Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

منصة مختبر على رقاقة لتحفيز العظام Mechanotransduction وتحليل النتائج الوظيفية لإعادة عرض العظام

Published: May 21, 2020 doi: 10.3791/61076
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, The University of Akron

Summary

هنا، نقدم بروتوكولات لتحليل إعادة عرض العظام داخل منصة المختبر على رقاقة. يمكن إقران جهاز تحميل ميكانيكي مطبوع ثلاثي الأبعاد مع النظام الأساسي للحث على إحداث ميكانيكية العظام عن طريق تشويه المصفوفة الخلوية. ويمكن أيضا أن تستخدم منصة لتحديد العظام إعادة عرض النتائج الوظيفية من العظام والعظام (resorption / تشكيل).

Abstract

إعادة عرض العظام هي عملية منظمة بإحكام مطلوبة لنمو الهيكل العظمي والإصلاح بالإضافة إلى التكيف مع التغيرات في البيئة الميكانيكية. خلال هذه العملية, الخلايا العظمية الميشانوالحساسة تنظيم الاستجابات المتعارضة بين العظام تقويضي والعظام الابتنائية. لفهم أفضل لمسارات الإشارات المعقدة للغاية التي تنظم هذه العملية ، طور مختبرنا منصة أساسية للمختبر على رقاقة (LOC) لتحليل النتائج الوظيفية (تشكيل وارتشاف) لإعادة عرض العظام داخل نظام صغير الحجم. كما إعادة عرض العظام هي عملية طويلة التي تحدث على ترتيب أسابيع إلى أشهر، وضعنا بروتوكولات زراعة الخلايا على المدى الطويل داخل النظام. وتزرع الخلايا العظمية والعظام على ركائز النشاط الوظيفي داخل LOC والحفاظ عليها لمدة تصل إلى سبعة أسابيع. بعد ذلك ، تم تفكيك الرقائق للسماح بالقياس الكمي لتكوين العظام وارتشافها. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بتصميم جهاز تحميل ميكانيكي مطبوع ثلاثي الأبعاد يُزوج منصة LOC ويمكن استخدامه للحث على إحداث النخاع العظمي عن طريق تشويه المصفوفة الخلوية. لقد قمنا بتحسين بروتوكولات زراعة الخلايا لخلايا العظام، والعظام، والعظام داخل منصة LOC وعالجنا مخاوف العقم والسمية الخلوية. هنا، نقدم بروتوكولات لتصنيع وتعقيم LOC، وخلايا البذر على ركائز وظيفية، وحفز الحمل الميكانيكي، وتفكيك LOC لتحديد نتائج نقطة النهاية. ونحن نعتقد أن هذه التقنيات تضع الأساس لتطوير الجهاز الحقيقي على رقاقة لإعادة عرض العظام.

Introduction

العظام هو نسيج ديناميكي للغاية يتطلب تنسيقًا معقدًا بين أنواع الخلايا الرئيسية الثلاثة: الخلايا العظمية والعظام والعظام. التفاعلات متعددة الخلايا بين هذه الخلايا هي المسؤولة عن فقدان العظام التي تحدث أثناء الشلل والجمود على المدى الطويل وتشكيل العظام التي تحدث استجابة للنمو وممارسة الرياضة. الخلايا العظمية، نوع الخلية العظمية الأكثر وفرة، حساسة للغاية للمحفزات الميكانيكية المطبقة على العظام. التحفيز الميكانيكي يغير النشاط الأيضي للعظام ويؤدي إلى زيادة في جزيئات الإشارات الرئيسية1،2. من خلال هذه العملية، والمعروفة باسم mechanotransduction، يمكن تنسيق الخلايا العظمية مباشرة أنشطة العظام (خلايا تشكيل العظام) والعظام (خلايا العظام resorbing). الحفاظ على التوازن العظام يتطلب تنظيما محكما بين تكوين العظام ومعدلات امتصاص العظام; ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي الاضطرابات في هذه العملية إلى حالات المرض مثل هشاشة العظام أو هشاشة العظام.

تعقيد التفاعلات بين هذه الأنواع الثلاثة من الخلايا يفسح المجال للتحقيق باستخدام تقنيات microfluidic والمختبر على رقاقة (LOC). وتحقيقا لهذه الغاية، وقد أنشأت مختبرنا مؤخرا دليلا على مفهوم منصة LOC لتحليل ارتشاف العظام وتشكيل (النتائج الوظيفية) في عملية إعادة عرض العظام. يمكن استخدام المنصة لدراسة التفاعلات الخلوية ، وبيئات التحميل المتغيرة ، وفحص المخدرات التحقيقية. في السنوات الأخيرة، تم تطوير أجهزة ميكروولينيك مختلفة للتحقيق في مسارات الإشارات الجزيئية التي تنظم إعادة عرض العظام. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه الأنظمة تحدد إعادة عرض من خلال علامات غير مباشرة تدل على النشاط الوظيفي3،4،5،6،7. ميزة نظامنا هو أنه يمكن استخدامه للقياس الكمي المباشر للنتائج الوظيفية. إعادة عرض العظام هي عملية طويلة الأجل. على هذا النحو ، يتطلب التحديد الكمي المباشر لارتشاف العظام وتشكيلها نظامًا للزراعة يمكن الحفاظ عليه لمدة لا تقل عن عدة أسابيع إلى أشهر8،9،10،11. وهكذا، عند تطوير منصة LOC، أنشأنا بروتوكولات التبهي على المدى الطويل اللازمة لتشكيل وresorption والحفاظ على الخلايا داخل النظام لمدة تصل إلى سبعة أسابيع11. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بدمج ركائز الاستزراع المناسب لكلا النوعين من الخلايا في المنصة. تم استزراع العظام مباشرة على العظام ، وكانت الخلايا العظمية ، والتي تعرف أنها منالبلاستيك ، مُستزرعة على أقراص البوليسترين. وعلاوة على ذلك، تناولنا القضايا المتعلقة بالعقم، والسمية الخلايا على المدى الطويل والتفكيك رقاقة لإعادة عرض تحليل11،12.

