Summary
Het doel van dit protocol is om continu de dynamiek van het menselijke alvleesklier eilandje engraftment proces en de bijdragende gastheer versus donorcellen te controleren. Dit wordt bereikt door het transplanteren van menselijke eilandjes in de voorste kamer van het oog (ACE) van een NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-muisontvanger gevolgd door herhaalde 2-foton beeldvorming.
Abstract
Imaging bètacellen is een belangrijke stap in de richting van inzicht in eilandjestransplantatie. Hoewel verschillende beeldvormingsplatforms voor de registratie van bètacelbiologie in vivozijn ontwikkeld en gebruikt, zijn ze beperkt in termen van het toestaan van eencellige resolutie en continue longitudinale opnames. Vanwege de transparantie van het hoornvlies is de voorkamer van het oog (ACE) bij muizen zeer geschikt om de biologie van menselijke en muizenalvleeskliercelen te bestuderen. Hier is een beschrijving van hoe deze aanpak kan worden gebruikt om continue longitudinale opnames van enten en revitalisering van individuele menselijke eilandjes enten uit te voeren. Menselijke eilandjestransplantaties worden in de ACE ingebracht met behulp van NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-muizen als ontvangers. Dit maakt het mogelijk om de uitbreiding van ontvanger versus donorcellen en de bijdrage van de ontvangende cellen bij het bevorderen van de inkapseling en vascularisatie van het transplantaat mogelijk te maken. Verder wordt een stapsgewijze benadering geschetst voor beeldanalyse en kwantificering van het eilandjevolume of gesegmenteerde vasculatuur en eilandjescapsule die ontvangende cellen vormt.
Introduction
Diabetes mellitus beschrijft een groep van metabole ziekten gekenmerkt door verhoogde niveaus van bloedglucose als resultaten van onvoldoende insulineproductie van verlies of disfunctie van pancreas islet bètacellen, vaak vergezeld van insulineresistentie. Type 1 (T1D) en type 2 diabetes (T2D) zijn complexe ziekten waarbij de progressieve disfunctie van de bètacellen ziekteontwikkeling veroorzaakt. T1D wordt neergeslagen door een auto-immuunaanval op de bètacellen, terwijl T2D wordt beschouwd als aangedreven door metabole factoren, zij het met toenemend bewijs van low-grade systemische ontsteking1. Transplantatie van donor menselijke eilandjes, met name voor T1D-patiënten, biedt het potentieel voor het verstrekken van fysiologische glycemische controle. Echter, een tekort aan weefseldonoren en slechte eilandjes engraftment heeft voorkomen dat eilandjetransplantatie uitgegroeid tot een mainstream therapeutische optie. Een aanzienlijk deel van het functionele eilandjetransplantatie gaat verloren in de onmiddellijke posttransplantatieperiode (24-48 uur) als gevolg van de hypoxische, inflammatoire, immunogene gastheeromgeving2,3. Om de efficiëntie van interventiemethoden voor de verbetering van de overleving van eilandjes te evalueren, is continue monitoring van dergelijke transplantaties noodzakelijk.
In vivo technieken om beeld en het lot van getransplanteerde menselijke alvleesklier eilandjes na transplantatie blijft nog steeds een uitdaging voor diabetes onderzoek4,5. Tot op heden tonen niet-invasieve beeldvormingstechnieken, waaronder positronemissietomografie (PET), magnetic resonance imaging (MRI) of echografie (VS) potentieel voor de kwantificering en functionele evaluatie van getransplanteerde eilandjes in experimentele omstandigheden5. Gezien de kleine eilandjesgroottes hebben kwantitatieve metingen op deze modaliteiten echter onvoldoende resolutie. De voorste oogkamer (ACE) als transplantatielocatie voor observatie is een veelbelovende niet-invasieve beeldvormingsoplossing die effectief een hogere ruimtelijke resolutie en frequente monitoring over lange periodenbiedt 6. Deze methode is met succes benut om muis eilandje biologie te bestuderen (beoordeeld in Yang et al.7), auto-immuunreacties 8 ,evenalsmenselijk eilandje enten9,10.
Hier wordt de ACE-transplantatiemethode gecombineerd met een 2-fotonbeeldvormingsbenadering om de dynamiek van het menselijke alvleesklierenteletproces te onderzoeken door continue en herhaalde opnames op individuele eilandjestransplantaten tot 10 maanden na transplantatie. De multifoton beeldvormingseigenschappen van grotere beelddiepten en verminderde algehele fotobleaching en fotoschade overwinnen de beeldvormingsbeperkingen van confocale microscopie11. Kwantificering van fluorescerende beeldvorming omvat verschillende fasen, waaronder het voorbereiden van eilandjesvoorbeelden, eilandjestransplantatie, beeldverwerving, beeldfiltering om eilandjesruis of achtergrond, segmentatie, kwantificering en gegevensanalyse te verwijderen. De meest uitdagende stap is meestal het partitioneren of segmenteren van een afbeelding in meerdere delen of regio's. Dit kan het scheiden van signaal van achtergrondgeluid, of clustering regio's van voxels op basis van gelijkenissen in kleur of vorm te detecteren en labelvoxels van een 3D-volume dat eilandje vasculatuur vertegenwoordigt, bijvoorbeeld. Eenmaal gesegmenteerd, statistieken zoals object volume maten zijn meestal eenvoudig te extraheren. Voorzien is een methode voor de kwantificering en extractie van de beeldgegevens, zoals segmentatie en datavisualisatie. Bijzondere aandacht wordt besteed aan het verwijderen van autofluorescentie in menselijke eilandjes en onderscheid tussen eilandje vasculatuur en eilandje capsule vormen ontvanger cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De Regionale Ethische Commissie in Lund, Zweden, keurde de studie volgens de Wet betreffende de Ethische Overzicht van Onderzoek in het betreffen van Mensen goed. Dierproeven werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Zweedse ethiek van dierproeven en goedgekeurd door de ethische commissies van Malmö en Lund. 6 tot 8 weken oude immunodeficiënte NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA-tomaat. Rag2-/-ontvangende muizen werden gebruikt als ontvangers voor transplantatie van menselijke eilandjes10.
