Summary
Aqui, estabelecemos um método de baixo custo e fácil de operar que direciona a diferenciação rápida e eficiente das células-tronco embrionárias para os neurônios. Este método é adequado para popularização entre laboratórios e pode ser uma ferramenta útil para a pesquisa neurológica.
Abstract
A diferenciação neural das células-tronco embrionárias do camundongo (mESCs) é uma ferramenta potencial para elucidar os principais mecanismos envolvidos na neurogênese e potencialmente ajudar na medicina regenerativa. Aqui, estabelecemos um método eficiente e de baixo custo para diferenciação neuronal dos mESCs invitro, utilizando a estratégia de triagem combinatória. Sob as condições aqui definidas, a formação do corpo embrionário de 2 dias + protocolo de indução de ácido retinóico de 6 dias permite diferenciação rápida e eficiente dos mESCs em células precursoras neurais (NPCs), como visto pela formação de A2lox bem empilhados e neuritas semelhantes a 129 derivativos que são nestin positivos. O estado saudável dos corpos embrionários e o ponto de tempo em que o ácido retinóico (RA) é aplicado, assim como as concentrações de RA, são críticos no processo. Na diferenciação subsequente dos NPCs em neurônios, o N2B27 médio II (suplementado pelo meio neurobásal) poderia suportar melhor a manutenção e maturação a longo prazo das células neuronais. O método apresentado é altamente eficiente, de baixo custo e de fácil operação, podendo ser uma poderosa ferramenta para pesquisa em neurobiologia e biologia do desenvolvimento.
Introduction
As células-tronco embrionárias (ESCs) são pluripotentes e podem se diferenciar em células precursoras neurais (NPCs) e, posteriormente, em neurônios sob certas condições1. A neurogênese baseada em ESC fornece a melhor plataforma para imitar neurogênese, servindo assim como uma ferramenta útil para estudos de biologia do desenvolvimento e potencialmente auxiliar na medicina regenerativa2,3. Nas últimas décadas, muitas estratégias foram relatadas para induzir neurogênese embrionária, como o método transgênico4, utilizando pequenas moléculas5, utilizando um microambiente de matriz3D 6, e a técnica de cocultura7. No entanto, a maioria desses protocolos são limitados ou difíceis de operar, portanto, não são adequados para uso na maioria dos laboratórios.
Para encontrar um método fácil de operar e de baixo custo para obter uma diferenciação neural eficiente dos mESCs, uma estratégia de triagem combinatória foi usada aqui. Conforme descrito na Figura 1,todo o processo de neurogênese embrionária foi dividido em 2 fases. A fase I refere-se ao processo de diferenciação dos mESCs em NPCs, e a fase II refere-se à diferenciação subsequente dos NPCs em neurônios. Com base nos princípios de fácil operação, baixo custo, materiais facilmente disponíveis e alta eficiência de diferenciação, foram escolhidos sete protocolos na Fase I e três na Fase II com base no sistema tradicional de cultura monocamadas aderente ou no sistema de formação corporal embrionário8,9. A diferenciação de eficiência dos protocolos em ambas as fases foi avaliada por meio da observação da morfologia celular e do ensaio de imunofluorescência. Através da combinação do protocolo mais eficiente de cada fase, estabelecemos o método otimizado para diferenciação neural dos mESCs.
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Protocol
1. Cultura de células-tronco embrionárias do rato
- Prepare 0,1% de pratos ou pratos de cultura celular revestido de gelatina.
- Adicione 2 mL de gelatina esterilizada de 0,1% (0,1% w/v em água) a pratos de cultura celular de 60 mm. Arrase suavemente para garantir até mesmo o revestimento dos pratos da cultura celular.
- Coloque os pratos em uma incubadora de CO2 de 5% a 37 °C e deixe o revestimento por 1h.
- Remova a solução de gelatina de 0,1% antes de semear as células.
NOTA: Depois de remover a gelatina, não há necessidade de secar ou lavar os pratos revestidos.
- Cultura de células-tronco embrionárias do rato (A2lox e 129)
- Incubar células mESCs (A2lox e 129) nas células de cultura celular de 0,1% revestidas de 60 mm em meio de crescimento mESC a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5%, respectivamente. O meio de crescimento mESC consiste em 85% de DMEM/F12, 15% de substituição de soro knock-out (KSR), 0,1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% aminoácido não essencial (NEAA), 1% penicilina/estreptomicina (P/S), 1000 fator inibidor de leucemia U/mL (LIF), 10 nM CHIR-99021 (inibidor GSK-3) e 0,33 nM PD0325901 (inibidor de MEK).
