת את הספציפיות המשנית של הנוגדנים.
- הכינו תא דגירה על ידי הנחת כמה מגבות נייר לחות בתחתית קופסת טיפים לפיפט ועטיפתו בנייר כסף(איור משלים 1B-1E). מניחים את השקופיות בתא הדגירה.
- פיפטה טיפה 50 μL לכל 8 מ"מ גם של פתרון חסימה (5% חלב יבש דל שומן (w / v) ב 1 M PBS) ודגרת במשך 10 דקות. הסר את פתרון החסימה ולשטוף את כל בארות פעמיים עם PBS במשך 10 דקות.
- הכן את פתרונות הנוגדנים העיקריים (ראה טבלה משלימה 1), נוגדן 1:5 (v/v) בתמיסת חסימה; לעשות הערכה של כ 40 μL לכל 8 מ"מ היטב.
הערה: יש להתאים את ריכוז הנוגדן בהתאם לפרוטוקול הייצור. - בצעו שטיפה אחרונה עם ddH2O במשך 5 דקות, לעולם אל תתנו לבארות להתייבש לחלוטין.
- פיפט פתרון הנוגדנים העיקרי לבארות התגובה. פיפט חוסמת פתרון לבארות הבקרה.
- סגור את תא הדגירה ולתת לעמוד במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר ואחריו לילה ב 4 מעלות צלזיוס. הכן את פתרון הנוגדנים המשני, 1% בתמיסת חסימה (v / v) על 40 μL לבאר. שמור אותו מכוסה בנייר כסף.
- לשטוף את כל בארות פעמיים עם PBS במשך 10 דקות, ואחריו 10 דקות נוספות עם ddH2O. ודא כי אין עקבות של פתרון חסימה או הפקדות גלוי על בארות.
- פיפטה פתרון הנוגדנים המשני לכל בארות. מעתה והלאה, הגן על השקופיות מפני אור.
- דגירה במשך 3-4 שעות בחושך בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את כל בארות פעמיים במשך 10 דקות עם PBS ואחריו לשטוף עוד 10 דקות עם ddH2O.
- החל טיפה של calcofluor (1:10,000 (w / v) פלורסנט בהיר יותר 28 ב PBS) על כל באר. ללא שטיפה, יש למרוח טיפה של מדיום הרכבה (ראו טבלת חומרים)על כל באר ולמקם עט כיסוי (איור 1H).
- שימו לב במיקרוסקופ פלואורסצנטי, המצויד בעדשה 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 ו- 100x/1.40, השתמש ב- UV (עבור כתמי קלקולור) ובמסנני FITC, כדי לזהות קיר תאים ואימונולוקליזציה בהתאמה (איור 1I). השתמש באורכי הגל הבאים: עירור/פליטה (nm) 358/461 עבור UV ו- 485/530 עבור FITC.
- לקבלת תצוגה חזותית טובה יותר של התוצאות חופפות שתי התמונות עם ImageJ או דומה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניסוי מוצלח, הנוגדן המשני יאתר באופן ספציפי את מיקומו של האפיטופ הספציפי בירוק בהיר, באופן עקבי, ויאפשר אפיון של הרכב דופן התא בשלב התפתחות מסוים של התא, הרקמה או האיבר. לדוגמה, לנוגדן LM6 יש זיקה גבוהה ל-1,5-arabinan, תרכובת עם סוג I rhamnogalacturonan שניתן למצוא מתייגת בשפע את דופן התא של קוורקוס suber anther המתפתח (איור 2A), ובכך מאפשרת להסיק כי סוג זה של פקטין הוא בשפע וחלק מהרכב דופן התא הראשי. JIM5 יש זיקה homogalacturonans בקושי esterified כי נמצאים בדרך כלל בקצה השורש של עובר Quercus suber, המציין תכונות מכניות של האיבר (איור 2B). Xylogalacturonan הם סוג של פקטין עשיר xylose הקשורים התרופפות דופן התא, הם נמצאים בתאים מנוונים. הנוגדן LM8 מזהה באופן ספציפי xylogalacturonans, באיברים מתבגרים ניתן להשתמש בו כדי לזהות תאים או רקמות מנוונים, כמו תאי אנדוספרם בשלבים הסופיים של התבגרות בלוט Suber Quercus (איור 2C).