1. Voorbereiding van eilandjes op transplantatie
- Kweek menselijke eilandjes in CMRL 1066 aangevuld met 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 50 μg/mL gentamycine, 0,25 μg/mL fungizone, 20 μg/mL ciproxfloxacin, 10 mM nicotinamide (NIC) en 10% warmte-geïnactiveerd menselijk serum bij 37 °C in 5% CO2 en bevochtigde lucht tot transplantatie, zoals eerder beschreven12.
OPMERKING: Eilandjes moeten vrij zijn van exocriene weefsel en elkaar niet raken in de cultuur. Exocriene weefsels lijken doorschijnend. - Op de dag van transplantatie, overdracht cultuur media met de eilandjes naar een nieuwe petrischaal met behulp van een aspirator buis assemblage aangesloten op een getrokken glazen capillaire.
OPMERKING: Gebruik ook een pipet van 200 μL. Het kleuren van de achterkant van de petrischaal helpt om de eilandjes gemakkelijker te onderscheiden onder de stereomicroscoop. - Kies met behulp van een stereomicroscoop ~20-40 eilandjes per transplantatie en breng over op een buis van 1,5 mL. Vul de buis naar de top met cultuurmedia uit de couveuse.
- Verzegel de buizen met paraffinefolie en bewaar op ijs tot transplantatie. Bereid een passend bedrag voor voor het aantal uitgevoerde transplantaties.
- U er ook voor zorgen dat er een CO2-incubator beschikbaar is in de operatiekamer om eilandjes in de cultuur te houden en ze onmiddellijk voorafgaand aan elke transplantatie te plukken.
2. Voorbereiding van transplantatieapparatuur en operatietafel
OPMERKING: Alle chirurgische hulpmiddelen moeten automatisch worden gedeslaveerd en de operatietafel en instrumenten worden gedesinfecteerd met 70% alcohol.
- Sluit een stereotaxic hoofdhouder aan op anesthesie via een neusmasker en zet het verwarmingskussen aan.
- Sluit een gastight Hamilton spuit aan polyethyleen buizen en een stompe einde oog canule.
LET OP: Het wordt aanbevolen om alle onderdelen te vullen met PBS voor de montage. Controleer op gevangen luchtbellen en verwijder indien aanwezig. - Bevestig de Hamilton spuit stevig aan de tafel(Figuur 1a) of een beweegbare basis (Figuur 1e) en bevestig de slang aan de stereomicroscoop, met canule opknoping naar beneden (dat wil zeggen, wachtpositie).
OPMERKING: Gebruik chirurgische tape, omdat het gemakkelijk is te verwijderen en opnieuw vast te maken. - Bereid een 1 mL spuit aangesloten op een 30 G naald gevuld met 0,1 mg/kg buprenorfine oplossing.
- Bereid een spuit met steriele PBS. U ook een pipet gebruiken.
- Zet een schone wake-up kooi met verwarmingslamp opzij.
3. Anesthesie en positionering van de ontvangende muizen voor een operatie
OPMERKING: Alle dieren werden gefokt en onderhouden in een ziekteverwekkervrije omgeving in de dierenfaciliteiten van de Universiteit van Lund.
- Verdoven de muis in een kamer gevuld met 40% O2/60% N2/3% isoflurane en breng de verdoofde muis over naar het hoofdhouderplatform op een warm verwarmingskussen(figuur 1a). Controleer op het gebrek aan pedaalreflexen.
OPMERKING: Isoflurane anesthesie is de voorkeursmethode van anesthesie voor snel herstel na de operatie. De microscoopruimte moet goed worden geventileerd om isoflureus te gebruiken. - Plaats de snuit van de muis in het anesthesiemasker aangesloten op 40% O2/60% N2/0,9%-1,5% isoflurane anesthesie machine. Gebruik de duim en vinger om het hoofd iets omhoog te tillen en vast te maken met behulp van de metalen stukken aan de zijkanten. Zorg ervoor dat de oortjes het hoofd direct onder de oren bevestigen. Injecteer 0,1 mg/kg buprenorfineoplossing onderhuids op de achterkant van de muis.
LET OP: Buprenorfine wordt gebruikt als pijnstiller. - Kantel het hoofd, zodat het te bedienen oog naar boven gericht is en dicht bij de onderzoeker staat.
- Trek voorzichtig de oogleden van het oog te worden getransplanteerd met behulp van stompe tangen, pop het oog uit, en losjes vast te stellen met een pincet. Zorg ervoor dat de uiteinden van de pincet zijn bedekt met een polyethyleenbuis die aan het hoofdhouderplatform is bevestigd (figuur 1a, insert).
- Houd beide ogen altijd nat door een druppel steriele PBS op het oog aan te brengen.
- Breng de menselijke eilandjes van de verzegelde 1,5 mL buis (sectie 1) naar een petrischaaltje met steriele PBS en zorg ervoor dat de eilandjes dicht bij elkaar liggen om de hoeveelheid overgedragen celkweekmedia te minimaliseren(figuur 1c).
- Pick-up ~ 20-30 eilandjes in het oog canule aangesloten via polytheen buizen aan de Hamilton spuit.