ويمكن أيضا أن تستخدم منصة LOC للحث على mechanotransduction العظام من خلال تشوه مصفوفة. تم تطوير جهاز تحميل ميكانيكي مطبوع ثلاثي الأبعاد ليقترن بـ LOC ويطبق جهازًا ثابتًا خارج المستوى لتمتد الخلايا13. لاستيعاب هذا الحمل الميكانيكي ، تم زيادة عمق البئر داخل LOC. هذا الحجم الصغير، بسيطة جهاز تحميل الميكانيكية يمكن أن تنتج بسهولة من قبل مختبرات ذات خبرة هندسية محدودة، ونحن قد شارك سابقا رسومات من المكونات المطبوعة 3D13. في العمل الحالي ، نبين بعض التقنيات الجديدة اللازمة للاستخدام الناجح للLOC . ونحن نعتقد أن شرح هذه التقنيات تستفيد من شكل البصرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد قناع رقاقة

ملاحظة: الخطوات 1.1 - 1.3 تحتاج فقط إلى تنفيذها مرة واحدة عند الاستلام الأولي لقناع الشريحة. أنها تضمن القناع لا ينحني أثناء الاستخدام. تم وصف تصميم الأقنعة الدقيقة في السابق11،14. تم تصميم الأقنعة في المنزل وملفقة تجاريا باستخدام الاستريوغرافيا عالية الدقة(الشكل 1A).

  1. تغطية السطح العلوي للقناع مع الأغطية البلاستيكية لحماية هذا السطح من لاصقة. تأمين قناع رقاقة إلى ورقة الاكريليك بنفس الحجم باستخدام لاصق رذاذ. المشبك القطع معا بين عشية وضحاها للسماح لللاصقة لعلاج تماما. بعد أن يجف لاصق، إزالة الأغطية البلاستيكية من الجزء العلوي من القناع.
  2. إرفاق الجزء السفلي من ورقة الاكريليك إلى مربع التسوية المطبوعة 3D(الشكل التكميلي 1، الملفات التكميلية 1-4)باستخدام الشريط على الوجهين. اضغط بحزم لضمان وجود رابطة ضيقة.
  3. ختم أي فتحات صغيرة بالقرب من الجدار للانفصال من مربع التسوية مع تسرب للماء. السماح للتسرب لعلاج لمدة 24 ساعة.
  4. تنظيف سطح القناع مع الإيثانول 70٪ (EtOH). ضع مربع التسوية مع قناع الشريحة المطلوب في الفرن. استخدم منقلة رقمية لضمان مستوى الجزء العلوي من القناع. ضبط مسامير التسوية إذا لزم الأمر.

2. تصنيع PDMS

ملاحظة: يتم استخدام تصميم رقاقة ضحلة البئر (1 مم) للنشاط الوظيفي (التشكيل وإعادة الامتصاص) ، ويستخدم تصميم رقاقة عميقة البئر (10 مم) لدراسات التحميل الميكانيكية. يتم تشكيل الجزء السفلي من البئر العميق عن طريق إرفاق غشاء PDMS رقيقة منفصلة(الشكل 1B).

