Summary
여기서, 우리는 배아 줄기 세포에서 뉴런으로 빠르고 효율적인 분화를 지시하는 저렴한 비용과 조작하기 쉬운 방법을 설립했습니다. 이 방법은 실험실 간의 대중화에 적합하며 신경 학적 연구를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다.
Abstract
마우스 배아 줄기 세포 (mESC)의 신경 분화는 신경 발생에 관련 되 고 잠재적으로 재생 의학에 도움이 되는 주요 메커니즘을 해명 하기 위한 잠재적인 도구. 여기서 는 편생스크리닝 전략을사용하여 체외에서 mESC로부터 뉴런 분화를 위한 효율적이고 저렴한 비용 방법을 확립했습니다. 여기에 정의된 조건하에서, 2일 배아 체형성 + 6일 망막산 유도 프로토콜은 잘 쌓인 및 중성염과 같은 A2lox 및 129개의 유도체의 형성에 의해 볼 수 있듯이 mESC에서 신경 전구체 세포(NPC)로 빠르고 효율적인 분화를 허용합니다. 배아 체의 건강한 상태와 레티노산(RA)이 적용되는 시점뿐만 아니라 RA 농도는 이 과정에서 매우 중요합니다. NPC에서 뉴런으로 의 후속 분화에서, N2B27 중간 II (신경 물질 매체에 의해 보충) 더 나은 장기 유지 보수 및 신경 세포의 성숙을 지원할 수 있습니다. 제시된 방법은 매우 효율적이고, 비용이 낮으며, 작동이 용이하며, 신경생물학 및 발달 생물학 연구를 위한 강력한 도구가 될 수 있습니다.
Introduction
배아 줄기 세포 (ESC)는 다능하며 신경 전구체 세포 (NPC)로 분화하고 특정 조건1하에서뉴런으로 분화 할 수 있습니다. ESC 기반 신경 발생은 신경 발생을 모방하는 최고의 플랫폼을 제공하므로 발달 생물학 연구를위한 유용한 도구로 봉사하고 잠재적으로 재생 의학2,3에도움이됩니다. 지난 수십 년 동안, 형질전환법(4)과 같은 배아 신경발생을 유도하기 위한 많은 전략이 보고되었으며, 소분자5를이용하여, 3D 매트릭스 마이크로환경6,공동배양기술7을이용하여 보고되었다. 그러나 이러한 프로토콜의 대부분은 조건이 제한적이거나 작동하기 어렵기 때문에 대부분의 실험실에서 의사용에 적합하지 않습니다.
mESC로부터 효율적인 신경 분화를 달성하기 위한 조작이 용이하고 저렴한 방법을 찾기 위해, 여기에 조합 선별 전략이 사용되었습니다. 도 1에설명된 바와 같이, 배아 신경 발생의 전체 과정은 2단계로 나뉘었다. 1단계는 MESC에서 NPC로의 분화 과정을 말하며, 위상 II는 NPC에서 뉴런으로의 후속 분화와 관련이 있습니다. 간편한 작동, 저렴한 비용, 용이한 재료 및 높은 분화 효율의 원리에 기초하여, 단계 I의 7개의 프로토콜과 단계 II의 3개의 프로토콜은 전통적인 부착단 단층 배양 시스템 또는 배아 체형성 시스템8,9에기초하여 선택되었다. 두 단계에서 프로토콜의 분화 효율은 세포 형태 관찰 및 면역 형광 분석을 사용하여 평가되었다. 각 단계에서 가장 효율적인 프로토콜을 결합하여 mESC에서 신경 분화를 위한 최적화된 방법을 수립했습니다.
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Protocol
1. 마우스 배아 줄기 세포 배양
- 0.1% 젤라틴 코팅 세포 배양 접시 또는 접시를 준비하십시오.
- 멸균 된 0.1 % 젤라틴 (물에서 0.1 % w / v)의 2 mL을 60mm 세포 배양 접시에 추가하십시오. 셀 배양 접시의 코팅도 보장하기 위해 부드럽게 흔들어.