ATENÇÃO: β-mercaptoetanol é inflamável e tem toxicidade por inalação. Mantenha-se afastado das fontes de incêndio e use uma máscara para evitar a inalação quando usar. - Mude o médio de crescimento do MESC diariamente para um melhor crescimento de A2lox e 129.
- Quando as células atingirem 80% de confluência, retire o meio e adicione 1 mL de 0,1% de trippsina ao prato. Arrase suavemente por 30 s para garantir a cobertura uniforme de trippsina em todas as células.
- Deixe as células por cerca de 1 minuto para tentar e,em seguida, remova a trippsina usando pipeta de 1 mL.
- Adicione 2 mL de mESC médio de crescimento ao prato, pipeta para cima e para baixo várias vezes para fazer uma única suspensão celular.
- Conte a densidade das células na suspensão o mais precisamente possível usando hemótmetro.
- Divida as células em 7 grupos e induz a diferenciação usando diferentes protocolos mostrados na Tabela 1.
- Incubar células mESCs (A2lox e 129) nas células de cultura celular de 0,1% revestidas de 60 mm em meio de crescimento mESC a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5%, respectivamente. O meio de crescimento mESC consiste em 85% de DMEM/F12, 15% de substituição de soro knock-out (KSR), 0,1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% aminoácido não essencial (NEAA), 1% penicilina/estreptomicina (P/S), 1000 fator inibidor de leucemia U/mL (LIF), 10 nM CHIR-99021 (inibidor GSK-3) e 0,33 nM PD0325901 (inibidor de MEK).
2. Diferenciação de mESCs para NPCs (Fase I)
- Prepare 0,1% de placas de cultura celular revestida de gelatina ou deslizamentos.
- Antes de usar, prepare 0,1% de gelatina revestida de 6 poços ou tampas como na etapa 1.1.
- Diferenciação da Fase I utilizando o protocolo 1 (Tabela 1)
- Semente cerca de 2 x 104 mESCs em 2 mL de diferenciação basal médio I por bem nas placas 0,1% revestidas de gelatina 6-well. Verifique a densidade celular sob um microscópio.
- Incubar as células a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5% por 6h para permitir a fixação.
- Após o apego, retire as células da incubadora e lave as células duas vezes com 2 mL de PBS.
- Adicione 2 mL de diferenciação basal médio I(Tabela 1) a cada poço e coloque as células de volta na incubadora.
- Deixe as células para diferenciação por 8 dias. Substitua o meio de diferenciação basal I a cada 2 dias.
- Diferenciação da Fase I utilizando o protocolo 2 (Tabela 1)
- Adicione 1,5 x 106 mESCs em um prato bacteriano não adesivo em 10 mL de diferenciação basal médio I para permitir a formação do corpo embrionário a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5%.
- Após 2 dias, a célula de transferência agrega em tubos de centrífugas de 15 mL e os deixa se estabelecer pela gravidade.
- Remova o supernasal e adicione 10 mL de diferenciação basal fresca do meio I para resuspensar os corpos embrióides. Replantá-los em um novo prato bacteriano não adesivo e permitir diferenciação por mais 2 dias.
- Verifique a formação de corpos embrionários sob o microscópio(Figura 2A).
- Recolher corpos embrionários conforme descrito nas etapas 2.3.2-2.3.3. Semente cerca de 50 corpos embrionários em 2 mL de meio de diferenciação basal I por poço em 0,1% de placas revestidas de gelatina 6-well.
- Prepare 1 mM de estoque de RA totalmente trans (em DMSO) e armazene longe da luz em um congelador de -80 °C após a sub-embalagem.
NOTA: A RA é instável, e deve-se prestar atenção para mantê-lo longe da luz e reduzir o contato aéreo durante a preparação do estoque de RA. - Para indução de RA, adicione 2 μL de estoque de RA em cada poço para fazer uma concentração final de 1 μM.
- Coloque a placa na incubadora de CO2 de 5% a 37 °C e diferencie por mais 4 dias.
- Altere todo o 2 mL de diferenciação basal médio I (com RA de 1 μM) a cada 2 dias.