LET OP: Neem zo min mogelijk vloeistof op met de eilandjes. - Hang de slang ondersteboven en bevestig aan de stereomicroscoop(Figuur 1d). Tape de slang zorgvuldig te laten de eilandjes zinken tot het einde van de buis in de richting van de canule.
4. Transplantatieprocedure
OPMERKING: Deze methode is eerder beschreven voor de transplantatie van muiseilandjes6. Een licht gewijzigde procedure wordt hier gepresenteerd.
- Knijp de pads op de achterpoten om ervoor te zorgen dat de muis slaapt.
- Draai de tangen die het oog beperken zonder de bloedstroom te verstoren en breng een druppel steriele PBS op het oog aan.
- Met behulp van een 25 G naald als scalpel, schuine kant naar boven, zorgvuldig doordringen slechts de helft van de tip in het hoornvlies en maak een enkele laterale incisie. Maak het gat in een opwaartse hoek; het gat zal gemakkelijker verzegelen na de transplantatie(figuur 1f).
- Til voorzichtig het hoornvlies op met de canule voorgeladen met eilandjes en breng langzaam eilandjes in het oog aan. Vermijd het inbrengen van de canule in de voorste kamer om schade aan de iris te voorkomen, maar duw voorzichtig tegen de hoornvliesopening(figuur 1g). Trek de canule langzaam uit de ACE.
LET OP: Streef naar een injectievolume van 3–8 μL. Als het volume te groot is, zal het het oog blootstellen aan onnodig hoge intraoculaire druk en kan leiden tot reflux van de geïnjecteerde eilandjes uit de voorkamer. - Bij problemen met het inbrengen van de eilandjes als gevolg van verhoogde druk in de oogkamer, vergroot u de incisieplaats door de laterale incisieplaats te versterken en de eilandjes opnieuw aan te brengen.
OPMERKING: Af en toe kunnen geïntroduceerde luchtbellen worden gebruikt als ruimtehouders. - Breng ooggel aan op het oog, maak de oogbedwingende tangen los en laat de muis gedurende 8-10 minuten in dezelfde positie staan om de eilandjes te laten instellen.
- Verwijder de tangen die het ooglid vasthouden en zet het ooglid terug naar zijn normale positie.
- Haal de muis van de hoofdhouder en breng deze over naar een wake-up kooi.
- Wanneer de muis wakker is en beweegt, breng deze terug naar de oorspronkelijke kooi en bewaar deze in de dierenstal tot het scannen (ten minste 5 dagen worden aanbevolen).
5. Beeldvorming van geïmplanteerde menselijke eilandjes door 2-fotonmicroscopie
OPMERKING: Het nemen van overzichtsbeelden van het oog met behulp van een fluorescentie stereoscopische microscoop (Figuur 2a–c) 4-5 dagen na transplantatie voorafgaand aan 2-foton beeldvorming wordt aanbevolen om de eilandjes van belang te lokaliseren. Vermijd het beperken van het oog te strak zo vroeg na transplantatie. Gebruik 2-foton beeldvorming 6-7 dagen natransplantatie.
- Start de software voor het verwerven van afbeeldingen (zie Tabel van Materialen). In het menu "Laser" activeer je de Mai Tai laser (Power "ON") en stel in het menu "Light Path" de golflengte in op 900 nm en breng je een minimale transmissielaserkracht toe vanaf 5%-10% laserkracht (gebruik schuifregelaars).
OPMERKING: Tijdens het scannen, pas de laser kracht als dat nodig is. - Zet groene, oranje en rode kanalen in. Verzamel emissielicht tegelijkertijd op drie niet-gescande detectoren (NDD) met behulp van een dichronische spiegel (LBF 760) en informatie over emissiefilters: Red/Angiosense 680, 690–730 nm; Groen/Autofluorescentie, 500-550 nm; en Sinaasappel/Tomaat, 565-610nm (Figuur 2d).
- Plaats het hoofdhouder stadium op de gemotoriseerde microscoop stadium en sluit het gasmasker aan de slang van de anesthesie machine en buizen aangesloten op ventilatiesysteem. Zet het verwarmingskussen aan.
- Verdoven de ontvanger muis, overdracht naar het hoofdhouder platform, beperken het oog voor beeldvorming, en beheren buprenorfine oplossing zoals hierboven beschreven (stappen 3.1–3.5).
- Pas isoflurane dampen indien nodig aan. Een ademsnelheid van ~55-65 ademhalingen per minuut (bpm) duidt op optimale anesthesie. Als anesthesie te diep is, zal het tarief <50 bpm met zware ademhaling of het hijgen zijn; als te licht, zal het tarief >70 bpm met oppervlakkige ademhaling zijn. Controleer muizen zorgvuldig tijdens anesthesie door visuele inspectie om de 15 minuten.
OPMERKING: Verdoving varieert van muis tot muis, tussen muisstammen en naarmate de tijd onder narcose vordert13. - Toedien voldoende ooggel op het oog als een onderdompelingsvloeistof tussen het hoornvlies en de lens, waardoor deze zich langzaam ophoopt(figuur 2f, insert). Vermijd luchtbellen.
OPMERKING: Zijverlichting met een flexibele metalen slanglamp wordt aanbevolen om de focus aan te passen en eilandjes grafts te lokaliseren. - Om bloedvaten te visualiseren, dient u 100 μL van het beeldvormingsmiddel (bijvoorbeeld Angiosense 680) intraveneus in de staartader met behulp van een wegwerpsusuline 30 G spuit.
- In de" Acquisitiemodus" pas de framegrootte aan op 512 x 512 en de scansnelheid.
OPMERKING: Tragere scans (d.w.z. het verhogen van de verblijfstijd) zullen de signaal-ruisverhouding verbeteren. - Pas in het menu" Kanalen" Master Gain voor elke PMT in Volt aan om het signaal te versterken totdat een afbeelding op het scherm in de live scanmodus wordt gezien. Hoe hoger deze waarde, hoe gevoeliger de detector wordt voor signaal en ruis.