- 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 접시를 넣고 1시간 동안 코팅할 수 있습니다.
- 세포를 파종하기 전에 0.1% 젤라틴 용액을 제거합니다.
참고: 젤라틴을 제거한 후에는 코팅된 접시를 말리거나 씻을 필요가 없습니다.
- 마우스 배아 줄기 세포 (A2lox 및 129) 배양
- 인큐베이트 mESC(A2lox 및 129) 세포에서 0.1% 젤라틴 코팅 60 mm 세포 배양 식 에서 mESC 성장 배지에서 37°C에서 각각 5%CO2 인큐베이터에. mESC 성장 매체는 85% 노크 아웃 DMEM/F12, 15% 녹아웃 세럼 교체(KSR), 0.1mM β-메르카토에탄올(2ME), 2mM 글루타맥스, 1% 비필수 아미노산 (NEAA), 1 % 페니실린 / 연쇄 상피신 (P / S), 1000 U / mL 백혈병 억제 인자 (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3 억제제) 및 0.33 nM PD032590 (MEK 억제제).
주의: β-메르카토에탄올은 인화성이며 흡입 독성이 있습니다. 화재 원인에서 멀리 하고 사용 시 흡입을 피하기 위해 마스크를 착용하십시오. - A2lox와 129의 더 나은 성장을 위해 매일 mESC 성장 매체를 변경합니다.
- 세포가 80%에 도달하면 배지를 제거하고 접시에 0.1% 트립신1mL을 추가합니다. 모든 셀에 트립신의 커버를 보장하기 위해 부드럽게 30 s에 대한 바위.
- 약 1 분 동안 세포를 두고 트립신이활성화한 다음 1 mL 파이펫을 사용하여 트립신을 제거하십시오.
- 접시에 mESC 성장 배지 2mL을 추가하고, 파이펫을 여러 번 위아래로 사용하여 단일 셀 서스펜션을 만듭니다.
- 혈종계를 사용하여 현탁액내 의 세포 밀도를 가능한 한 정확하게 계산합니다.
- 세포를 7그룹으로 나누고 표 1에표시된 다른 프로토콜을 사용하여 분화를 유도한다.
- 인큐베이트 mESC(A2lox 및 129) 세포에서 0.1% 젤라틴 코팅 60 mm 세포 배양 식 에서 mESC 성장 배지에서 37°C에서 각각 5%CO2 인큐베이터에. mESC 성장 매체는 85% 노크 아웃 DMEM/F12, 15% 녹아웃 세럼 교체(KSR), 0.1mM β-메르카토에탄올(2ME), 2mM 글루타맥스, 1% 비필수 아미노산 (NEAA), 1 % 페니실린 / 연쇄 상피신 (P / S), 1000 U / mL 백혈병 억제 인자 (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3 억제제) 및 0.33 nM PD032590 (MEK 억제제).
2. MESC에서 NPC로의 차별화 (1단계)
- 0.1% 젤라틴 코팅 세포 배양 플레이트 또는 커버립을 준비합니다.
- 사용하기 전에 1.1 단계에서와 같이 0.1 % 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트 또는 커버립을 준비하십시오.
- 프로토콜 1을 사용하여 단계 I 분화(표 1)
- 약 2 x 104 mESC를 기초 분화 배지 의 2 mL에 씨를 뿌리고 0.1 % 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에서 잘 합니다. 현미경의 밑에 세포 조밀도를 확인하십시오.
- 부착을 허용하기 위해 6h에 대해 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 세포를 배양한다.
- 부착 후 인큐베이터에서 세포를 꺼내 PBS 2 mL로 두 번 씻어 내십시오.
- 기초 분화 배지I(표 1)의2mL을 각 웰에 넣고 세포를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
- 8 일 동안 분화를 위해 세포를 둡니다. 2일마다 기저 분분 매체 I를 교체하십시오.