JIM13 יש זיקה AGPs נמצאו על מבנים הקשורים רבייה, קווי תאים הקשורים microgametogenesis ב Arabidopsis thaliana (איור 2D). JIM8 מזהה גם אפיטופים של AGPs הנמצאים בתאים ובאיברים הקשורים לרבייה כמו הפפילה הסטיגמטית והמיקרופייל של שקיעת טריתוריה אנגיוספרם בזל(איור 2E-2F). שני הנוגדנים הוצעו להיות סמנים מולקולריים עבור קווי התא gametophytic בצמחים9.
בדרך כלל קל לזהות ולזהות טעויות נפוצות בפרוטוקול זה. כאשר מדלגים על הכביסה או על בארות התגובה, הנוגדן המשני יופיע בדרך כלל ככתם לא ספציפי המכסה ללא הבחנה על תאים, רקמות, שרסןומגלשה (איור 3A). אגרגטים של פלואורוכרום ירוק ייווצרו אם הנוגדן הראשוני הבלתי מוגבל לא נשטף כראוי (איור 3B). סיבה נפוצה נוספת לכישלון טכניקה זו קשורה לקיפול ו/או ניתוק של החלקים (איור 3C),מה שהפך את הניסוי לחסר תועלת. בעיה זו קשורה בדרך כלל עם הידבקות לקויה של המקטעים לשקופיות, כנראה בשל השימוש בשקופיות טמאות, ו / או כביסה אגרסיבית.
הכנת המדגם היא גם שלב קריטי בהליך זה. למרבה המזל, קל לזהות את בעיות התיקון וההטמעה הנפוצות ביותר (איור 3D). אם הכל ילך כשורה גוש השורף יהיה נקי מסדקים והדגימה תהיה גלויה בבירור עם צבע צהוב חיוור לחום בהיר(איור 3D-1). דגימות מוטבעות בצורה לא יעילה יציגו כתמים או אזורים לבנים אבקתיים (איור 3D-2). שמירה על גודל המדגם תחת 8 מ"מ חשוב להבטיח את החדירה של הפתרון הקבע. כאשר הדגימות קבועות בצורה גרועה, הן יופיעו בצבע חום כהה כמעט שחור(איור 3D-3). כמו כן טמפרטורת הפולמליזציה חשובה הן לשימור האפיטופים והן להקשחה נכונה של השורף. טמפרטורה מוגזמת עלולה לגרום לסדקים את השבר ולהפוך את ההחלקה של המדגם לבלתי אפשרית (איור 3D-4).
איור 1. מבט כולל על הפרוטוקול המלא. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תוצאות אופייניות של AGPs ואימונולוקליזציה של פקטין בדגימות צמחים. (A) LM6 תיוג של moiety arabinan של פקטינים ב anther quercus suber במיוזיס I. (B) תיוג ספציפי של pectins esterified מתיל נמוך בקצה שורש עובר Suber Quercus על ידי JIM5. (C) Xylogalacturonan שכותרתו על ידי LM8 באנדוספרם הנסוג של בלוט התבגרות משנה Quercus. (D)JIM13 תיוג של AGPs בקלטום ו tetrads של ערבידופסיס thaliana אתר. (E)AGPs שכותרתו על ידי JIM8 בפפילה הסטיגמטית של טריתוריה צוללות. (F) JIM8 תיוג AGPs במיקרופייל (חץ לבן) של שיבולת שועל שקיעה טריתוריה. מיקרו-ספורה מיוטית (Mc), קלטום (Tp), שורש (R), קצה שורש (Rt), טסטה (Ts), אנדוספרם (אד), עובר (Em), אפידרמיס (Ep), פפיליה סטיגמטית (SP), אובולה (OV). סרגלי קנה מידה: 100 מיקרומטר.
איור 3: טעויות ובעיות נפוצות במהלך הפרוטוקול. (A) כישלון של שלבי שטיפה מזוהים על ידי נוכחות של מריחה לא ספציפית של נוגדן משני (+) על שף מדגם. (B)הספציפיות הירודה או כשל השטיפה של הנוגדן העיקרי גורמים להיווצרות אגרגטים של FITC (+) שאינם קשורים למיקום מסוים. (C)קיפולים וניתוק מקטעים הם לעתים קרובות תוצאה של שטיפה אגרסיבית ושקופיות טמאות. (D) דוגמאות של קיבוע והטבעה לדוגמה; (1) כשל מושלם בגודל ובהטבעה של דגימה, (2), (3) כשל בהקשחת שף. FITC שכותרתו נוגדן (ירוק) וכתם קלקופלור לבן (כחול). סרגלי קנה מידה: 100 מיקרומטר.