LET OP: Houd bij voorkeur waarden tussen 500-800 V. - Definieer in het menu "Z-stack" het begin en het einde van de z-stack door de focus handmatig naar de bovenkant van het eilandje graft te verplaatsen. Sla positie op door 'Set First'te selecteren. Ga naar het laatste onderste vlak dat kan worden gericht in het eilandje graft en sla positie door te selecteren"Laatste instellen". Gebruik een z-stap grootte van 2 μm.
- Verzamel de uiteindelijke afbeeldingsstack door op het tabblad Experimentstartente klikken en op te slaan als 8-bits CZI -bestand (d.w.z. Carl Zeiss-indeling).
6. Beeldvorming van geïmplanteerde menselijke eilandjes door confocale microscopie
OPMERKING: Het totale volume, morfologie en plasticiteit van getransplanteerde eilandjes kunnen worden beoordeeld door het in vivo verstrooiingssignaal in een afzonderlijke scan (d.w.z. afzonderlijk spoor) te controleren door detectie van laserruglicht10.
- Schakel de grootlichtsplinter (d.w.z. LBF-filter) uit en stel in het dialoogvenster" Lichtpad" een apart spoor in voor confocale beeldvorming. Kies de Argon laser met golflengte van 633 nm en detectie op dezelfde golflengte als het laserlicht. Z-stacks worden verworven met een stapgrootte van 2-3 μm voor backscatter lichtsignaal.
- Pas de z-stack instellingen aan om ervoor te zorgen dat het hele eilandje wordt opgenomen (zie stap 5.10).
- Verwerf de afbeeldingsstack en sla op als 8-bits CZI-bestand.
7. Beeldanalyse
OPMERKING: Voor deze stap werd commerciële software (zie Tabel van Materialen)gebruikt.
- Verwijderen van islet autofluorescentie(figuur 3b)
- Kies in het tabblad "Beeldverwerking" "Kanaalreken"en typ "ch1-ch2". Hierdoor ontstaat een nieuw kanaal 4 (ch 4); naamswijziging als "Vasculature".
OPMERKING: Het kanaal Groen/Autofluorescentie wordt afgetrokken van het Kanaal Rood/Angiosense. - Herhaal de vorige stap en typ "ch3-ch2" om een nieuw kanaal te creëren (ch 5); naam hernoemen als"Tomaat (alle)".
LET OP: Het kanaal Groen/Autofluorescentie wordt afgetrokken van het kanaal Oranje/Tomaat.
- Kies in het tabblad "Beeldverwerking" "Kanaalreken"en typ "ch1-ch2". Hierdoor ontstaat een nieuw kanaal 4 (ch 4); naamswijziging als "Vasculature".
- Eilandjesmasker definiëren door handmatig tekenen(figuur 3c)
- Maak een nieuw oppervlak (blauw symbool) en kies in de wizardhandmatig bewerken. Houd de aanwijzer in de modus' Selecteer' en klik in de 3D-weergave niet opVolume(onder Scène)om secties te visualiseren.
- Activeer alle kanalen, inclusief ch 1–ch 3, voor een eenvoudigere isletgrensdiscriminatie.
LET OP: Het kanaal Oranje/Tomaat is handig om eilandjesgrenzen te definiëren aan de kant van het tomaatcapsulesignaal. U ook de kanaalintensiteiten verhogen om meerkanaals eilandje autofluorescentie en detectorachtergrondsignaal als begeleiding te gebruiken. - Kies op het tabblad' Tekenen'Contour' en klik opTekenenom contouren rond de eilandjesrand te tekenen vanaf slicepositie 1.
- Naar een nieuwe segmentpositie gaan en tekencontouren herhalen. Werk af met het laatste segment boven aan het eilandje en klik door op het tabblad' Oppervlak maken'te klikken. Meestal is het genoeg om contourenth te tekenen om de 10e slice.
- Segmentatie van "Islet vasculature" en "Islet tomaat" fluorescentie met behulp van eilandjesmasker (Figuur 3d).
- Kies het eerder gedefinieerde object"Eilandjesmasker",ga naar het tabblad bewerken(potloodsymbool) en klik op het tabblad'Allesmaskeren', waarmee een nieuw venster wordt geopend.
- Kies het eerder genoemde kanaal "Vasculature" (ch 4) in het vervolgkeuzemenu kanaalselectie en activeer opties "Duplicate channel before applying mask", " Constantinside/outside", en stel voxels buiten oppervlak in op "0,000", waardoor een nieuw kanaal wordt gemaakt; naam te noemen als "Islet vasculature" (ch 6).
- Herhaal stap 7.3.1 en 7.3.2 en kies het eerder gemaakte kanaal"Tomato (all)"(ch 5) in het vervolgkeuzemenu kanaalselectie om het nieuwe kanaal te maken; de naam "Islet tomaat" (ch 7) te noemen.
- Oppervlakteweergave van eilandje vasculatuur (Figuur 3e)
- Maak een nieuw oppervlak in het menu "Scène" en kies in de wizard "Automatische creatie".
- Stel het bronkanaal in op eerder gemaakte "Islet vasculature" (ch 6) en kies achtergrondaftrekken. Indien nodig kan de automatische drempelschatting worden aangepast. Vergelijk met het reagerende fluorescentiekanaal (bijvoorbeeld door het nieuw gemaakte tabblad oppervlakte in/uit te mengen). Ga verder in de tovenaar.