- 프로토콜 2를 사용하여 단계 I 분화(표 1)
- 1.5 x 106 mESC를 기초 분화 배지 10mL에 첨가하여 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배아 체형성을 허용합니다.
- 2 일 후, 15 mL 원심 분리 튜브로 세포 응고를 전송하고 중력에 의해 정착할 수 있습니다.
- 상체를 제거하고 신선한 기초 분화 배지 10mL를 추가하여 배아 체를 재보습합니다. 새로운 미각 세균 성 접시에 그들을 심고 또 다른 2 일 동안 차별화를 허용.
- 현미경(도 2A)하에서배아체의 형성을 확인한다.
- 단계 2.3.2-2.3.3에 설명된 바와 같이 배아 체를 수집한다. 약 50개의 배아체를 기초 분화 배지의 2mL로 약 50개의 배아체를 잘 하여 0.1% 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 시드한다.
- 1mM 올트랜스 RA 스톡(DMSO)을 준비하고 서브 패키징 후 -80°C 냉동고에 빛으로부터 멀리 보관하십시오.
참고: RA는 불안정하며 RA 재고를 준비하는 동안 빛을 멀리하고 공기 접촉을 줄이는 데 주의를 기울여야 합니다. - RA 유도의 경우, RA 스톡 2μL을 각 웰에 추가하여 1 μM의 최종 농도를 만듭니다.
- 플레이트를 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에 넣고 또 다른 4일 동안 분화한다.
- 2일마다 기초 분화 매체 I(1 μM RA)의 전체 2mL를 변경합니다.
- 프로토콜 3을 사용하여 단계 I 분화(표 1)
- 식물 1.5 x 106 mESC는 10mL의 기초 분화 배지에서 미적 세균 성 접시에 들어가면 5 % CO2 인큐베이터에서 37 °C에서 배아 체 형성을 위해 2 일 동안 둡니다.
- 현미경(도 2B)하에서배아체의 형성을 확인한다.
- 세포 응집체를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 중력에 의해 정착하게 합니다.
- 상체를 조심스럽게 제거하고 신선한 기초 분화 매체 10 mL을 추가하여 다시 일시 중단합니다.
- 약 50개의 배아체를 기초 분화 배지 의 2mL로 약 50개의 배아체를 잘 하여 0.1% 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 시드한다.
- RA 유도의 경우, RA 스톡 2μL을 각 웰에 추가하여 1 μM의 최종 농도를 만듭니다.
- 플레이트를 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에 넣고 6일 동안 분화한다. 전체 기저 분분 매체 I(1 μM RA)를 2일마다 변경합니다.
- 프로토콜 4를 사용하여 단계 I 분화(표 1)
- 약 2 x 104 mESC를 기초 분화 배지 의 2 mL 내에서 종자 0.1% 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 잘. 플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 넣고 6h에 부착할 수 있도록 합니다.
- 부착 후 PBS 2mL로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 각 웰에 2mL의 기초 분화 배지 I를 추가하고 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 4일 동안 분화를 허용한다.
- RA 유도의 경우, 각 우물(작동 농도는 1 μM)에 2 μL의 모든 트랜스 RA 스톡을 추가하여 또 다른 4일 동안 분화를 유도합니다.
- 전체 공정에서 2일마다 전체 매체를 교체하십시오.
- 프로토콜 5를 사용하여 단계 I 분화(표 1)
- 약 2 x 104 mESC를 기초 분화 배지 의 2 mL 내에서 종자 0.1% 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 잘. 플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 넣고 6h에 부착할 수 있도록 합니다.
- PBS의 2mL로 세포를 두 번 씻으시면 됩니다. 각 웰에 2mL의 기초 분화 배지 I를 추가하고 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 2일 동안 분화를 허용한다.
- 후속 RA 유도의 경우, 각 우물에 2 μL의 RA 스톡을 추가하여 1 μM의 최종 농도를 만듭니다. 플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 배치하여 또 다른 6일 동안 분화를 유도한다.