איור משלים 1. (A) ייצוג סכמטי של רצף חיתוך הבלוק להכנת המדגם (בלוק צהוב) עבור מקטע עם ultramicrotome. ראשית, כמוסת הג'לטין מוסרת (1). לאחר מכן הם נחתכים לראשונה בזווית של 40° עד 45° לצדי הקפסולה באופן משיק למדגם (2), חתך שני נעשה ב 90° של הראשון (3) ואחריו שלישי (4) והרביעי בעקבות אותו כלל (5). מהשלב הראשון של גיזום תוצאות מבנה בצורת פירמידלי אשר הפסגה ממוקמת מעל המדגם. לבסוף, עם להב חד הפסגה מגולחת בניצב לציר הראשי של בלוק שרף כדי להגיע לדגימה המוטבעת. משטח מרובע או טרפז צריך להתקבל בסוף ההליך (6). (B)אספקה נדרשת כדי להפוך את תא הדגירה; נייר אלומיניום (1), סרט דביק דו צדדי (2), מגבות נייר (3) וקופסת קצה פיפטה. (C) הצעד הראשון, רדיד הפח קבוע לתיבה עם סרט ההדבקה הדו-צדדי. (ד)השלב השני, מחזיק טיפים פיפטה מוסר למקם מגבות נייר בתחתית התיבה. (ה)צעד שלישי, מגבות הנייר לחות במים ומחזיק טיפים פיפטה ממוקם בחזרה לפעול יש מגש עבור המגלשות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 1: רשימה של נוגדנים חד שבטיים שימושיים. הטבלה לעיל מייצגת דוגמה לנוגדנים זמינים, עם מידע על המטרות שלהם והיכן ניתן לרכוש אותם. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת האימונולוקליזציה הפלואורסצנטית בצמחים כאן תיארה, אף שהיא פשוטה בצורה חלקה, מסתמכת על ההצלחה של מספר צעדים קטנים. הראשון שבהם הוא הכנה וקיבעון לדוגמה. במהלך צעד ראשון זה, תערובת של פורמלדהיד ו glutaraldehyde משמש כדי crosslink רוב מרכיבי התא. הפורמלדהיד בתמיסה מספק קיבעון קל וניתן הפיכה בעוד הגלוטארלדהיד מספק חיבור חזק וקבוע יותר; האיזון בין שני התיקונים מספק את הכמות המתאימה של הצלבה, ומאפשר חשיפה של האפיטופים להגיב עם הנוגדן העיקרי10. כדי שהפתרון המתקן יפעל כראוי, המדגם חייב להיות קטן. מבנים גדולים בקוטר של יותר מ-7 מ"מ קשים מאוד לתיקון ויש לקצץ כדי להבטיח חדירה מתקנת.
לאחר פציעה או מתח, צמחים מסוימים מפרישים כמויות גדולות של טאנינים היוצרים משקעים כהים שעלולים להגיב עם פורמלדהיד להפריע לתהליך התיקון. שמירה על הדגימות על הקרח והחלפת הפתרון המקבע בכל פעם שהוא הופך להיות מעונן עוזר להפחית את האפקט הזה. האוויר יכול גם להפריע לתהליך התיקון ובהמשך בהטבעה והקשחה של ההקשחה של ההסתעפות. טיפול ואקום המוצע צריך להסיר את רוב האוויר. עבור רקמות אווריריות במיוחד, שלב ואקום ניתן להאריך עוד יותר 2 שעות, עד שאין יותר אוויר יוצא מהדגימות והם שוקעים לתחתית. יש למחוק כל דגימה שנמצאה צפה לאחר שלב התיקון בן הלילה. הטבעת שף מספקת תמיכה לחיתוך המדגם שהשתמר, וקשיותו צריכה להיות משוערת לרקמות המוטבעות10. LR-White מגיע בשלושה ציוני קשיות: קשה לרקמות וודיות, ציון בינוני לרוב המכריע של הרקמות מעלים ועד גרגרי אבקה, וציון רך לרקמות עדינות יותר. עבור הטבעה מושלמת, את השופכה חייב לחדור לחלוטין את המדגם; זה מתקבל טוב יותר עם חדירה איטית והדרגתית. עם בדיקות קודמות, ניתן להשתמש בתקופות דגירה קצרות יותר. כמוסות הג'לטין הן קטנות והן אטומות הרמטית, מה שהופך אותן למושלמות לריפוי שרף LR-White. עבור גודל 2 (0.37 מ"ל), ריפוי צריך