- Gebruik optioneel filters. Kies bijvoorbeeld 'Volume'en pas het filter (geel) in het venster aan, waarmee geselecteerde oppervlakteobjecten kunnen worden verwijderd. Maak de wizard af en noem het nieuwe oppervlakobject "Islet vasculature".
- Segmentatie van "Islet tomaat vasculature" fluorescentie signaal (Figuur 3f)
- Ga in het eerder gemaakte oppervlakobjectIslet vasculature naar het tabblad Bewerken en klik op het tabblad'Allesmaskeren', waarmee een nieuw venster wordt geopend.
- Kies het eerder genoemde kanaal "Islet tomaat" (ch 7) in het vervolgkeuzemenu van de kanaalselectie en stel voxels buitenoppervlak in op "10.000", waardoor het nieuwe kanaal wordt gemaakt; naam te noemen als "Islet tomaat vasculatuur" (ch 8).
- Segmentatie van "Tomaatcapsule" fluorescentiesignaal (Figuur 3g)
- Kies "Channel Arithmetic's" in het tabblad "Image processing" en typ "ch7-ch8", waardoor het nieuwe kanaal wordt gemaakt; omgedoopt tot "Tomato capsule" (ch 9).
OPMERKING: Hetfluorescentiesignaal " Islet tomaat" wordt afgetrokken van het totale "Islet tomaat" fluorescentiesignaal.
- Kies "Channel Arithmetic's" in het tabblad "Image processing" en typ "ch7-ch8", waardoor het nieuwe kanaal wordt gemaakt; omgedoopt tot "Tomato capsule" (ch 9).
- Oppervlakteweergave van "Islet tomato vasculature" en "Tomato capsule" (Figuur 3h)
- Volg stap 7.4 en kies in de wizard bronkanalen "Islet tomato vasculature" (ch 8) of "Tomato capsule" (ch 9) om nieuwe oppervlakteobjecten dienovereenkomstig te creëren.
- Oppervlakteweergave van het totale eilandjesoppervlak (figuur 3i)
- Open het backscatterbestand van de eilandjes en maak een nieuw oppervlak.
- Kies in de wizard 'Automatische creatie'en definieer 'Regio van belang'.
OPMERKING: "Regio van belang" wordt gebruikt om de signalen van meerdere eilandjes te scheiden en om de diepte van het te analyseren eilandje te definiëren (bijvoorbeeld top 75 μm). - In "Absolute intensiteit" pas de drempel indien nodig aan. Het oppervlakobject kan aan of uit worden geklikt om te controleren met de bijbehorende kanaalintensiteit. Sluit de tovenaar.
- Kwantificering (Figuur 3j)
- Selecteer een gemaakt oppervlakteobject in het menu 'Scène' en ga naar het tabbladStatistieken.
- Als u gedetailleerde volumegegevens wilt ophalen in het geselecteerde oppervlakteobject, kiest u het tabblad "Gedetailleerd" en selecteert u "Specifieke waarden" en "Volume" in het vervolgkeuzemenu. Als u een totale volumewaarde van het geselecteerde oppervlakteobject wilt ophalen, gaat u naar het tabbladGedetailleerden kiest uGemiddelde waarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Niet-gelabelde menselijke eilandjes werden getransplanteerd in de ACE van 8 weken oude vrouwelijke NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-tomaat. Rag2−/−) ontvanger muizen. Om afstoting van menselijk weefsel te voorkomen, werden immunodeficiënte Rag2 knock-out muizen gekozen als ontvangers. In deze transgene muizen, alle cellen en weefsels uitgedrukt een membraan-gerichte tomaat fluorescentie eiwit (mT) dat een duidelijke identificatie van de ontvanger en het donorweefsel mogelijk maakt. Herhaalde beeldvorming van eilandjestransplantaten door 2-photon microscopie met hoge resolutie kan mT+ ontvangercellen identificeren die betrokken zijn bij het engraftmentproces en hun dynamische migratiepatroon.
In het algemeen was de transplantatie-opstelling van menselijke eilandjes in de ACE van de ontvangende muizen(figuur 1a) vergelijkbaar met syngeneïsche muiseilandjestransplantaties met betrekking tot eilandjevorm en -grootte(figuur 1b,c). Figuur 1d,e toont een typische transplantatie met een gedetailleerd schema met de laterale incisieplaats (figuur 1f) en verspreiding van eilandjes in de oogkamer (figuur 1g) en een representatieve uitkomst van geïnjecteerde muiseilandjes (Figuur 1h) of menselijke eilandjes (figuur 1i). Het entingspercentage van menselijke eilandjes was over het algemeen lager (~30%) dan die van muiseilandjes (50-70%). Een mogelijke reden voor deze discrepantie is dat de beschikbaarheid van menselijke eilandjes onvoorspelbaar is, meestal met slechts een opzegtermijn van 1 dag, en ook dat de verkregen eilandjes variëren in donorleeftijd, donor BMI, zuiverheid (45%-86%), en postisolatiecultuurtijd (2-5 dagen). Eilandje isolaties van muizen kunnen daarentegen gemakkelijk worden gepland. Deze waren geïsoleerd van 6-8 weken oude (dat wil zeggen, jongvolwassene) muizen met een hoge zuiverheid en korte, nachtelijke cultuurtijden. Deze verschillen tussen muis- en menselijke eilandjestransplantaties moeten worden overwogen bij de interpretatie van de resultaten.