- 전체 공정에서 2일마다 전체 매체를 교체하십시오.
- 프로토콜 6을 사용하여 단계 I 분화(표 1)
- 식물 1.5 x 106 mESC는 배아 체 형성을 허용하기 위해 N2B27 중간 II(표 1)의10 mL에서 미적 세균 성 접시에 들어간다.
- 2일째에, 2.3.2-2.3.3 단계에 설명된 바와 같이 세포 응집체를 수집하고 신선한 N2B27 배지 II의 10mL를 사용하여 배아 체를 재연한다.
- 새로운 미동세균 접시에 이식하고 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에서 2일 동안 분화를 허용한다. 현미경의 밑에 태아 바디의 대형을 확인하십시오.
- 4일째되는 날, 배아시체를 수집합니다. N2B27 배지 II의 2mL를 가진 0.1% 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 잘 당 약 50개의 배아 체를 시드한다.
- 모든 트랜스 RA 스톡 2 μL을 각 우물에 넣고 또 다른 4일 동안 분화를 유도합니다. 전체 배지(N2B27 배지 II를 1μM RA로)를 2일마다 교체합니다.
- 프로토콜 7을 사용하여 단계 I 분화(표 1)
- 약 2 x 104 mESC를 기초 분화 배지 의 2 mL 내에서 종자 0.1% 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 잘. 플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 넣고 6h에 부착할 수 있도록 합니다.
- PBS로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 이어서, N2B27 배지 II의 2mL를 각 웰에 추가하고 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 8일 동안 분화를 허용한다.
- 2일마다 전체 N2B27 중간 II를 변경합니다.
3. 세포 형태 관찰
- 반전 된 상 대비 빛 현미경에서 매일 위에서 언급 한 7 그룹의 분화 상태를 확인합니다.
- 무작위로 최소 12개의 필드를 선택하고 사진을 찍어 D8에서 각 그룹의 형태학적 변화를 기록합니다.
4. 면역 형광 염색
- 샘플 준비: 종자 mESC0.1% 젤라틴 코팅 커버립에 2단계에서 언급된 프로토콜을 사용하여 8일 동안 분화를 허용한다.
- 린세:8일째에 인큐베이터에서 샘플을 꺼내 포부로 분화 매체를 제거합니다. 부드럽게 5 분 동안 PBS의 1 mL로 한 번 세포를 헹구십시오.
- 고정: 각 샘플에 4% 파라포름알데히드 1mL을 추가하고 실온(RT)에서 20분 동안 셀을 수정합니다.
- 헹구기: 고정 후, PBS 의 1 mL로 세포를 3번 부드럽게 헹구고, 각각 5분 동안 헹구십시오.
- 침투성: PBS에 0.2% TritonX-100의 1mL을 각 샘플에 추가하고 RT에서 8분 동안 둡니다.
- 헹구기: 투과화 후, PBS 3회 1mL로 세포를 부드럽게 헹구고 각각 5분간 헹구십시오.
- 차단: PBS에 1mL의 염소 세럼을 각 샘플에 추가하고 RT에서 1h에 인큐베이션하여 비특이적 상호 작용을 차단합니다.
- 1차 항체를 가진 배양
- PBS에서 5% 염소 세럼을 사용하여 1:100의 비율로 항 네스티닌 항체를 희석시.
- 희석 된 항체의 500 μL을 다른 샘플에 적용하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
- 헹구기: 항체를 제거하고 각각 8분 동안 PBS 3회 1mL로 시료를 부드럽게 헹구십시오.
- 이차 항체를 가진 배양
- PBS에서 5% 염소 세럼을 사용하여 알렉사 플루어 488 라벨 염소 안티 마우스 IgG의 비율로 희석 1:500.
- 희석 된 항체의 500 μL을 다른 샘플에 적용하고 RT에서 2 시간 동안 어둠 속에서 배양하십시오.
참고: 형광 이차 항체를 적용한 후, 형광 담금질을 방지하기 위해 어둠 속에서 모든 후속 단계를 수행합니다.