  1. طبقة الغطاء (الطبقة 1)
    1. الجمع بين 63 غرام من PDMS prepolymer و 6.3 غرام من عامل علاج (نسبة 10:1) في كوب من البلاستيك. مزيج شامل مع ملعقة الخلية المتاح وديغا في فراغ desiccator لمدة 30 دقيقة.
    2. صب الخليط ببطء في مربع التسوية المعدة. دع PDMS الجلوس لمدة 30 دقيقة ثم خبز في 45 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
    3. تخفيف حواف PDMS مع ملعقة مختبر مدبب وإزالة ورقة البوليمر من مربع التسوية.
    4. اقطع الأغطية الفردية إلى حجم (70 مم × 34 مم) باستخدام مشرط وقالب مطبوع ثلاثي الأبعاد.
    5. ثقوب الوصول لكمة من خلال كل غطاء مع لكمة خزعة (قطر 1 مم).
    6. سطح تنظيف الأغطية مع شريط التعبئة والتغليف.
      ملاحظة: إذا لم يتم استخدام الأغطية على الفور، قم بتغليف كل منها في شريط التعبئة والتغليف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. كذلك وطبقة القناة الدقيقة (طبقة 2)
    1. الجمع بين PDMS قبل البوليمر وكيل علاج (نسبة 10:1) في كوب من البلاستيك. تصميم بئر الضحلة يتطلب 43 غرام من قبل البوليمر و 4.3 غرام من عامل علاج، وتصميم عميق جيدا يتطلب 227 غرام من قبل البوليمر و 22.7 غرام من عامل علاج. تخلط البوليمر بقوة وديغا لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يفترض هذا بعد قناع 152.4 مم × 152.4 مم.
    2. صب الخليط ببطء على قناع مناسب قبل التسوية. دع PDMS الجلوس لمدة 30 دقيقة ثم خبز في 45 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
    3. تخفيف حواف PDMS مع ملعقة مختبر مدبب وقشر بعناية البوليمر بعيدا عن القناع. استخدم قالب مشرط و3D مطبوع لقطع رقائق الفردية.
      ملاحظة: بالنسبة لدراسات التحميل، من المهم أن تكون أبعاد الشريحة (70 × 34 مم) دقيقة وأن البئر يقع في وسط الشريحة.
    4. سطح تنظيف PDMS مع شريط التعبئة والتغليف.
      ملاحظة: إذا لم يتم استخدام الرقائق على الفور، قم بتغليف كل رقاقة في شريط التعبئة والتغليف وتخزينها في RT.
  3. غشاء PDMS رقيقة (طبقة 3)
    ملاحظة: يتم استخدام هذه الطبقة فقط لتصميم بئر عميق.
    1. إضافة 12.7 غرام من PDMS prepolymer و 1.3 غرام من عامل علاج (نسبة 10:1) إلى كوب من البلاستيك. تخلط بقوة وdegas لمدة 30 دقيقة.
    2. صب البوليمر ببطء في مربع التسوية المعدة وكشط تماما كوب من البلاستيك لإزالة أكبر قدر ممكن PDMS.
    3. استخدام ملعقة الخلية لنشر PDMS على سطح كامل.
      ملاحظة: إذا لم يتم نشر البوليمر يدوياً، سوف يكون التوتر السطحي كافياً لمنع البوليمر من تشكيل ورقة موحدة.
    4. دع PDMS الجلوس لمدة 30 دقيقة ثم خبز في 45 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
    5. تخفيف حواف PDMS مع ملعقة مدببة وإزالة ورقة PDMS بعناية من مربع التسوية. قطع الأغشية الفردية التي تتطابق مع أبعاد الطبقة 2.
    6. قياس سمك الغشاء في وسط الغشاء باستخدام الفرجار. تخلص من أي أغشية خارج السماكة المطلوبة (0.5 مم ± 0.1 مم).
    7. الأغشية نظيفة بعناية مع شريط التعبئة والتغليف ومكان على قطعة من فيلم البارافين.
      ملاحظة: إذا لم يتم استخدام الأغشية على الفور، قم بتغطية الجزء العلوي من الغشاء بشريط التعبئة والتغليف وتخزينها في RT.

3. ركائز النشاط الوظيفي

ملاحظة: يجب إرفاق أقراص البوليسترين ورقائق العظام إلى الجزء السفلي من الآبار التي سيتم استخدامها لثقافات العظام والعظام، على التوالي.

  1. أقراص البوليسترين(الشكل 1C)
    1. وضع شريط اخفاء على الجانب الخلفي من ثقافة الأنسجة المعالجة غطاء البوليسترين. قطع الأقراص الدائرية من الغطاء باستخدام شحذ الفلين بورر (قطر 5.4 ملم). غمر الأقراص في 70٪ EtOH وترك بين عشية وضحاها.
    2. فرك بلطف السطح العلوي من القرص مع قضيب القطن يميل غارقة في 70٪ EtOH. تأكد من تنظيف الحافة الخارجية للقرص تمامًا.
    3. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط، عقد القرص وإزالة إخفاء الشريط الدعم. ضع القرص الجانب المعالجة أسفل وتنظيف الجانب الخلفي مع قضيب القطن يميل.
    4. تراجع نهاية خشبية من قضيب القطن يميل في خليط degassed من PDMS uncured ووضع كمية صغيرة من البوليمر على الجزء السفلي من البئر المطلوب.
      ملاحظة: يمكن تخزين PDMS غير المعبّر المتبقية عند -20 درجة مئوية.
    5. ضع قرص البوليسترين، تعامل الجانب لأعلى، في البئر واضغط بلطف لأسفل على القرص مع مسحة القطن. تأكد من عدم اتصال PDMS غير المعمرة بالجانب المعالج من القرص.
      ملاحظة: إذا كان PDMS لا تأتي في اتصال مع السطح المعالج من القرص، إزالة القرص من البئر وتكرار الخطوات 3.1.4 و 3.1.5 مع قرص جديد.
    6. دع الشريحة تُجلس على سطح مستوي لمدة 30 دقيقة ثم تخبز على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 4 سه.
  2. رقائق العظام
    1. استخدم ملقط لوضع رقاقة عظمية (قطرها 6 مم، سمكها 0.4 مم) في الجزء السفلي من طبق 100 مم. عقد رقاقة ثابتة مع ملقط وحفر بلطف 'X' على الجزء الخلفي من رقاقة مع مشرط.
      ملاحظة: أثناء عملية التصوير، يتم استخدام "X" للتمييز بين الجزء الخلفي من الرقاقة والسطح الذي تم بذر الخلايا عليه.
    2. استخدام نهاية خشبية من قضيب القطن يميل لإضافة كمية صغيرة من PDMS uncured إلى الجزء السفلي من البئر المطلوب. ضع رقاقة العظام، ملحوظ الجانب إلى أسفل، في البئر واستخدام قضيب القطن يميل للضغط على رقاقة أسفل.
    3. دع الشريحة تُجلس على سطح مستوي لمدة 30 دقيقة ثم تخبز على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 4 سه.