להסתיים לאחר 24 שעות ב 58 °C (69 °F). עבור גדלים אחרים כמוסה, זמן ריפוי צריך להיות מותאם. שרף נרפא LR-לבן צריך לעבור כמעט חסר צבע לצבע זהוב / ענבר בהיר ולהרגיש קשה לציפורניים. זמירה לדוגמה ושימוש באולטרה מיקרוטום דורש תרגול אך יפיק דמויות ברורות. העובי והגודל של החלק חשובים לבדיקת ההדמיה והאימונולוקליזציה. עובי החלק צריך להישמר סביב 500 ננומטר. מקטעים דקים מדי יגרמו לכתמים ירודים ועובי מקטעים מעל 700 ננומטר יפריעו לרכישת התמונה ולרזולוציה. האופי ההידרופילי של שרף LR-לבן מאפשר שימוש ישיר של החלקים בכתמים ואימונולוקליזציה מבלי להסיר את שרף.
פתרון החסימה (5% חלב יבש דל שומן ב 1 M PBS) מפחית מחייב לא ספציפי של נוגדנים. חלב יבש דל שומן כבר חלופה אמינה BSA או סוכני חסימה מסורתיים אחרים, והוא משמעותית פחות יקר. יש לסנן את פתרון החסימה באמצעות מסנן נייר לפני השימוש, כדי למנוע משקעים היוצרים קשה לשטוף אגרגטים, לשמור נוגדנים ולפגוע בניסוי. יחסי הנוגדנים המוצעים ותקופות הדגירה מוטבו ויושמו בהצלחה על מינים מגוונים במספר מחקרים9,11,12,13,14,15,16.
אידוי ואקספוזיציה לאור הם שני נושאים שיש להימנע מהם במהלך הליך האימונולוקליזציה. תא דגירה לח וחשוך פותר את שתי הבעיות הללו. ערכת לימוד כיצד ליצור תא כהה ניתן למצוא באיור המשלים 1B-1E. פרוטוקול אימונולוקליזציה זה קורא לשימוש בנוגדן ראשוני המופנה לאפיטופ המטרה ללא תווית משלו, ונוגדן משני המוצמד לפלואורוכרום (FITC) המועלה כנגד הנוגדן העיקרי IgG. שיטה זו מציעה מספר יתרונות על פני השימוש במערכת גילוי נוגדנים אחת בשל ההקפדה המוגברת על הגילוי, שכן לנוגדן המשני אין זיקה למין מדגם היעד. מערכת זו מציעה אות מוגבר כמו מולקולות הנוגדן העיקרי עשוי להיות ממוקד על ידי מספר מולקולות של הנוגדן המשני, כל אחד נושא fluorochrome17.
הריקבון של fluorochromes על ידי אור אינטנסיבי, או הלבנת תמונה, הוא נושא חשוב בטכניקה זו. במיוחד כאשר בוחנים אותות מקומיים קלושים, האות עלול ללכת לאיבוד באופן בלתי הפיך לפני ההדמיה. הרכבה בינונית מגדילה מאוד את היציבות ואת תוחלת החיים של הפלואורוכרומים18; עם זאת, מומלץ מאוד לבדוק את התקשורת הרכבה, כמו כמה עשויים להגיב עם הכתם ו / או fluorochrome, יצירת משקעים ומטשטש את התמונה. התצורה של המערכת האופטית המשמשת להתבוננות ורישום האימונולוקליזציה היא אחד ההיבטים החשובים ביותר להצלחת הניסוי. בשל עובי מופחת של החלקים, היתרונות של שימוש במיקרוסקופ confocal מוגבלים. ההתקנה המוצלחת ביותר דורשת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי זקוף קונבנציונלי המצויד במקור אור פלואורסצנטי, נורת LED או כספית19, עם מטרות כיתה פלואורסצנטיות נאותה. כמו כן, נדרשים מסנני תאורה באיכות טובה המיועדים להתרגשות/פליטה (nm) 358/461 עבור UV ו- 485/530 עבור FITC. לרכישת תמונת פלואורסצנטי, מצלמות דיגיטליות מונוכרומטיות בקירור מומלצות בשל המהירות והרגישות הגבוהות שלהן, אך מקריבות מידע צבע אמיתי20. מצלמות פוליכרומטיות מספקות את היכולת למיין בקלות אות מפלואורסצנטיות ברקע, אך הן איטיות יותר והרבה פחות רגישות מעמיתיהן המונוכרומטיים.
