Method Article

나노 물질 및 기타 어려운 물질의 조류 독성 테스트를위한 소규모 설정

DOI:

10.3791/61209

⸱

October 10th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental Engineering, Technical University of Denmark

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 LED로 수직으로 조명 된 설정을 사용하여 어려운 물질 (예 : 착색 물질 또는 나노 물질)에 대한 조류 독성 테스트를 시연합니다.

Abstract

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생태 독성 데이터는 유럽 및 국제 규정(예: REACH)에 의한 화학물질의 사전 및 사후 시장 등록을 위한 요구 사항입니다. 조류 독성 검사는 화학 물질의 규제 위험 평가에 자주 사용됩니다. 높은 신뢰성과 재현성을 달성하기 위해서는 표준화된 가이드라인의 개발이 필수적입니다. 조류 독성 검사의 경우, 지침은 pH, 온도, 이산화탄소 수준 및 광 강도와 같은 매개 변수의 안정적이고 균일한 조건을 요구합니다. 나노 물질 및 기타 소위 어려운 물질은 그들의 규제 수용을 방해 하는 결과 큰 변화를 일으키는 빛을 방해할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 LEVITATT (조류 독성 검사를위한 LED 수직 조명 표)를 개발했습니다. 이 설정은 아래에서 LED 조명을 사용하여 균일한 광 분포 및 온도 제어를 허용하고 시료 내 의 그늘을 최소화합니다. 이 설정은 바이오매스 정량화를 위한 샘플 부피를 최적화하고 동시에 조류의 기하급수적인 성장을 지원하기 위해 CO2의 충분한 유입을 보장합니다. 또한, 테스트 컨테이너의 재료는 흡착 및 휘발화를 최소화하기 위해 맞춤화될 수 있습니다. 유색 물질 이나 입자 현탁액을 테스트 할 때, LED 조명의 사용은 또한 추가 열 발생없이 빛 강도를 증가 할 수 있습니다. 컴팩트한 설계와 최소한의 장비 요구 사항은 광범위한 실험실에서 LEVITATT구현 가능성을 높입니다. ALgal 독성 검사에 대한 표준화된 ISO 및 OECD 지침을 준수하는 반면, LEVITATT는 에렌마이어 플라스크 및 마이크로티터 플레이트에 비해 두 개의 기준 물질(3,5-디콜로로페놀 및 K2Cr2O7)과3개의 나노 물질(ZnO, CeO2및 BaSO4)에대한 낮은 샘플 간 가변성을 보였습니다.

Introduction

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조류 독성 검사는 유럽 및 국제 규정에 의해 화학 물질의 사전 및 후 시장 등록에 필요한 생태 독성 데이터를 생성하는 데 사용되는 세 가지 필수 테스트 중 하나입니다 (예 : REACH1 및 TSCA (미국). 이를 위해 표준화된 조류 시험 지침은 국제기구(예: ISO 및 OECD)에 의해 개발되었습니다. 이러한 테스트 표준 및 지침은 pH, 온도, 이산화탄소 수준 및 광 강도 측면에서 이상적인 테스트 조건을 규정합니다. 그러나, 조류 시험 동안 안정적인 시험 상태를 유지하는 것은 실제로 어렵고 그 결과는 다양한 화학 물질 및 나노 물질(종종 "어려운 물질"이라고도 함)에 대한 재현성 및 신뢰성 문제로 고통받고있다. 기존의 조류 독성 테스트 설정의 대부분은 인큐베이터 내부의 궤도 셰이커에 위치한 상대적으로 큰 볼륨 (100-250 mL)으로 작동합니다. 이러한 설정은 시험 농도의 수를 제한하고 조류 배양 및 테스트 재료의 달성 가능하고 높은 볼륨을 복제합니다. 또한, 이러한 설정은 거의 균일 한 광장을 가지고 있으며 신뢰할 수있는 조명 조건은 또한 큰 플라스크에서 얻기 가 어렵고, 부분적으로 빛의 강도가 기하급수적으로 감소함에 따라 빛이 더 멀리 이동하고 부분적으로 플라스크 형상으로 인해. 대체 설정은 pH....