4. رقاقة التجمع والتعقيم

  1. قم بتنشيط أسطح الطبقة 1 والطبقة 2 باستخدام منظف بلازما لمدة 30 ق باستخدام إعداد طاقة التردد الراديوي المتوسط (RF) (أي ما يعادل 10.2 واط تقريبًا).
  2. محاذاة ثقوب الوصول في طبقة 1 مع القنوات الدقيقة في طبقة 2 واضغط بحزم على طبقتين معا.
  3. لتصميم بئر عميق، كرر الخطوة 4.1 مع طبقة 2 وطبقة 3. أثناء معالجة البلازما، استخدم الشريط على الوجهين لإرفاق فيلم البارافين من الطبقة 3 إلى سطح مستو.
  4. استخدام مشرط لتقليم قبالة المواد الزائدة من غشاء PDMS. قشر بعناية بعيدا ورقة من فيلم البارافين من الجزء السفلي من رقاقة
  5. خبز رقاقة في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لزيادة قوة السندات بين طبقات PDMS.
  6. إدراج نصائح الاستغناء الزاوية (18 قياس، 0.5 في، 90 درجة) في ثقوب الوصول في الغطاء. تأمين نصائح الاستغناء عن الغطاء مع اثنين من جزء الايبوكسي. استخدام تلميح micropipette لتطبيق الايبوكسي حول كل نصيحة الاستغناء.
  7. بعد الايبوكسي قد شفي تماما، سطح تنظيف رقاقة مع 70٪ EtOH ووضعها في خزانة السلامة البيولوجية. تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
  8. قم بتوصيل حقنة 5 مل بنصائح الاستغناء عن أنابيب السيليكون المعقمة (معرف 1/32' ، ~ 10 سم في الطول) وملء الشريحة بأكملها مع 70٪ EtOH لمدة 30 s على الأقل. لتصميم بئر الضحلة، وإدارة جميع السوائل مع مضخة حقنة تعيين إلى معدل تدفق 4 مل / ساعة. لتصميم عميق جيدا، وإدارة جميع السوائل عن طريق الاستغناء ببطء الحقنة باليد.
  9. إزالة EtOH من رقاقة وتعقيم رقاقة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية بين عشية وضحاها.
  10. غسل رقاقة 3 مرات مع dH2O. ملء رقاقة مع dH2O، وإزالة أنابيب من نصائح الاستغناء واحتضان لمدة لا تقل عن 48 ساعة في 37 درجة مئوية.

5. تجميع جهاز التحميل الميكانيكي

ملاحظة: تم وصف عمليات التصميم والتصنيع لجهاز التحميل الميكانيكي المطبوع ثلاثي الأبعاد(الشكل 2A-C)مسبقًا وتم توفير جميع ملفات التصميم للمكونات المطبوعة مسبقًا13.

  1. أوتوكلاف جميع مكونات جهاز التحميل لمدة 30 دقيقة في 121 درجة مئوية.
    ملاحظة: لتجنب تزييف المكونات المطبوعة، قم بتغليف كل قطعة بشكل فردي في احباط ووضعها على سطح مستو صلب أثناء عملية الأوتوكلاف. يمكن لف الأجهزة المعدنية معا. أكمل جميع الخطوات اللاحقة داخل خزانة السلامة البيولوجية.
  2. وضع ربيع ضغط حول رمح من الصفائح وإدراج الصفائح في حفرة مركزية على الجزء السفلي من القاعدة(الشكل 2D).
  3. إرفاق كتلة الطلب إلى الجزء السفلي من القاعدة باستخدام أربعة مسامير التنصت الذاتي.
  4. وضع الربيع ضغط الثاني حول المسمار المركزي. أدخل المسمار في ثقب سداسي الشكل في الجزء السفلي من الطلب والمسمار الجمعية في ثقب مترابطة في وسط كتلة الطلب.
  5. المسمار أربع مواجهات بين الذكور والإناث في الجزء السفلي من القاعدة.
  6. قم بإزالة الركود من الجهاز عن طريق تحويل اتجاه عقارب الساعة إلى أن يكون الجزء العلوي من اللوحة أسفل الجزء العلوي من القاعدة. ثم بدوره ببطء في اتجاه عقارب الساعة حتى أعلى لوحة هو مستوى مع الجزء العلوي من القاعدة.

6- التجريب

ملاحظة: بروتوكولات لتجارب النشاط الوظيفي قدمت سابقا11،12.