השיטה מוגבלת על ידי הזמינות של נוגדנים ספציפיים. למרות הזמינות של אוסף עצום ומתרחב של נוגדנים המיועדים לאפיטופים של צמחים, מובן שלא כל תרכובות הצמח עדיין מכוסות. גם שומנים נוטים להיות מופקים על ידי שיטת ההטבעה המתוארת, ולכן אינו מומלץ לרקמות עם תכולת שמן גבוהה. סעיף Cryostat עשוי להיות חלופה, למרות הקרבת רזולוציית התמונה. הטמפרטורה של פולמור שרף LR-לבן עשוי במקרים מסוימים לשנות אפיטופים רגישים יותר. אם האפיטופ היעד הוא רגיש לטמפרטורה, מתג LR-לבן עבור שרף LR-זהב. פולמור ב -25 °C (70 °F) תחת אור לבן, LR-Gold מציע שימור מצוין של epitopes תרמוסנסטיבי, אבל ידרוש רכישה של מנגנון פולמורציה מיוחד והוא קצת יותר רעיל אז LR-לבן.
שיטה זו שימשה על פני מגוון רחב של מינים ורקמות. זה מאפשר גישה מהירה למידע אמין על הפצת אפיטופ ספציפי. מציע נתונים תומכים למודלים אבולוציוניים וזיהוי סמנים והתאמות ספציפיות בתאים וברקמות תוך מתן תוצאות מפתות מבחינה ויזואלית. השימוש בנוגדנים הקשורים פלואורוכרומים על פני peroxidase או חלופות הטיה אלקלייןפוספטאז 10, הוא פחות זמן רב, באופן משמעותי פחות נוטה חפצים תגובת יתר ומספק רזולוציה תת תאית ברורה קשה להתאים עם כל טכניקה אחרת. השימוש בנוגדנים ספציפיים לפולימרים הקשורים לקיר התא מאפשר תובנה לגבי סידור תרכובות לתחומים מוגבלים מאוד. פתרון כזה יהיה מאתגר להשיג מכלים ביוכימיים מסורתיים. הקבוצה ההולכת ומתרחבת של נוגדנים ראשוניים הזמינים מציעה הזדמנויות גילוי חדשות מתמידות לתוך הפעילות הפנימית של תאי הצמח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
המחברים קיבלו תמיכה מפרויקט האיחוד האירופי 690946 'SexSeed' (רבייה של צמחים מיניים – היווצרות זרעים) במימון H2020-MSCA-RISE-2015 ו- SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. AMP קיבלה מענק מפרויקט MSCA-IF-2016 של האיחוד האירופי (מס' 753328). MC קיבלה מענק ממענק FCT PhD SFRH/BD/111781/2015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produced in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Absolute ethanol | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size should fit the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be cleaned with 96% ethanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms; the medium grade provides an adequate cutting support for most tissues, while for harder tissues a harder grade of LR-white may be recommendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please follow the instructions of the supplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| Upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| Vacuum chamber | na | na | |
| Vacuum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An anti-fade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
References
- Keegstra, K.
- Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues. Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).
- Showalter, A. Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).
- Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development. Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).
- Seifert, G., Roberts, K.
- Ruprecht, C., et al. A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
- Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy. Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).
- Osborn, M., Weber, K. Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures. Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).
- Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction. Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).
- Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto. Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).
- Coimbra, S., Salema, R. Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules. Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).
- Coimbra, S., Duarte, C. Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus. Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).
- El-Tantawy, A., et al. Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus. Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).
- Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae). Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).
- Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis. Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).
- Hibbs, A. R. Fluorescence Immunolabelling. Confocal Microscopy for Biologists. , Springer. Boston, MA. (2004).
- Johnson, G. D., et al. Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy. Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors. Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).
- Weber, G. F., Menko, A. S. Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes. BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).