- 헹구기: 이차 항체를 제거하고 각각 8분 동안 PBS 3회 1mL로 시료를 부드럽게 헹구십시오.
- 핵 염색 및 장착
- DAPI 마운팅 배지 1방울을 깨끗한 마이크로슬라이드에 놓습니다.
- 조심스럽게 플레이트에서 샘플을 꺼내 서 아래로 셀을 가진 DAPI 장착 매체위에 샘플을 배치. RT에서 5 분 동안 어둠 속에서 둡니다.
- 흡수성 용지로 과도한 DAPI 마운팅 매체를 제거합니다.
- 형광 현미경 검사기 관찰
- 형광 현미경 검사의 밑에 표본을 놓고 적당한 필터를 사용하여 DAPI와 알렉사 플루올48에 대한 신호를 검출합니다.
- 각 샘플에 대해 10-15개의 서로 다른 시각적 필드를 고르고 무작위로 선택하고 CCD 카메라로 이미지를 기록합니다.
5. NPC에서 뉴런으로의 차별화 (단계 II)
- 가장 높은 차별화 효율을 가지는 단계 2.4에 상세한 프로토콜 3(8일, 표 1)을사용하여 단계 I 분화 하에서 mESC 유도체를 준비합니다(그림 3참조).
참고: 1상 제분화 후, 건강하고 고수율의 NPC를 보장하기 위해 위에서 언급한 세포 형태 관찰 및 면역형광 분석방법을 사용하여 품질 관리를 수행해야 합니다. - 약 5 x 105 mESC 유도체를 기초 분화 배지 의 2mL 내에서 0.1% 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 잘 뿌려. mESC 유도체를 단계 II 프로토콜 1, 프로토콜 2 및 프로토콜 3로 개별적으로 3그룹으로 임의로 분할합니다.
- 플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 넣고 6h에 부착할 수 있도록 합니다. PBS 2mL로 두 번 씻으시면 됩니다.
- 기저 분화 매체 I, N2B27 배지 I 및 N2B27 배지II(표 2)의2mL을 각각 위의 그룹의 각 웰에 추가합니다.
- 플레이트를 인큐베이터에 넣고 10일 동안 차별화할 수 있습니다. 해당 매체를 2일마다 변경합니다.
- 분화 상태를 확인하고 3단계에서 언급한 대로 형태학적 변화를 기록합니다.
- 18일째에, 뉴런의 생성을 평가하고(β-Tubulin III 양성)을 평가하고 4단계에서 사용하는 3개의 프로토콜의 분화 효율을 결정한다.
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Representative Results
2일 배아체 형성 + 6일 RA 유도는 MESC를 NPC로 분화시키는 데 가장 적합합니다(1상). MESC를 NPC(Phase I)로 균등화하는 최적의 프로토콜을 결정하기 위해, 7개의 프로토콜은 A2lox 및 129mESC(표1)에서모두 테스트되었으며 각 그룹의 분화 상태는 광 현미경을 사용하여 모니터링하였다. 도 3A에도시된 바와 같이, 대부분의 A2lox 및 129 유도체는 "2일 배아 체형성 + 6일 RA 유도" 치료(Phase I-프로토콜 3) NPC의 형성을 나타내는 잘 쌓인 및 중성자 같은 형태를 보였다. 그러나 , "4 일 배아 신체 형성 + 4 일 RA 유도" 치료 (단계 I-프로토콜 2)를 가진 세포는 배아 체 내의 영양소부족으로 인한 불량하고 석멸 상태를 보였다. RA 유도(Phase I-protocol 4 및 5)와 결합된 단층 배양은 mESC의 분화를 지시할 수 있으며, 중성염과 같은 세포의 비율은 단계 I 프로토콜 3에서만큼 많지 않았습니다. 한편, 대부분의 A2lox 및 129 단계 I-프로토콜 6 및 7유도체는 더 작은 세포 체를 보여주었고 세포 세포를 통해 세포 사멸을 겪는 경향이 있으며, N2B27 배지 II가 배아 신경 발생을 효과적으로 지원할 수 없다는 것을 시사합니다.
NPC의 형성을 더욱 확인하기 위해, 각 군에서 네신+ 세포(NPC에 대한 마커)의 백분율은 면역형광 분석기를 사용하여 검출되었다. 그림 3B에서,단계 I-프로토콜 3에서 네신+ 세포의 비율은 가장 높았고, A2lox및 129 유도체에서 각각 2.33%± 4.33%와 69.33의 ± 77.67까지 도달했습니다. 전체적으로 단계 I-프로토콜 3은 mESC를 NPC로 분화하는 데 가장 효과적입니다.
N2B27 배지 II는 NPC로부터 뉴런으로의 분화를 가장 효과적으로 유도할 수 있다(Phase II). 단계 II 분화에서 세 가지 프로토콜을 검사했다. 도 4A에도시된 바와 같이, 형태학적 관찰은 대부분의 A2lox 및 129개의 유도체가 단계 II-프로토콜 3(N2B27 배지 II와 분화)이 18일까지 명확한 중성염 및 세포 체 확장을 가진 가장 장기간 뉴런과 같은 구조를 나타났으며, 이는 신경 발생의 효율적인 발생을 나타낸다. 면역형광 분석서에서는 218에 대한 A2lox 및 129유도체에서 각각 4.01% 및 58.73%± ± 67.75%± 7.73%까지 β-투불린 III+ 세포의 비율로 뉴런의 생성을 더욱 확인하였다(그림4B).
이를 명확히 하기 위해 배아 신경 발생에 최적화된 방법의 회로도도5도 5에도시된다. 간략하게, 1.5 x 106 mESC는 기저 분분 매체 I의 10 mL에서 미적 세균성 접시로 씨를 뿌리고 2 일 동안 배아 체형성을 허용한다. 이어서, 배아체는 0.1% 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 수집되어 심어져 있으며, 잘 배아체 50개농도가 있다. 한편, RA(1 μM)는 6일 간 추가됩니다. 8일부터 18일까지, RA는 제거되고, N2B27 배지 II는 NPC에서 뉴런으로 후속 분화를 지시하기 위해 적용됩니다. 이러한 결합 된 방법으로, 강력한 뉴런은 18 일에 형성 될 수있다.
그림 1: 배아 신경 발생 과정의 다이어그램. 이 그림은 Li 외10에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 배아 체의 형태. (a)4일간 배양된 배아체. (B)2일 동안 배양된 배아체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: A2lox 및 129 mESC를 사용하여 위상 I 분화에 대한 7개의 프로토콜의 효율성 비교. (A)8일째A2lox 및 129mESC 유도체의 형태학적 분석. 상부 패널: A2lox 유도체; 하부 패널: 129개의 유도체. (B)NPC의 형성을 위한 면역형광 검출(네신+, 그린). 핵은 DAPI로 파란색으로 표시되었다. 상부 패널: D8의 A2lox 유도체; 하부 패널: D8의 129개의 파생상품. 각 그룹의 네스티닌+ 세포의 백분율은 히스토그램에 의해 나타났다. 각 열은 세 가지 독립적인 실험의 평균±SEM을 나타냅니다. *, p≤0.05; **, p≤0.01. 이 그림은 Li 외10에서 수정되었습니다.
그림 4: 단계 II 분화에 대한 3가지 프로토콜의 효율성 비교입니다. (A)18일째A2lox 및 129mESC 유도체의 형태학적 분석. 상부 패널: A2lox 유도체; 하부 패널: 129개의 유도체. (B)뉴런의 형성을 위한 면역형광 검출(β-투굴린 III+, 적). 핵은 DAPI로 파란색으로 표시되었다. 상부 패널: D18에 A2lox 유도체; 하부 패널: D18의 129개의 파생상품. 각 그룹의 β-투불린 III+ 세포의 백분율은 히스토그램에 의해 나타났다. 각 열은 세 가지 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타냅니다. *, p≤0.05; **, p≤0.01. 이 그림은 Li 외10에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 시험관내 mESC로부터의 신경 분화를 위한 최적화된 방법의 간략한 모델 이 그림은 Liet al.10에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 차별화 단계 I (8d) | ||
| 프로토콜 | 미디어 | |
| 프로토콜 1 | 자연적으로 차별화: 기초 분화 매체로만 | 기초 분화 매체 I: DMEM/F12 +15% FBS + 1% NEAA+0.1mM 2ME+ 1%P/S |
| 프로토콜 2 | 4일 배아 체 형성 + 4일 RA 유도 | |
| 프로토콜 3 | 2 일 배아 몸 형성 + 6 일 RA 유도 | |
| 프로토콜 4 | RA 유도와 결합된 단층 배양: 4d(-RA) 4d (+RA) | |
| 프로토콜 5 | RA 유도와 결합된 단층 배양: 2d (-RA) 6d(+RA) | |
| 프로토콜 6 | N2B27 배지 II로 유도된 배아 체 형성(4d) 및 분화 | N2B27 중간 II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% 신경 물질 + 2% B27 +1%글루타맥스+ 0.1mM 2ME |
| 프로토콜 7 | N2B27 매체 II를 가진 단층 배양 | |
표 1: 단계 I 차별화에 사용되는 7개의 프로토콜에 대한 세부 정보입니다. 이 표는 Li 외10에서수정되었습니다.
| 차별화 단계 II (10d) | ||
| 프로토콜 | 미디어 | |
| 프로토콜 1 | 자연적으로 차별화: 기초 분화 매체로만 | 기초 분화 매체 I: DMEM/F12 +15% FBS +1% NEAA +0.1mM 2ME+ 1%P/S |
| 프로토콜 2 | N2B27 배지 I와의 차별화 | N2B27 매체 I: DMEM/F12 + 1%N2 + 2%B27 + 1%글루타맥스 +0.1mM 2ME |
| 프로토콜 3 | N2B27 매체 II와의 차별화 | N2B27 중간 II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% 신경 물질 + 2% B27 +1%글루타맥스+ 0.1mM 2ME |
표 2: 단계 II 분화에 사용되는 3가지 프로토콜의 세부 정보입니다. 이 표는 Li 외10에서수정되었습니다.
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Discussion
본 연구에서는, 우리는 mESC에서 신경 분화를 위한 간단하고 효과적인 방법을 설치했습니다, 저렴한 비용과 쉽게 얻을 수 있는 물질. 이 방법에서, RA 유도6일 뒤에 배아체 형성의 2일은 효과적으로 NPC로 mESC의 분화를 촉진할 수 있다 (단계 I-프로토콜 3). 상 II 분화의 경우, N2B27 배지 II(Phase II-프로토콜 3)는 NPC로부터 뉴런으로의 분화를 가장 효과적으로 유도한다. 성공을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계에 더 많은 주의를 기울여야 합니다.
첫째, 배아 체의 건강한 상태는 전체 분화 과정의 열쇠입니다. 3차원 배아 체형성은 일반적으로 ESC8의분화를 지시하는 데 사용된다. 이 연구에서는, 우리는 태아 바디의 적당한 현탁액 배양 시간을 조사했습니다. 도 2에도시된 바와 같이, 밝은 코어를 가진 둥근 배아 체는 이 조건에서 2일 동안 현탁액 배양 후에 형성되었다. 그러나, 4 일 동안 배양 될 때, 많은 배아 몸은 서로 부착하고, 코어는 코어에 있는 세포의 세포사멸을 나타내는 어둡게 됩니다. 후속 분화는 장기간배아 신체 형성의 악화 효과를 더욱 확인하였다. 일부 보고 된 연구에서, 배아 신체의 현탁 액양 은 10 일 동안 지속될 수 있으며, FBS 농도가 낮거나 FBS11없이배지를 사용할 수 있습니다. 연구에서 배아 체 형성을 위한 감소된 시간은 더 높은 FBS 농도 때문일 지도 모릅니다 (15%) 여기에서 사용되고 있으며, 15% FBS가 배아 체의 형성과 분화를 더 잘 촉진할 수 있다는 것이 입증되었습니다.
둘째, RA가 적용되고 RA 작업 농도가 mESC의 세포 운명 결정에 매우 중요합니다. RA, 비타민 A의 유도체는, 흉부 작용12와가장 중요한 모르포겐 중 하나입니다. RA는 다중 신호 경로를 조절하고 ESC13,14의세포 운명 결정에 영향을 미칠 수 있다. 보고서에 따르면 초기 분화 단계에서 RA를 가진 MESC의 단기 치료는 자발적인 분화를 방지하고 mESC15의자체 갱신 능력을 유지하는 것으로 나타났다. 다른 사람들은 RA가 시간점에 의존하는 ESC로부터 세균 세포 분화 및 신경 분화를 둘 다 조절할 수 있다고제안했습니다. 여기에 제시된 조건에서, RA는 태아 바디 형성 후에 2일째에 추가된 NPC로 분화를 지시하기 위한 적당합니다. 한편 RA의 작업 농도도 중요합니다. 낮은 RA 농도(~10nM)는 mESC의 분화를 내막과 같은 세포로 유도할 수 있는 반면, 높은 RA 농도(1-5 μM)는 NPC13,14,15,16,17,18, 19로분화를 유도할 가능성이 더 높다. RA의 사용으로 인해, 하나는 소건화 효과를 기대할 것이다; 뇌 뉴런으로의 분화는 거의 볼 수 없으며 뒤뜰과 척수 운명의 뉴런을 산출하면20,21이발생할 수 있습니다. 또한 RA는 쉽게 사용할 수 있고 저렴한 비용으로 제공되며 이 프로토콜을 사용하면 대부분의 실험실에서 연구 자금을 절약할 수 있습니다.
셋째, 여기에 제시된 조건에서, I상 분화 후에 생성된 NPC는 적절한 조건에서 저장되고 통과될 수 있다. 줄기 셀뱅커를 사용하여 높은 세포 밀도(>2 x 106)를사용하는 냉동 보존은 높은 회복속도를 얻기 위해 동결로 인한 세포 손상을 효과적으로 줄일 수 있습니다. 한편, 연구에서 생성된 NPC는 N2B27 배지(49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% 신경물질 + 2% B27)를 사용하여 5 x 105/cm2 이상의 세포 밀도를 가진 통과될 수있다. 낮은 세포 밀도(0.5 x 105/cm2미만)에서 NPC는 분화하는 경향이 있습니다. 이러한 세포 냉동 보존 및 복구 는 연구에 큰 편의를 가져올 수 있습니다.
또한, 신경 물질 매체는 단계 II 분화에 필수적이다. 신경 물질 매체는 신경 세포의 장기 유지 보수 및 성숙을 위해 특별히 설계되었습니다. N2B27 배지 II(표 2)에나열된 바와 같이 신경 물질 배지의 첨가는 NPC에서 뉴런으로의 분화를 더 잘 지원할 수 있습니다.
종합적으로, 우리는 조합 선별의 전략을 사용하여 시험관 내의 mESC에서 신경 분화를 위한 효율적이고 저렴한 방법을 보고했습니다. 확립 된 방법은 구현하기가 매우 쉽고 대부분의 실험실에서 사용하기에 적합합니다. 이러한 최적화 된 방법은 신경 생물학 및 발달 생물학 연구를위한 강력한 도구가 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(31501099호)과 중국 후베이성 교육부중장기 및 영(No. 20191104년). 그리고, 우리는 마우스 배아 줄기 세포주 A2lox를 제공하는 우한 과학 기술 대학의 웬성 덩 교수에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 - well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
References
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