  1. دراسات التحميل(الشكل 3)
    1. بعد الخطوة 4.9، استخدم حقنة 5 مل لإزالة dH2O من رقاقة بئر عميق. معطف الجزء السفلي من البئر مع 200 ميكرولتر من 0.15 ملغ / مل نوع الأول الكولاجين (CTI) في 0.02 M حمض الخليك لمدة 1 ساعة.
    2. شطف رقاقة ثلاث مرات مع دلبيكو الفوسفات المخزنة مؤقتا مع الكالسيوم والمغنيسيوم (DPBS ++).
    3. ضع رقاقة في حامل الشريحة والبذور مع MLO-Y4 العظام بكثافة 2 × 104 خلايا / مل في الحد الأدنى من متوسط ألفا الأساسية (MEMα) تكملها 5٪ مصل العجل، 5٪ مصل البقر الجنين، و 1٪ البنسلين / العقديات.
    4. إزالة الأنابيب من نصائح الاستغناء ووضع رقاقة في طبق ثقافة عميقة جيدا (150 ملم × 25 ملم). الخلايا المحتضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 72 ساعة.
    5. إرفاق أنابيب معقمة إلى نصائح الاستغناء واستخدام حقنة 5 مل لإزالة متوسط الثقافة المستهلكة من رقاقة. الاستغناء ببطء في الثقافة الجديدة المتوسطة لإعادة ملء رقاقة.
    6. ضع حامل الشريحة في الداخل المستطيل في الجزء العلوي من قاعدة جهاز التحميل. تغذية أنابيب من خلال فتحات تقع على غطاء جهاز التحميل وتأمين الغطاء إلى القاعدة مع أربعة مسامير رئيس عموم والمكسرات عرافة.
      ملاحظة: للتأكد من أن الغطاء لا يزال مستوى، تأمين أولاً اثنين من مسامير التي تقع قطرياً من بعضها البعض قبل تأمين مسامير المتبقية اثنين.
    7. تطبيق تحميل على الخلايا عن طريق تحويل الطلب في اتجاه عقارب الساعة حتى يتم الوصول إلى إزاحة الصفائح المطلوبة.
      ملاحظة: تم تصميم الجهاز بحيث دوران واحد من الطلب يعادل إزاحة لوحة من 1 مم. حقل سلالة ولدت على الجزء العلوي من غشاء PDMS كان سابقا على غرار وظيفة من الإزاحة الصفائح باستخدام تحليل العناصر المحدودة (FEA)13.
    8. ضع جهاز التحميل في مربع تلميح P1000 ميكروبيزيت فارغ. احتضان الخلايا مع الحمل المطبق لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: فترة التحميل الزمنية المستخدمة هنا بمثابة مثال. يمكن استخدام أوقات التحميل البديلة.
    9. بعد الحضانة، قم بإزالة الحمل من الخلايا عن طريق تحويل اتجاه عقارب الساعة إلى أن يعود الصفائح إلى موضع البداية الأصلي. قم بإزالة الغطاء من الجهاز ووضع حامل الشريحة في لوحة الثقافة العميقة. احتضان الخلايا لفترة استرداد تحميل آخر 90 دقيقة.
      ملاحظة: مرة أخرى، فترة الاسترداد الزمنية المستخدمة هنا بمثابة مثال. يمكن استخدام أوقات الاسترداد البديلة. للدراسات طويلة الأجل، تغذية الخلايا كل 72 ساعة.
    10. استخدم حقنة 5 مل لإزالة الوسط المكيف من الشريحة.
      ملاحظة: يمكن حفظ هذا الوسط وتخزينه عند -80 درجة مئوية.
    11. إزالة رقاقة من حامل رقاقة واستخدام ملعقة مدبب لكسر السندات بين غطاء PDMS وطبقة جيدا.
      ملاحظة: يمكن الآن تنفيذ المقالات الخلوية بعد أي بروتوكول تم إنشاؤه للوحة ثقافة الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن استخدام التكوين الضحل ة البئر لتحليل النشاط الوظيفي للعظام والعظام. تكوين العظام عن طريق العظام وارتشاف عبر العظام يتطلب أوقات التبهي على أمر عدة أسابيع إلى أشهر. تم قياس تكوين العظام من MC3T3-E1 قبل العظم باستخدام الأليسارين الأحمر وفون كوسا البقع11،15. في اليوم 49 ، كان متوسط مساحة السطح الملطخة باللون الأحمر الأليسارين 10.7٪ ± 2.2٪ (متوسط الأخطاء القياسية ± للمتوسط)11. كان متوسط مساحة السطح الملطخة فون كوسا 6.4٪ ± 1.6٪11. الشكل 4A يظهر نتائج التكوين النموذجي من الثقافات العظمية في اليوم 49 ملطخة العليزارين الأحمر وفون كوسا. تم قياس ارتشاف العظام من RAW264.7 ما قبل العظم باستخدام تلطيخ الأزرق التولويدين 11،15. في اليوم 30 كان متوسط مساحة السطح الملطخة بالأزرق التولويدين 30.4٪ ± 4.5٪11. الشكل 4B يظهر نتائج ارتشاف العظام النموذجية من ثقافات العظام الملطخة باللون الأزرق التولويدين في اليوم 30. تم إجراء المسح المجهري للإلكترون الضوئي للتحقق من وجود حفر ارتشاف. تظهر النتائج النموذجية في الشكل 4C. وتبين هذه النتائج أن الخلايا داخل الجهاز لا تزال قابلة للحياة ونشطة وظيفيا لمدة سبعة أسابيع على الأقل.

تم تصميم جهاز تحميل مطبوع ثلاثي الأبعاد وملفق لاستيعاب تكوين الشريحة العميقة. معا، يمكن لهذا النظام حث mechanotransduction العظام عن طريق تمتد الخلايا عن طريق الاستدانة خارج الطائرة. وقد ثبت أن احتضان 48 ساعة للرقاقة الموصوفة في الخطوة 4.9 عملية حاسمة للحفاظ على صلاحية الخلية ومورفولوجيا نموذجية. الشكل 5A يظهر الصور التمثيلية لخلايا العظام MLO-Y4 في 72 ساعة المصنفة في رقائق مع وبدون هذه الفترة الحضانة. خلال نوبات التحميل ، تعرضت الخلايا العظمية لتدرج الإجهاد الناجم عن غشاء PDMS الذي تم بذر الخلايا عليه(فيديو تكميلي 1). وقد تم تصميم السلالات المكافئة التي تم توليدها خلال هذه العملية مع FEA13 وتم تحديد متوسط السلالة المكافئة المنتجة على الجزء العلوي من غشاء PDMS. ويبين الشكل 5باء العلاقة بين متوسط الضغط المكافئ وإزاحة الصفائح للقيم بين 1 و2 ملم. وترد خريطة الحرارة التمثيلية لتدرج الإجهاد المستحث في الشكل 5C. في هذا المثال، أدى إزاحة الصفائح من 1.5 مم إلى توليد سلالة مكافئة متوسطها 12.29٪ على الجزء العلوي من الغشاء. هذا النموذج يدل أيضا على أن السلالات المستحثة بالقرب من مركز البئر منخفضة نسبيا وزيادة تدريجيا شعاعيا إلى الخارج، مع أقصى سلالات ولدت مباشرة فوق الحافة الخارجية للصفيحة. بعد التحميل ، تم تحليل صلاحية الخلية مع تلطيخ اللاكتات dehydrogenase وملحق V ومقاز الخليةالميتة 14،16. تظهر النتائج النموذجية في الشكل 5D، E، على التوالي.