In vivo fluorescentie beeldvorming van menselijke eilandjes grafts werd aangetast door aanzienlijke interferentie van weefsel autofluorescentie (Figuur 4). De visualisatie van het revascularisatieproces van ACE-getransplanteerde menselijke eilandjestransplantaten door beeldvormende middelen met behulp van traditionele golflengten in het zichtbare spectrum werd belemmerd door een lage signaal-ruisverhouding en een hoog niveau van natuurlijke isletautofluorescentie, geïllustreerd door afbeeldingen van een λ-scan in het spectrale bereik van 500-700 nm (figuur 4a) of door de gevoelige niet-gescande PMT-detector met filter voor detectie van dextran TR (610-675 nm) (figuur 4b). Deze hoge achtergrond werd niet waargenomen bij muis eilandjes grafts(figuur 4c). Het NIR-emitterende beeldvormingsmiddel Angiosense 680 vertoonde een zichtbaar hogere signaal-achtergrondverhouding als gevolg van afname van achtergrondgeluid in het NIR-bereik 690-730 nm (figuur 4d, figuur 3a). De extra opname van een "ongebruikt" kanaal (d.w.z. 500-550 nm) kan worden gebruikt in een latere stap voor beeldverwerking om resterende achtergrondgeluiden veroorzaakt door natuurlijke autofluorescentie van islet te verwijderen. De 2-foton / confocale imaging setup (Figuur 2d–f) is vergelijkbaar met eerder beschreven degenen6, behalve voor het gebruik van 900 nm 2-foton excitatie en fluorescentie detectie van Angiosense 680, autofluorescentie, en tomaat kanalen met niet-gescande PMTs 1-3 (Figuur 2d). Het is raadzaam om het laservermogen te meten dat het monster bereikt voor elke microscoopopstelling(figuur 2e). Verder wordt aanbevolen om in eerste instantie beeld van de geënte eilandjes met stereomicroscopie (Figuur 2a–c), die zal helpen bij het selecteren van eilandjes van belang en voorkomen dat 2-foton microscopie beelden van een mislukte transplantatie.
Het doel van het extraheren van kwantitatieve gegevens uit veel afbeeldingen was om potentiële bias in de gegevensselectie te verwijderen en de statistische kracht te verkrijgen die nodig is om een legitiem effect op te sporen bij het vergelijken van experimenten. Kwantificering van fluorescerende beeldvorming van alvleesklier eilandjes betrokken verschillende stappen, die elk kunnen hebben beïnvloed de resultaten in een ander. Hier werd gebruik gemaakt van interactieve beeldsoftware. Het bevat functies die visualisatie van volumebeelden en objecten en identificatie van objecten op basis van hun morfologie of intensiteit mogelijk maken. Figuur 3 illustreert de verschillende stappen in beeldsegmentatie. Het verwijderen van autofluorescentie door aftrekking van het kanaal "autofluorescentie" verbeterde de signaal-ruisverhouding (figuur 3a,b). De eilandjesgrens genaamd "eilandjesmasker" (figuur 3c) en de bijbehorende kanalen (figuur 3d) is handmatig gedefinieerd. De segmentatie van het tomatensignaal in de islet vasculature en eilandjecapsule (Figuur 3f,g) en de uiteindelijke oppervlakteweergave (figuur 3e,h,i) werd gebruikt om kwantitatieve gegevens te extraheren.
Figuur 5 toont een representatieve longitudinale beeldvormingssessie van hetzelfde menselijke eilandjetransplantatie na 2 weken, 2 maanden, 5 maanden en 8 maanden natransplantatie in de ACE van een NOD. ROSA-tomaat. Rag2-/- ontvanger muis. Geïllustreerd zijn beelden met maximale intensiteitsprojecties (MIP) van oorspronkelijk opgenomen RAW-gegevens (figuur 5a),verwerkte beelden na het verwijderen van autofluorescentie(figuur 5b–e, f–i), en gesegmenteerde eilandjeobjecten, waaronder capsule (Figuur 5j,m) of eilandje vasculatuurvormende mT+ ontvangercellen (rood, figuur 5n-q)en totale islet vasculuur (groen, figuur 5n–q).
Figuur 1: Transplantatie van alvleeskliereilandjes in de voorkamer van het oog.
(a) Transplantatie setup met verdoofde muis vastgesteld in stereotaxic hoofdhouder en de blootgestelde oog (inzet) naast de voorbereide Hamilton spuit bevestigd aan de tafel en de stereomicroscoop klaar om muis eilandjes (b) of menselijke eilandjes (c) te plukken. dd) Wachtpositie van de oogkanule geladen met eilandjes. ee) Transplantatie in proces, en (f) schematische tekening van een enkele laterale incisie gebruikt om zorgvuldig til het hoornvlies met het puntje van de oogkanule en afzien van eilandjes in de voorkamer (g). Beeld van het oog onmiddellijk na injectie van muis eilandjes(h) of menselijke eilandjes (i). Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Beeldvorming van ACE-geïmplanteerde alvleesklier eilandje grafts.
(a) Experimentele fluorescerende stereo microscoop imaging setup. Widefield (b) of fluorescerend beeld (c) van B6. ROSA-tomaten islet grafts. d) Vereenvoudigde regeling van het emissielichtpad. LBF: Laserblokkeringsfilter (grootlichtspl splitter); LP: Lange pas; BP: Band pass; PMT: Photomultiplier. (e) Laser uitgangsvermogen hangt sterk af van de golflengte. Diagram toont het werkelijke laservermogen in Watts (W) gerelateerd aan het vermogensniveau van de laserstraal (%), gemeten voor de microscoopopstelling. Cirkel: 800 nm, vierkant: 900 nm, driehoek: 1.000 nm. (f) Experimentele beeldvorming setup toont de ontvanger muis met ACE-geënte eilandjes (insert) gemonteerd op de gemotoriseerde fase een commerciële microscoop. Schaalbalk = 100 μm Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Beeldsegmentatie van een menselijk eilandje geënt in de ACE van een NOD. ROSA-tomaat. Rag2-/- ontvanger muis.