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Protocol

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1. LEVITATT 설정에 대한 설명

  1. 20mL 신경 유리 바이알(도1,인서칭 1)을 사용하여 빛을 침투할 수 있습니다. 또는 가벼운 침투성 플라스틱 바이알을 사용할 수 있습니다. 광미터를 사용하여 빛의 강도를 정량화합니다.
  2. 생체매스의 정량화를 허용하고 인큐베이션 전후의 나노 물질의 특성화/정량화를 위해 시험 시작 시 적어도 4mL 시험 서스펜션을 사용한다(도1,삽입 2).
  3. 작은 구멍이 뚫린캡(도 1,인서드 3)과 함께 20mL 신경바이알을 장착하여 대기와CO2 교환을 허용한다. 이 교환은 테스트 중에 안정적인 pH 및 CO2 수준을 보장하는 데 매우 중요합니다.
  4. 휘발성 물질의 경우, 농축 나트륨 중탄산염(NaHCO3)완충계통(10)에10의해CO2가 용액으로 유지되는 가스 상이 없는 주사기9 또는 완전히 닫힌 플라스크를 사용하여 헤드스페이스의CO2 농축을 허용하도록 밀착테플론 코팅 ....

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Results

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기준 물질을 가진 초기 시험은 조류 균주의 감도를 결정하기 위하여 수행됩니다. R. 서브 쿼타에 정기적으로 사용되는 기준 물질은 칼륨 디크로메이트 및 3,5-디클로르페놀7,,8이다. 도 3 및 표 2는 R의 DRC 패키지가 성장률에 적용될 때 곡선 피팅 및 통계 출력을 포함하는 조류 테스트의 대표적인 결과를 보여 준다.

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도 3:조류(R. subcapitata)에화학 화합물을 72h 노출시키는 대표적인 농도 반응 곡선. 단선은.......

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Discussion

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Phytoplankton은 태양 에너지와 이산화탄소를 유기 물질로 변환하여 수중 생태계에서 중추적 인 역할을합니다. 이러한 이유로, 조류 성장 속도 억제 테스트는 화학 물질의 규제 위험 평가에 필요한 세 가지 필수 수생 독성 테스트 중 하나로 포함됩니다. 신뢰할 수 있고 재현 가능한 조류 독성 검사를 수행하는 능력은 이 점에서 중요합니다. Erlenmeyer 플라스크를 사용한 테스트 설정은 도입에 설명된 바와 같이 다양한 변화와 불편을 소개합니다. 이 문제를 회피하기 위해 마이크로티터 플레이트가3을제안했습니다. 마이크로티터 플레이트는 테스트에 필요한 부피와 공간을 최소화하면서, 시험 지침6의시험 타당성 기준과 같은 설치의 준수와 관련하여 문헌에서 우려가 제기되고 있다. 예를 들어, 세포 성장 매체(DMEM GluteMAX, Opti-MEM 및 Hams F12 글루타맥스)에서 37°C에서 마이크로티터 플레이트의 다른 우물에 대한 반휘발성 화학 물.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 순찰에 의해 투자되었다 – 나노 안전 테스트를위한 고급 도구, 호라이즌에서 보조금 계약 760813 호라이즌 에서 2020 연구 및 혁신 프로그램.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
아세톤시그마-알드리치V179124
염화암모늄그마-알드리치254134
BlueCap 병 (1L)Buch & 홀름 A/S 
붕산Sigma-AldrichB0394
염화칼슘 이수화물Sigma-Aldrich208290
투명 아크릴 시트(40x40cm)
코발트(II) 염화물 육수화물Sigma-Aldrich255599
구리(II) 염화물 이수화물Sigma-Aldrich307483
에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐 염 디하이드레이트시그마-알드리치  E5134
형광 분광 광도계 F-7000히타치
염산시그마-알드리치258148
철(III) 염화물 육수화물시그마-알드리치236489
LED 광원Helmholt Elektronik A/SH35161중립 백색, 6500K
염화마그네슘 육수화물시그마-알드리치M9272
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트시그마-알드리치230391
망간(II) 염화물 사수화물시그마-알드리치221279
오비탈 쉐이커IKA2980200
인산칼륨 일염기성 시그마-알드리치P0662
Raphidocelis subcapitataNORCCANIVA-CHL1 스트레인
신틸레이션 바이알 (20 mL)Fisherscientific11526325
소듐 바이카보네이Sigma-AldrichS6014
소듐 하이드록사이드시그마-알드리치415413
소듐 몰리브덴트 디하이드레이트시그마-알드리치331058 
스프링 클램프Frederiksen Scientific A/S472002
온도조절 캐비닛VWRWTWA208450대안: 온도 조절실
환기 파이프 (Ø 125 mm)Silvan22605630165
용량 플라스크 (25 mL)DWK Life Sciences246781455
염화아연Sigma-Aldrich208086
시9072335트

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland. (2016).
  2. Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for E....

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Algal Toxicity TestingNanomaterial TestingLEVITATT SetupLED IlluminationFluorometer AnalysisCO2 ExchangeOrbital ShakerScintillation VialsBiomass QuantificationGrowth Rate Measurement

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