Figure 1
الشكل 1: جهاز ميكروووسيك. (أ)تلفيق وتسوية قناع الشريحة. (يسار) التخطيطية للقناع رقاقة عميقة جيدا التي تم تصميمها في المنزل باستخدام برنامج كندي. (وسط) صورة لقناع الشريحة العميقة التي تم طباعتها تجاريًا باستخدام تصوير مجسم عالي الدقة. (يمين) يتم وضع القناع داخل مربع التسوية المطبوعة 3D لضمان بقاء مستوى القناع أثناء صب الطبقة 2 من الرقائق. (ب)الرسومات التخطيطية للتصاميم الضحلة البئر وعميقة البئر للجهاز. (الأعلى) تم استخدام تصميم البئر الضحلة لتحليل النشاط الوظيفي (تشكيل وارتشاف) من العظام والعظام. يتم تشكيل هذا التكوين من طبقتين PDMS. تم تأمين ركيزة النشاط الوظيفي إلى الجزء السفلي من الثقافة قبل إغلاق الطبقات معا. واستخدمت أقراص البوليسترين ورقائق العظام لثقافات العظام والعظام، على التوالي. (أسفل) تم استخدام تصميم البئر العميق لتطبيق الحمل الميكانيكي على الخلايا العظمية. يتكون هذا التكوين من ثلاث طبقات PDMS. يتم تشكيل الجزء السفلي من الثقافة بشكل جيد من قبل غشاء PDMS المشوه (الطبقة 3). (C)خطوات التصنيع لقرص البوليسترين المستخدمة لثقافات العظام. تم وضع علامة على الجزء الخلفي من ثقافة الأنسجة المعالجة coverslip مع اخفاء الشريط. تم قطع أقراص فردية مع الفلين borer. تم تنظيف القرص مع الإيثانول ومسحة القطن. تمت إزالة دعم الشريط وإرفاق القرص إلى الجزء السفلي من ثقافة PDMS بشكل جيد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تصميم وتجميع جهاز التحميل الميكانيكي. (أ)صورة لجهاز التحميل الميكانيكي المجمع. عندما يقترن تصميم عميق جيدا من رقاقة PDMS، وجهاز التحميل تمتد الخلايا عن طريق تطبيق من انتفاخ الطائرة إلى غشاء تشوه. (ب)انفجرت عرض الجهاز. جميع الأجزاء المعروضة باللون الأزرق كانت مطبوعة ثلاثية الأبعاد مع خيوط حمض البولي لاكتيك مقاومة للحرارة. جميع الأجهزة هي الفولاذ المقاوم للصدأ. (C)المسمار جاك آلية جهاز التحميل. دوران المسمار المركزي (البرتقالي) يدفع الصفائح (الأخضر) إلى الأعلى من خلال القاعدة. الحركة التصاعدية للصفيحة تشوه غشاء PDMS من رقاقة عميقة البئر التي تم بذر الخلايا. (D)عملية التجميع لجهاز التحميل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تجربة التحميل الميكانيكية. تم إدارة جميع السوائل وإزالتها من الشريحة باستخدام حقنة 5 مل متصلة بأنابيب الوصول. خطوة حاسمة في هذه العملية هي الحضانة 48 ساعة مع الماء المقطر المعقم قبل البذر الخلية. بدون هذه الخلايا الحضانة أظهرت انخفاض الجدوى ومورفولوجيا غير نمطية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: نتائج النشاط الوظيفي النموذجي. (أ)نتائج التشكيل النموذجية الملطخة بالعليزارين الأحمر (يسار) وفون كوسا (يمين) من ثقافات MC3T3-E1 المستحثة في اليوم 49. صور القرص كله قياس 5.4 ملم في القطر. (ب)نموذجي ة العظام resorption النتائج من RAW264.7 preosteoclasts المستحثة مع مستقبلات المنشط من عامل نووي كابا-B ليغاند (رانكل). تم استزراع الخلايا على رقائق العظام وملطخة باللون الأزرق التولويدين في اليوم 30. (C)نموذجي المسح الضوئي الإلكترون المجهري الصور التحقق من وجود حفر ارتشاف على رقائق العظام. يمثل شريط المقياس في الصورة العليا 200 ميكرومتر ويمثل شريط المقياس في الصورة Please click here to view a larger version of this figure. السفلية 50 ميكرومتر.