aa) Originele opname: Getoond is een 3D-weergave van een beeldstapel van een menselijk eilandje met samengevoegde kanalen of optische delen van gesplitste kanalen Angiosense 680 (ch 1), autofluorescentie (ch 2) en tomaat (ch 3). bb) 3D-weergave van beeldstack met samengevoegde kanalen of optische secties met gesplitste kanalen "Vasculature" (ch 4) en "Tomato(all)" (ch 5) na de verwijdering van autofluorescentie. cc) Eilandjesmasker (geel). dd) 3D-weergave van beeldstapel met samengevoegde of gesplitste kanalen "eilandje vasculatuur" (ch 6, wit), "eilandjetomaat" (ch 7, red). e) Oppervlakteobject "eilandje vasculatuur" gemaakt van ch 6. (f) 3D-weergave van beeldstapel met samengevoegde kanalen "eilandje vasculatuur" (ch 6, groen) en "eilandje tomaat vasculatuur" (ch 8, red). (g) 3D-weergave van "tomatencapsule" (ch 9) na kanaalaftrekken ch 7-ch 8 of optische sectie met samengevoegde kanalen "tomatencapsule" (ch 9, wit), islet tomaat vasculatuur (ch 8, red) en islet vasculature (ch 6, groen). (h) Oppervlakteweergave van tomatencapsule (gemaakt van ch 9) en eilandje tomaat vasculatuur (gemaakt van ch 8). (i) Islet segmentatie van menselijke eilandje backscatter signaal met de selectie van "Regio van belang"(links) en de gesegmenteerde oppervlakte object (midden) in vergelijking met de kanaalintensiteit (rechts). (j) Ophalen van gegevens uit het tabblad statistieken. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Autofluorescentie van menselijke eilandjes.
Menselijke eilandjes (a,b,d) of B6 muis eilandjes (c) werden getransplanteerd in de ACE van NOD. Rag2-/- of B6-ontvangende muizen en geïnjecteerd met dextran TR(a–c)of Angiosense 680 imaging agent(d)voor de visualisatie van bloedvaten. aa) λ-scan van menselijke eilandjestransplantatie op het bereik van 500-700 nm met 2-foton excitatie bij 900 nm. Maximale beeldprojectie (MIP) beeld van de mens (b) of muis eilandje graft (c) opgewonden op 900 nm en gedetecteerd met de TR filter (610-675 nm) van de NDD. dd) MIP van een menselijk eilandje graft opgewonden op 900 nm en detectie met de Angiosense 680 filter (690-730 nm) van de NDD. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Getransplanteerde menselijke eilandjes worden geleidelijk revasculeerd en ingekapseld door mT uitdrukken cellen van de oorsprong van de ontvanger.
Menselijke eilandjes getransplanteerd in de voorste oogkamer van NOD. ROSA-tomaat. Rag2−/− ontvanger muizen, werden herhaaldelijk afgebeeld voor maximaal 8 maanden. Angiosense 680 werd geïnjecteerd voor de visualisatie van vasculatuur. aa) Maximale intensiteitsprojecties (MIP) van de oorspronkelijke geregistreerde RAW-gegevens van gesplitste (vasculatuur, autofluorescentie, mT) of samengevoegde kanalen en backscatter lichtsignaal bij 5 maanden na detransplantatie. MIPS van totale vasculatuur alleen (b–e) of samengevoegd met membraan-gerichte tomaat fluorescentie (mT) (f–i) na islet autoflourescence verwijdering (groen, a). 3D-renderings van gesegmenteerde islet tomaat capsule (j–m) en islet tomaat vasculatuur (rood) of totaal eilandje vasculatuur (groen) (n–q) op aangegeven tijdstippen posttransplantatie. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een methode wordt gepresenteerd om het menselijke alvleesklier eilandjeceltransplantatieproces te bestuderen door de betrokkenheid van ontvanger en donorweefsel te observeren. Na een minimale invasieve operatie die menselijke eilandjes implanteert in de voorkamer van een immunodeficiënt muizenoog, herstelt de muis snel binnen enkele minuten na de operatie. De procedure wordt uitgevoerd op één oog. Over het algemeen is het hoornvlies vanaf 5-7 dagen na de implantatie voldoende genezen om intravital beeldvorming uit te voeren.
In dit protocol is de kwaliteit van de menselijke eilandjestransplantaties van cruciaal belang. De kwaliteit van het menselijke eilandje en daardoor de transplantatieresultaten kunnen variëren afhankelijk van de leeftijd van de donor, BMI en isolatieproces, evenals de tijd van de eilandjescultuur voor en na aankomst. Menselijke eilandjes verwerkt uit orgaandonor alvleesklieren goedgekeurd voor klinische transplantatie en onderzoeksdoeleinden werden gebruikt met toestemming van de donoren. Ze werden verkregen na een proces van alvleesklier spijsvertering en eilandjeszuivering beschreven elders12. Vergelijkbaar met geïsoleerde murine eilandjes, deze eilandjes ondergaan een aantal cellulaire aanvallen zoals ischemie, mechanische stress, verlies van kelder eiwitten, en gedeeltelijke verstoring van intra-eilandje endotheelcellen (ECs) tijdens de enzymatische spijsvertering stap14,15. Ondanks het voortdurend verbeteren van de cultuuromstandigheden en het herstel van grote aantallen hoogwaardige menselijke eilandjes, blijft de tijd tot transplantatie een cruciale factor. Tijdens de eerste dagen van de cultuur vertonen menselijke eilandjes een aanzienlijk verlies van intra-eilandje ECs en op zes dagen cultuur kunnen slechts kleine endotheelstructuren in de eilandjeskern worden gedetecteerd16. Dit verlies van intra-islet endotheelcellen zou een kritische factor kunnen zijn bij het verminderen van het enten van menselijke eilandjes, omdat donoreiland-ECs belangrijke spelers zijn in het revascularisatieproces17.
Het handhaven van steriliteit tijdens de transplantatieprocedure is van cruciaal belang om ooginfecties in de immuungecompromitteerde NOD te voorkomen. ROSA-tomaat. Rag2-/- muizen. Typisch, transplantatie procedures worden uitgevoerd onder schone omstandigheden met behulp van handschoenen, lab jas, hoofddeksel, en mondmasker, maar niet in een biosafety kabinet. Alle gebruikte oplossingen zijn steriel gefilterd, en spuiten, canule, slang, en gaas worden gespoeld in 70% ethanol. Wake-up kooien zijn autoclaved. Hoewel volledige steriliteit niet kan worden gegarandeerd vanwege handmatige behandeling van de muis tijdens de procedure, zijn eilandjesbesmetting of ooginfecties geen problemen met deze procedure.
Stabiele en adequate anesthesie is een belangrijke en kritische factor voor het verminderen van oogbewegingen en drift tijdens lage framerate data-acquisitie, en effectiviteit kan variëren tussen verschillende verdovingsmiddelen18. Onder licht, algemene isoflurane anesthesie, beweegt het oog af en toe langzaam rollend en verhoogde diepte van anesthesie (van 1-2%) kan over het algemeen oogbewegingen verminderen. Het duidelijke voordeel van het gebruik van inhaleerbare anesthesie is het snelle effect en de hersteltijd. Er moet echter op worden gewezen dat het gebruik van isoflurane de insulineafscheiding19kan veranderen.
Beeldanalyse en segmentatie, of het opsplitsen van een afbeelding in meerdere regio's, zijn uitdagend en onderhevig aan potentiële bias in gegevensselectie20. Segmentatie is bedoeld om objecten zoals de "eilandje vasculature" voor kwantificering te identificeren. Hier werden methoden op basis van de intensiteitsdrempel toegepast op bepaalde regio's (d.w.z. "absolute intensiteit") of intensiteitsverschillen om randen te vinden (d.w.z. "achtergrondaftrekken"). Momenteel zijn er geen universele oplossingen voor segmentatie in fluorescerende microscopie. Een benadering is om te experimenteren met commerciële software die een scala aan methoden ondersteunt. Als drempelwaardering mislukt vanwege de variatie in de achtergrondintensiteit, kunnen kleine wijzigingen in de instellingen voor het vastleggen van afbeeldingen de segmentatieresultaten verbeteren.
Een beperking van de methode ligt in het feit dat de menselijke graft sneller wordt vervangen door ontvangercellen en, in feite, volledig gereconstrueerd door muisontvangeren endotheelcellen. Dit zou studies van menselijke celinteracties uitsluiten als het doel is om adoptief overgedragen menselijke immuuncellen te bestuderen die via interacties met menselijke endotheelcellen naar het eilandje parenchyma migreren. Echter, zowel in muis en menselijk eilandje grafts, soortgelijke revascularisatie optreedt van de ontvanger en volgt de verschillende anatomische 3D-plan specifiek voor de soort.
De slagingspercentages van bètacelvervangende therapie zijn blijvenverbeteren. Toch blijven verschillende uitdagingen bij de evaluatie van de efficiëntie van eilandjes en overleving in vivo onopgelost vanwege het gebrek aan geschikte intravital imaging technologieën. De voorste oogkamer is een nuttige transplantatie site, ter ondersteuning van de herhaalde en lange termijn in vivo beeldvorming van eilandje cellen voor de studie van eilandje morfologie, vascularisatie patronen, bètacelfunctie, en bètacel dood bij een cellulaire resolutie.
Het hier gemelde protocol voor het bestuderen van het entingsproces van menselijke eilandjestransplantaties in de HIER gerapporteerde ACE-transplantatieplaats maakt longitudinale monitoring van menselijke eilandjesgrafts met een aanzienlijk hogere resolutie mogelijk dan die welke is verkregen met andere alternatieve longitudinale platforms zoals MRI21,22, PET23, SPECT24of Bioluminescentie25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Zweedse Onderzoeksraad, Strategisch Onderzoeksgebied Exodiab, Dnr 2009-1039, de Zweedse Stichting voor Strategisch Onderzoek Dnr IRC15-0067 aan LUDC-IRC, de Royal Physiographic Society in Lund, Diabetesförbundet en Barndiabetesförbundet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al. Inflammatory response in islet transplantation. International Journal of Endocrinology. 2014, 451035 (2014).
- Nanji, S. A., Shapiro, A. M. Advances in pancreatic islet transplantation in humans. Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).
- Malaisse, W. J., Maedler, K. Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans. Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).
- Kim, D., Jun, H. S. In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets. Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).
- Speier, S., et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Yang, S. N., Berggren, P. O. The eye as a novel imaging site in diabetes research. Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).
- Schmidt-Christensen, A., et al. Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes. Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).
- Berclaz, C., et al. Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging. Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).
- Nilsson, J., et al. Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation. Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapteer 4 Unit 4 11-24 (2013).
- Goto, M., et al. Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture. Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Jansson, L., Carlsson, P. O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
- Konstantinova, I., Lammert, E. Microvascular development: learning from pancreatic islets. Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).
- Fransson, M., et al. Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model. Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).
- Nyqvist, D., et al. Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization. Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).
- Nair, G., et al. Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).
- Iwasaka, H., et al. Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia. Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).
- Hamilton, N. Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging. Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).
- Michelotti, F. C., et al. PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function. Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).
- Wang, P., et al. Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI. Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).
- Gotthardt, M., et al. Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer. Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).
- Joosten, L., et al. Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).
- Virostko, J., et al. Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).