- Diferenciação da Fase I utilizando o protocolo 3 (Tabela 1)
- Plante 1,5 x 106 mESCs em um prato bacteriano não adesivo em 10 mL de diferenciação basal médio I. Deixe por 2 dias para formação corporal embrionária a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5%.
- Verifique a formação de corpos embrionários sob um microscópio(Figura 2B).
- Transfira os agregados celulares em tubos de centrífugas de 15 mL e deixe-os se estabelecer pela gravidade.
- Remova o supernatante cuidadosamente e adicione 10 mL de diferenciação basal fresca do meio I para resuspensá-los.
- Semente cerca de 50 corpos embrionários em 2 mL de meio de diferenciação basal I por poço em 0,1% de placas revestidas de gelatina 6-well.
- Para indução de RA, adicione 2 μL de estoque de RA em cada poço para fazer uma concentração final de 1 μM.
- Coloque a placa na incubadora de CO2 de 5% a 37 °C e diferencie por mais 6 dias. Altere todo o meio de diferenciação basal I (com RA de 1 μM) a cada 2 dias.
- Diferenciação da Fase I utilizando o protocolo 4 (Tabela 1)
- Semente cerca de 2 x 104 mESCs dentro de 2 mL de meio de diferenciação basal I por bem nas placas de 0,1% revestidas de gelatina 6-well. Coloque a placa na incubadora de CO2 de 5% a 37 °C para permitir a fixação por 6h.
- Após o apego, lave as células duas vezes com 2 mL de PBS. Adicione 2 mL de diferenciação basal médio I a cada poço e deixe a diferenciação por 4 dias na incubadora de 5% de CO2 a 37 °C.
- Para indução de RA, adicione 2 μL de estoque de RA totalmente trans em cada poço (a concentração de trabalho é de 1 μM) para induzir a diferenciação por mais 4 dias.
- Em todo o processo, substitua todo o meio a cada 2 dias.
- Diferenciação da Fase I utilizando o protocolo 5 (Tabela 1)
- Semente cerca de 2 x 104 mESCs dentro de 2 mL de meio de diferenciação basal I por bem nas placas de 0,1% revestidas de gelatina 6-well. Coloque a placa na incubadora de CO2 de 5% a 37 °C para permitir a fixação por 6h.
- Lave as células duas vezes com 2 mL de PBS. Adicione 2 mL de diferenciação basal médio I a cada poço e deixe a diferenciação por 2 dias na incubadora de 5% de CO2 a 37 °C.
- Para a indução de RA subsequente, adicione 2 μL de estoque de RA em cada poço para fazer uma concentração final de 1 μM. Coloque a placa na incubadora de CO2 de 5% a 37 °C para induzir a diferenciação por mais 6 dias.
- Em todo o processo, substitua todo o meio a cada 2 dias.
- Diferenciação da Fase I utilizando o protocolo 6 (Tabela 1)
- Plante 1,5 x 106 mESCs em um prato bacteriano não adesivo em 10 mL de N2B27 médio II(Tabela 1) para permitir a formação de corpos embrióides.
- No2º dia, recolher os agregados celulares conforme descrito nas etapas 2.3.2-2.3.3 e resuspensar os corpos embrióides utilizando 10 mL de n2B27 médio II fresco.
- Replante-os em um novo prato bacteriano não adesivo e permita diferenciação por mais 2 dias na incubadora de CO2 de 5% a 37 °C. Verifique a formação de corpos embrionários sob microscópio.
- No4º dia, colete corpos embrionários. Semente cerca de 50 corpos embrionários por poço em placas de 6 poços revestidos de gelatina com 2 mL de N2B27 médio II.
- Adicione 2 μL de estoque de RA totalmente trans em cada poço e induza a diferenciação por mais 4 dias. Substitua todo o meio (N2B27 médio II por 1 μM RA) a cada dois dias.
- Diferenciação da Fase I utilizando o protocolo 7 (Tabela 1)
- Semente cerca de 2 x 104 mESCs dentro de 2 mL de meio de diferenciação basal I por bem nas placas de 0,1% revestidas de gelatina 6-well. Coloque a placa na incubadora de CO2 de 5% a 37 °C para permitir a fixação por 6h.
- Lave as células duas vezes com PBS. Em seguida, adicione 2 mL de N2B27 médio II a cada poço e deixe a diferenciação por 8 dias a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5%.
- Troque todo o N2B27 médio II a cada 2 dias.
3. Observação da morfologia celular
- Verifique o status de diferenciação dos 7 grupos acima mencionados diariamente sob um microscópio de luz de contraste de fase invertida.
- Selecione aleatoriamente pelo menos 12 campos e tire fotos para registrar as alterações morfológicas de cada grupo em D8.
4. Mancha de imunofluorescência
- Preparação da amostra: Seed mESCs em tampas revestidas de gelatina de 0,1% e permitem diferenciação por 8 dias utilizando os protocolos mencionados na etapa 2.
- Enxágüe: No8º dia, retire as amostras da incubadora e remova o meio de diferenciação por aspiração. Enxágue suavemente as células uma vez com 1 mL de PBS por 5 min.
- Fixação: Adicione 1 mL de 4% de paraformaldeído a cada amostra e fixe as células por 20 minutos à temperatura ambiente (TR).
- Enxágüe: Após a fixação, enxágue suavemente as células com 1 mL de PBS 3 vezes, por 5 minutos cada.
- Permeabilização: Adicione 1 mL de 0,2% TritonX-100 em PBS a cada amostra e deixe por 8 min na RT.
- Enxágüe: Após a permeabilização, enxágue suavemente as células com 1 mL de PBS 3 vezes, por 5 minutos cada.
- Bloqueio: Adicione 1 mL de soro de cabra de 10% em PBS a cada amostra e incubar na RT por 1h para bloquear quaisquer interações não específicas.
- Incubação com anticorpo primário
- Diluir o anticorpo anti-Nestin a uma proporção de 1:100 usando 5% de soro de cabra na PBS.
- Aplique 500 μL de anticorpo diluído em diferentes amostras e incubar durante a noite a 4 °C.
- Enxágüe: Remova o anticorpo e enxágue as amostras suavemente com 1 mL de PBS 3 vezes por 8 minutos cada.
- Incubação com anticorpos secundários
- Diluir o Alexa Fluor 488-rotulado anti-rato IgG com uma proporção de 1:500 usando 5% de soro de cabra em PBS.
- Aplique 500 μL de anticorpo diluído em diferentes amostras e incubar no escuro por 2 h no RT.
NOTA: Após aplicar anticorpos secundários fluorescentes, realize todas as etapas subsequentes no escuro para evitar a saciamento da fluorescência.
- Enxágüe: Remova o anticorpo secundário e enxágue as amostras suavemente com 1 mL de PBS 3 vezes por 8 minutos cada.
- Coloração nuclear e montagem
- Coloque uma gota de meio de montagem DAPI no microslídeo limpo.
- Retire cuidadosamente das amostras das placas e coloque a amostra em cima do meio de montagem da DAPI com a célula de frente para baixo. Deixe no escuro por 5 minutos no RT.
- Remova o excesso de dopi médio de montagem com papel absorvente.
- Observação de microscopia de fluorescência
- Coloque os espécimes sob a microscopia de fluorescência e detecte o sinal para DAPI e Alexa Fluor 488 usando filtros adequados.
- Escolha uniforme e aleatoriamente 10-15 campos visuais diferentes para cada amostra e grave as imagens com uma câmera CCD.
5. Diferenciação de NPCs para neurônios (Fase II)
- Prepare os derivados mESC sob a diferenciação da Fase I utilizando o protocolo 3 (8 dias, Tabela 1) conforme detalhado na etapa 2.4, que tem a maior eficiência de diferenciação (Ver Figura 3).
NOTA: Após a diferenciação da fase I, deve ser realizado o controle de qualidade utilizando observação de morfologia celular e ensaio de imunofluorescência mencionado acima, para garantir um NPCs saudável e de alto rendimento. - Semente cerca de 5 x 105 mESC derivados dentro de 2 mL de diferenciação basal médio I por bem nas placas de 0,1% revestidas de gelatina 6-well. Divida aleatoriamente os derivados do mESC em 3 grupos, como o protocolo fase II 1, o protocolo 2 e o protocolo 3, respectivamente.
- Coloque a placa na incubadora de CO2 de 5% a 37 °C para permitir a fixação por 6h. Lave-os duas vezes com 2 mL de PBS.
- Adicione 2 mL de diferenciação basal médio I, N2B27 médio I e N2B27 médio II(Tabela 2), respectivamente,a cada poço dos grupos acima.
- Coloque as placas na incubadora e deixe diferenciar por mais 10 dias. Troque o meio correspondente a cada 2 dias.
- Verifique o estado de diferenciação e regise as alterações morfológicas mencionadas na etapa 3.
- No dia 18, avalie a geração de neurônios (β-Tubulin III positivo) e determine a eficiência de diferenciação dos 3 protocolos utilizando na etapa 4.
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Representative Results
Formação corporal embrionária de 2 dias + a indução de RA de 6 dias funciona melhor na direção da diferenciação de mESCs em NPCs (Fase I). Para determinar o protocolo ideal que melhor promove a diferenciação de mESCs em NPCs (Fase I), 7 protocolos foram testados tanto em A2lox quanto em 129 mESCs(Tabela 1) e o status de diferenciação de cada grupo foi monitorado por microscópio leve. Como mostrado na Figura 3A, a maioria dos derivados A2lox e 129 em formação de corpo embrionário de 2 dias + indução de RA de 6 dias " (Fase I-protocolo 3) mostrou morfologias bem empilhadas e semelhantes a neurita, o que indica a formação de NPCs. No entanto, as células com tratamento de "formação corporal embrióide de 4 dias + indução de RA de 4 dias" (Fase I-protocolo 2) apresentaram estado pobre e apoptótico, o que pode ser devido à falta de nutrientes dentro de corpos embrionários. A cultura monocamada combinada com a indução de RA (Fase I-protocolo 4 e 5) também poderia direcionar a diferenciação de mESCs, enquanto a proporção de células semelhantes a neuritas não era tanto quanto na Fase I-protocolo 3. Enquanto isso, a maioria dos derivados A2lox e 129 nos termos do protocolo 6 e 7 mostrou corpos celulares menores e tendia a se submeter à apoptose, sugerindo que o N2B27 médio II não poderia suportar neurogênese embrionária efetivamente.
Para confirmar ainda mais a formação de NPCs, a porcentagem de células Nestin+ (marcador para NPCs) em cada grupo foi detectada usando um ensaio de imunofluorescência. Na Figura 3B,o percentual de células Nestin+ no protocolo fase I 3 foi o mais alto e atingiu até 77,67 ± 4,33% e 69,33 ± 2,33% em A2lox e 129 derivados, respectivamente. Coletivamente, o protocolo 3 da Fase I funciona melhor na direção da diferenciação de mESCs em NPCs.
N2B27 médio II pode induzir mais efetivamente a diferenciação de NPCs em neurônios (Fase II). Foram examinados três protocolos de diferenciação da fase II. Como mostrado na Figura 4A,a observação morfológica mostrou que a maioria dos derivados A2lox e 129 na fase II-protocolo 3 (diferenciação com n2B27 médio II) apareceu as estruturas mais prolongadas semelhantes a neurônios com neurites claros e extensões corporais celulares até o dia 18, indicando a ocorrência eficiente de neurogênese. Os ensaios de imunofluorescência confirmaram ainda a geração de neurônios, com o percentual de células β-Tubulin III+ até 67,75 ± 4,01% e 58,73 ± 7,25%, respectivamente, em A2lox e 129 derivados em D18(Figura 4B).
Para deixar mais claro, um diagrama esquemático do método otimizado para neurogênese embrionária é mostrado na Figura 5. Resumidamente, 1,5 x 106 mESCs são semeados em um prato bacteriano não adesivo em 10 mL de diferenciação basal médio I e permitem a formação do corpo embrionário por 2 dias. Em seguida, corpos embrionários são coletados e plantados nas placas de 6 poços revestidas de gelatina de 0,1% com a concentração de 50 corpos embrionários por poço. Enquanto isso, ra (1 μM) é adicionado por mais 6 dias. Do dia 8 ao dia 18, a RA é removida, e o N2B27 médio II é aplicado para direcionar a diferenciação subsequente dos NPCs aos neurônios. Com um método tão combinado, neurônios robustos podem ser formados no dia 18.
Figura 1: Diagrama do processo de neurogênese embrionária. Este valor foi modificado a partir de Li et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A morfologia dos corpos embrióides. (A)Corpos embrionários cultivados por 4 dias. (B) Corpos embrióides cultivados por 2 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação de eficiência dos 7 protocolos na fase I de diferenciação utilizando A2lox e 129 mESCs. (A) Análise morfológica de derivados A2lox e 129 mESCs no dia 8. Painel superior: Derivados A2lox; Painel inferior: 129 derivados. (B) Detecção de imunofluorescência para a formação de NPCs (Nestin+, verde). Os núcleos foram rotulados de azul com DAPI. Painel superior: Derivados A2lox em D8; Painel inferior: 129 derivados em D8. Percentuais de células Nestin+ de cada grupo foram mostrados pelo histograma. Cada coluna representa a média±SEM de três experimentos independentes. *, p≤0,05; **, p≤0,01. Esta figura foi modificada a partir de Li et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Comparação de eficiência dos 3 protocolos na diferenciação da fase II. (A) Análise morfológica de derivados A2lox e 129 mESCs no dia 18. Painel superior: Derivados A2lox; Painel inferior: 129 derivados. (B) Detecção de imunofluorescência para a formação de neurônios (β-Tubulin III+, vermelho). Os núcleos foram rotulados de azul com DAPI. Painel superior: Derivados A2lox em D18; Painel inferior: 129 derivados em D18. Porcentagens de células β-Tubulin III+ de cada grupo foram mostradas pelo histograma. Cada coluna representa a média ± SEM de três experimentos independentes. *, p≤0,05; **, p≤0,01. Este valor foi modificado a partir de Li et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Modelo breve do método otimizado para diferenciação neuronal dos mESCs in vitro Este valor foi modificado a partir de Liet al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Diferenciação Fase I (8d) | ||
| Protocolos | Mídia | |
| protocolo 1 | Diferenciação naturalmente: Com meio de diferenciação basal eu só | Meio de diferenciação basal I: DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA+0,1mM 2ME+ 1%P/S |
| protocolo 2 | Formação de corpos embrióides de 4 dias + indução de RA de 4 dias | |
| protocolo 3 | Formação de corpos embrióides de 2 dias + indução de RA de 6 dias | |
| protocolo 4 | Cultura monocamada combinada com indução de RA: 4d (-RA) 4d (+RA) | |
| protocolo 5 | Cultura monocamada combinada com indução de RA: 2d (-RA) 6d(+RA) | |
| protocolo 6 | Formação de Corpos Embrióides (4 d) e diferenciação induzida com n2B27 médio II | N2B27 médio II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% meio neurobásal + 2% B27 +1%GlutaMAX+ 0,1mM 2ME |
| protocolo 7 | Cultura monocamadas com n2B27 médio II | |
Tabela 1: Detalhes dos 7 protocolos utilizados na diferenciação da fase I. Esta tabela foi modificada a partir de Li et al.10.
| Fase de Diferenciação II (10d) | ||
| Protocolos | Mídia | |
| protocolo 1 | Diferenciação naturalmente: Com meio de diferenciação basal eu só | Meio de diferenciação basal I: DMEM/F12 +15%FBS +1%NEAA +0,1mM 2ME+ 1%P/S |
| protocolo 2 | Diferenciação com n2B27 médio I | N2B27 médio I: DMEM/F12 + 1%N2 + 2%B27 + 1%GlutaMAX +0,1mM 2ME |
| protocolo 3 | Diferenciação com n2B27 médio II | N2B27 médio II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% meio neurobásal + 2% B27 +1%GlutaMAX+ 0,1mM 2ME |
Tabela 2: Detalhes dos 3 protocolos utilizados na diferenciação da fase II. Esta tabela foi modificada a partir de Li et al.10.
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Discussion
No presente estudo, estabelecemos um método simples e eficaz para diferenciação neuronal dos mESCs, com baixo custo e materiais de fácil obtenção. Neste método, 2 dias de formação corporal embrionária seguida de 6 dias de indução de RA podem efetivamente promover a diferenciação de mESCs em NPCs (Fase I-protocolo 3). Para a diferenciação da fase II, o N2B27 médio II (Fase II-protocolo 3) induz mais efetivamente a diferenciação dos NPCs em neurônios. Para garantir o sucesso, mais atenção deve ser dada a várias etapas críticas.
Em primeiro lugar, o estado saudável dos corpos embrionários é a chave para todo o processo de diferenciação. A formação do corpo embrióide tridimensional é geralmente usada para direcionar a diferenciação dos ESCs8. Neste estudo, investigamos o tempo adequado de cultura de suspensão dos corpos embrionários. Como mostrado na Figura 2,corpos embrióides redondos com núcleos brilhantes foram formados após a cultura de suspensão por 2 dias nesta condição. No entanto, quando cultivados por 4 dias, muitos corpos embrionários se aderem uns aos outros, e os núcleos ficam escuros, indicando a apoptose das células nos núcleos. A diferenciação subsequente confirmou ainda o pior efeito da formação prolongada do corpo embrionário. Em alguns estudos relatados, a cultura de suspensão de corpos embrionários pode durar até 10 dias, utilizando meio com menor concentração de FBS ou sem FBS11. O tempo reduzido para formação corporal embrionária no estudo pode ser devido à maior concentração de FBS (15%) utilizado aqui, e foi comprovado que 15% de FBS pode promover melhor a formação e diferenciação de corpos embrionários.
Em segundo lugar, o ponto de tempo em que a RA é aplicada e a concentração de trabalho de RA são fundamentais para a determinação do destino celular dos mESCs. RA, um derivado de vitamina A, é um dos morfogênios mais importantes com ações pleiotrópicos12. A RA pode regular múltiplas vias de sinal e afetar a determinação do destino celular dos ESCs13,14. Os relatos mostraram que o tratamento de curto prazo de mESCs com RA durante a fase de diferenciação precoce impediu a diferenciação espontânea e manteve a capacidade de autoconexão dos mESCs15. Outros sugeriram que a RA poderia regular tanto a diferenciação de células germinativas quanto a diferenciação neural dos ESCs, que são dependentes do ponto de tempo16,17,18. Na condição aqui apresentada, a RA acrescentou no2º dia após a formação do corpo embrionário ser adequada para direcionar a diferenciação para NPCs. Enquanto isso, a concentração de trabalho de RA também é crítica. Baixas concentrações de RA (~10 nM) podem induzir a diferenciação de mESCs em células semelhantes ao endoderme, enquanto altas concentrações de RA (1-5 μM) são mais propensas a induzir diferenciação em NPCs13,14,15,16,17,18,19. Devido ao uso de RA, seria de esperar um efeito de caudalização; a diferenciação em neurônios cerebrais fores raramente seria vista e os neurônios que produzem destinos de cérebro traseiro e medula espinhal ocorreriam20,21. Além disso, a RA é um agente facilmente disponível e de baixo custo, e o uso deste protocolo pode economizar fundos de pesquisa para a maioria dos laboratórios.
Em terceiro lugar, em condições aqui apresentadas, os NPCs gerados após a diferenciação da fase I podem ser armazenados e transitodos em condições adequadas. A criopreservação com alta densidade celular (>2 x 106) usando o Stem-Cellbanker pode efetivamente reduzir os danos celulares causados pelo congelamento para obter uma alta taxa de recuperação. Enquanto isso, os NPCs gerados no estudo podem ser passagemdos usando meio N2B27 (49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% meio neurobásal + 2% B27) com densidade celular superior a 5 x 105/cm2. Sob baixa densidade celular (menos de 0,5 x 105/cm2), os NPCs tendem a se diferenciar. Essa criopreservação e recuperação celular podem trazer grande comodidade à pesquisa.
Além disso, o meio neurobásal é essencial para a diferenciação da fase II. O meio neurobásal é projetado especificamente para manutenção e maturação de células neuronais a longo prazo. Conforme listado no N2B27 médio II(Tabela 2),a adição do meio Neurobásal poderia suportar melhor a diferenciação dos NPCs em neurônios.
Coletivamente, relatamos um método eficiente e de baixo custo para diferenciação neuronal dos mESCs in vitro, utilizando as estratégias de triagem combinatória. O método estabelecido é muito fácil de implementar e é adequado para uso pela maioria dos laboratórios. Tal método otimizado pode ser uma poderosa ferramenta para neurobiologia e pesquisa de biologia do desenvolvimento.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (nº 31501099) e pelo Departamento de Educação da Província de Hubei, China (Nº. Q20191104). E agradecemos ao Professor Wensheng Deng da Universidade de Ciência e Tecnologia de Wuhan por fornecer as linhas de células-tronco embrionárias do rato A2lox.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 - well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
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