Figure 5
الشكل 5: آثار الضغط الناجم ميكانيكيا على الخلايا العظمية. (أ)صور من الخلايا العظمية MLO-Y4 في 72 ساعة في رقاقة عميقة البئر ملفقة مع (يسار) وبدون (يمين) حضانة 48 ح مع الماء المقطر قبل البذر الخلية. (ب)تم استخدام تحليل العناصر المحدودة لنمذجة متوسط السلالة المكافئة المتولدة على الجزء العلوي من غشاء PDMS المشوه استنادًا إلى إزاحة لوحة جهاز التحميل. تظهر نتائج عمليات الإزاحة بين 1.0 مم و2.0 مم. (C)خريطة الحرارة من التدرج سلالة على غرار المستحثة على غشاء PDMS لإزاحة الصفائح من 1.5 ملم.(D)النتائج النموذجية لبقعة ديهيدروجيناز اللاكتات من الخلايا العظمية الناجمة عن المخدرات التي امتدت باستخدام إزاحة الصفائح 1.5 ملم. لوحظ تلطيخ خلية أخف بالقرب من الحافة الخارجية للبئر ، والتي تتوافق مع موقع قيم السلالة الأعلى التي تدل على تلف الخلايا و / أو الموت. (E)نتائج قياس الخلايا التدفق التمثيلي للموت المبكّر الناجم عن التحميل المشار إليها بواسطة ملحق V والقول بالخلايا الميتة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Supplementary Figure 1
الشكل التكميلي 1: مربع التسوية المطبوعة ثلاثية الأبعاد مع جدار قابل للفصل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف تكميلي 1: تسوية مربع كندي الملف 1. يرجى الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر على الحق للتحميل).

ملف تكميلي 2: تسوية مربع كندي الملف 2. يرجى الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر على الحق للتحميل).

ملف تكميلي 3: تسوية مربع كندي الملف 3. يرجى الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر على الحق للتحميل).

ملف تكميلي 4: تسوية قائمة أجهزة مربع. يرجى الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر على الحق للتحميل).

Supplementary Video 1
فيديو تكميلي 1: جهاز التحميل الميكانيكي. يرجى الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر على الحق للتحميل).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تصف هذه المقالة الأسس لتلفيق منصة LOC لإعادة عرض العظام لاستزراع الخلايا العظمية والعظام والعظام. عن طريق تغيير عمق وحجم البئر داخل الشريحة ، تم تطوير تكوينات متعددة لتحفيز العظام مع الحمل الميكانيكي وتحديد النتائج الوظيفية لإعادة عرض العظام(الشكل 1B).

أثناء تجميع رقاقة، كان تحسين بروتوكول أكسدة البلازما حاسمة للقضاء على المخاوف التسرب. وجدنا أن تعريض أسطح PDMS إلى 30 ثانية من بلازما الأكسجين التي تم إنشاؤها باستخدام إعداد طاقة تردد متوسط (الخطوة 4.1) ، أي ما يعادل 10.2 W تقريبًا ، كان كافيًا لإنشاء رابطة قوية بين الطبقات. وانخفضت سلامة السند عند استخدام أوقات التعرض الأطول أو إعداد طاقة RF أعلى. وهذا يتسق مع التقارير السابقة التي لاحظت التعرض المفرط لPDMS لالبلازما الأكسجين زيادة خشونة السطح وانخفاضلاصق17,18.

بالإضافة إلى ذلك، كان الحفاظ على صلاحية الخلية العالية ومورفولوجيا الخلايا النموذجية تعتمد بشكل حاسم على عملية علاج PDMS. يتكون بوليمر PDMS من ثنائي ميثيل سيلانزان ثنائي القلة. تعتمد عملية الربط المتبادل هذه على الوقت ودرجة الحرارة على حد سواء. ومع ذلك ، حتى مع علاج واسع النطاق البوليمر يفشل في البلمرة تماما19. وقد ثبت أن القلة المتبقية تتسرب من البوليمر السائب في وسط ثقافة الخلايا المحيطة بها، بل تم العثور عليها في أغشية الخلايا المزروعة على سطح البوليمر20. وقد أبلغت عدة مجموعات آثار السمية الخلايا من غير مترابطة PDMS oligomers21,22,23. لمعالجة هذا القلق في نظامنا، قمنا بتحسين عملية علاج PDMS. على الرغم من أن معدل علاج PDMS يعتمد على درجة الحرارة ، إلا أن الخصائص المادية لأقنعة الشريحة لدينا قيدت درجة حرارة المعالجة لدينا إلى 45 درجة مئوية. على هذا النحو ، قررنا أنه يجب خبز الرقائق لمدة لا تقل عن 18 ساعة. علاوة على ذلك ، وجدنا أن رقائق الحضانة مع dH2O لمدة 48 ساعة على الأقل قبل بذر الخلايا (الخطوة 4.9) كان ضروريًا للحد من الآثار السامة للخلايا. الشكل 5A يظهر MLO-Y4 العظام المستزرعة في رقائق مع وبدون هذه الفترة الحضانة.

يتطلب التكوين العميق البئر ، الذي تم تصميمه لاستيعاب تطبيق التحميل الميكانيكي ، أن تكون الشريحة ملفقة من ثلاث طبقات منفصلة. على عكس التكوين الضحلة جيدا، وتصنيع أجزاء البئر والغشاء كقطعة واحدة لتكوين عميق بئر تسبب في الغشاء للاعوجاج. قد يكون هذا بسبب الفرق في معدلات العلاج بين أجزاء سميكة ورقيقة من رقاقة. للتغلب على هذه المشكلة ، تم بناء طبقة الغشاء بشكل منفصل والمستعبدين إلى الجزء السفلي من الشريحة بعد عملية المعالجة. لتوليد طبقة غشاء منفصلة مع سمك موحد، فمن الأهمية بمكان أن يكون مربع التسوية مستوى تماما قبل إضافة PDMS (الخطوة 1.4). على هذا النحو ، يوصى باستخدام منقلة رقمية لضمان درجة عالية من الدقة. بالإضافة إلى ذلك، خلال الخطوة 2.3.2، من الضروري إزالة PDMS أكبر قدر ممكن من كوب البلاستيك. التناقضات في هذه الخطوة سوف يؤدي إلى انحرافات عالية في سمك الغشاء، والانحرافات العالية في نهاية المطاف في سلالة الركيزة المتوسطة المستخدمة للحث على mechanotransduction العظام.

توفر منصة إعادة عرض العظام لدينا درجة عالية من التنوع. يمكن استخدام هذا النظام للتحقيق في مجموعة متنوعة من العوامل التي تنظم إعادة عرض العظام ، مثل الميكانويلوترانسترانستيون الناجم عن الحمل ، أو الإشارات متعددة الخلايا ، أو الالتهاب ، أو آثار الدواء. على سبيل المثال ، تم استخدام النظام لتحليل الآثار المشتركة للحمل الميكانيكي والالتهاب على إعادة عرض العظام في بيئة مستحثة على المخدرات14. تم تطبيق الحمل الميكانيكي على الخلايا العظمية المعالجة بالبيسفوسفونات. كشف تحليل البروتين للوسط المكيف عن زيادة كبيرة في مستويات اللبتين والعظم والعظم وانخفاض كبير في مستويات CCL21 و CD36 بالمقارنة مع الخلايا العظمية التي لم يتم تحميلها ميكانيكيا14.

توفر البروتوكولات المعروضة هنا أساسًا لاستزراع كل نوع خلية داخل LOC بالإضافة إلى طرق لتحفيز الحمل الميكانيكي وقياس النشاط الوظيفي. المضي قدما، ونحن نعمل نحو عضو العظام الحقيقي على رقاقة. بالإضافة إلى ذلك، نعتقد أن استخدام نظامنا لتطوير أنظمة النمذجة الرياضية يمكن أن يعزز إلى حد كبير فهمنا لعمليات الإشارات المتعددة الخلايا المعقدة التي تنظم إعادة عرض العظام24،25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعمت هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم بموجب رقم المنحة (CBET 1060990 وEBMS 1700299). كما تستند هذه المواد إلى العمل الذي يدعمه برنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم بموجب المنحة رقم (2018250692). أي آراء أو استنتاجات أو استنتاجات أو توصيات يتم التعبير عنها في هذه المواد هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر المؤسسة الوطنية للعلوم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylic sheet Optix -- 3.175 mm thick
Angled dispensing tips Jensen Global JG18-0.5X-90 Remove plastic connector prior to use
Biopsy punch Robbins Instruments RBP-10 1 mm diameter
Bone wafers Boneslices.com 0.4 mm thick Bovine cortical bone
Bovine calf serum Hyclone SH30072
Calipers Global Industrial T9F534164
Cell spatula TPP 99010
Chip mask ProtoLabs Custom-designed Print material: Accura SL 5530
Cork borer Fisher Scientific 07-865-10B
Cotton tipped applicator Puritan 806-WCL
Culture dish (100 mm) Corning 430591 Sterile, Non-tissue culture treated
Culture dish (150 mm) Corning 430597 Sterile, Non-tissue culture treated
Double sided tape 3M Company Scotch 237
Fetal bovine serum Hyclone SH30910
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Leveling box Custom-made -- 3D printed
Masking tape 3M Company Scoth 2600
MC3T3-E1 preosteoblasts ATCC CRL-2593 Subclone 4
Mechanical loading device Custom-made -- 3D printed
Minimum essential alpha medium Gibco 12571-063
MLO-Y4 osteocytes -- -- Gift from Dr. Lynda Bonewald
Packaging tape Duck Brand -- Standard packaging tape
Paraffin film Bemis Parafilm PM999
Penicillin/streptomycin Invitrogen p4333
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 Expanded plasma cleaner
Polydimethylsiloxane kit Dow Corning Sylgard 184
Polystyrene coverslips Nunc Thermanox 174942 Sterile, tissue culture treated
Oven Quincy Lab 12-180
RAW264.7 preosteoclasts ATCC TIB-71
Scalpel BD Medical 372611
Silicone tubing Saint-Gobain Tygon ABW00001 ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm)
SolidWorks software Dassault Systèmes -- Used to generate 3D printed models and perform FEA
Spray adhesive Loctite 2323879 Multi-purpose adhesive
Syringe (5 ml) BD Medical 309646 Sterile
Syringe pump Harvard Apparatus 70-2213 Pump 11 Pico Plus
Tapered laboratory spatula Fisher Scientific 21-401-10
Two-part expoxy Loctite 1395391 5 minute quick set
Type I collagen Corning 354236 Rat tail collagen
Vacuum desiccator Bel-Art F42010-0000
Waterproof sealant Gorilla 8090001 100% silicone sealant

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
  2. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  3. Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
  4. Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
  5. Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).
  6. Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
  7. Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).
  8. Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).
  9. Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
  10. Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
  11. George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
  12. Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , In review (2019).
  13. Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
  14. George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
  15. George, E. L. Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , University of Akron. (2019).
  16. York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
  17. Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
  18. Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
  19. Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
  20. Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
  21. Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
  22. Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
  23. Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
  24. Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
  25. Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 159، مختبر على رقاقة، إعادة عرض العظام، Mechanotransduction، تكوين العظام، ارتشاف العظام، العظام، العظام، العظام، العظام، العظام، العظام
منصة مختبر على رقاقة لتحفيز العظام Mechanotransduction وتحليل النتائج الوظيفية لإعادة عرض العظام
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Truesdell, S. L., George, E. L., Van … More

Truesdell, S. L., George, E. L., Van Vranken, C. C., Saunders, M. M. A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling. J. Vis. Exp. (159), e61076, doi:10.3791/61076 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter