Summary
Det nuvarande protokollet genererar mesh-formade konstruerade hjärt vävnader som innehåller kardiovaskulära celler som härrör från mänskliga inducerad pluripotenta stamceller för att möjliggöra undersökning av cellimplantation terapi för hjärtsjukdomar.
Abstract
Det aktuella protokollet beskriver metoder för att generera skalbara, meshformade konstruerade hjärtvävnader (ECTs) som består av kardiovaskulära celler som härrör från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), som utvecklas mot målet för klinisk användning. HiPSC-härledda kardiomyocyter, endotelceller och vaskulär väggmålning celler blandas med gel matris och sedan hälls i en polydimetylsiloxan (PDMS) vävnad mögel med rektangulära interna förskjutna inlägg. Genom kultur dag 14 ECTs mogna till en 1,5 cm x 1,5 cm mesh struktur med 0,5 mm diameter myofiber buntar. Kardiomyocyter anpassa till den långa-axeln av varje bunt och spontant slå synkront. Detta tillvägagångssätt kan skalas upp till en större (3,0 cm x 3,0 cm) nät ECT samtidigt som konstruera mognad och funktion. Således, mesh-formad ECTs genereras från hiPSC-härledda hjärt celler kan vara genomförbart för hjärt regenerering paradigm.
Introduction
Många prekliniska studier och kliniska prövningar har bekräftat effektiviteten i cell-baserade hjärt regenerativa terapier för sviktande hjärtan1,2,3. Bland olika celltyper, mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) är lovande cellkällor på grund av deras proliferativ förmåga, potential att generera olika kardiovaskulära härstamningar4,5, och allogenicity. Dessutom har vävnadsteknik gjort det möjligt att överföra miljontals celler till ett skadat hjärta5,6,7,8.
Tidigare rapporterade vi generering av tredimensionella (3D) linjära konstruerade hjärtvävnader (ECTs) från hiPSC-härledda kardiovaskulära härstamningar med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt odlingssystem för 3D bioartificial vävnader5,7. Vi fann att samexistensen mellan Vaskulär endotel celler och väggmålning celler med kardiomyocyter inom ECT underlättas strukturella och elektrofysiologisk vävnad mognad. Vidare validerade vi den terapeutiska potentialen av implanterade hiPSC-ECTs i en immun tolerant råtta hjärtinfarkt modell för att förbättra hjärtfunktionen, regenerera myokardium, och förbättra angiogenes5. De linjära ECT:erna konstruerade med denna metod var dock 1 mm gånger 10 mm cylindrar och därför inte lämpliga för implantationen i prekliniska studier med större djur eller klinisk användning.
Baserat på en framgångsrik användning av vävnad formar för att generera porösa konstruerad vävnadsbildning med hjälp av råtta skelett myoblaster och kardiomyocyter9, mänskliga ESC-härledda kardiomyocyter10 och mus iPSCs11, utvecklade vi ett protokoll för att generera skalbar hiPSC-härledda större implanterbar vävnad med hjälp av polydimetylsiloxan (PDMS) formar. Vi utvärderade en rad mögelgeometrier för att bestämma de mest effektiva mögelegenskaperna. Mesh-formade ECTs med flera buntar och korsningar uppvisade utmärkta egenskaper i cellens livskraft, vävnadsfunktion och skalbarhet jämfört med vanligt-ark eller linjära format som saknade porer eller korsningar. Vi implanterade nätformade ECT i en råtta hjärtinfarkt modell och bekräftade dess terapeutiska effekter liknar implanterade cylindriska ECTs12. Här beskriver vi protokollet för att generera en hiPSC-härledda mesh-formad ECT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Underhåll av hiPSCs och kardiovaskulär differentiering
- Expandera och underhålla hiPSCs på tunn-coat källaren membran matris (tillväxtfaktor minskat, 1:60 utspädning) i konditionerat medium utvinns ur mus embryonala fibroblaster (MEF-CM) med mänskliga grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (hbFGF)4.
OBS: Vi använde en hiPSCs (4-faktor (Oct3/4, Sox2, Klf4 och c-Myc) linje: 201B6). Tillsätt hbFGF vid lämplig koncentration för varje cellinje. Laminin-511 fragment kan också användas för beläggning av kultur skålen i stället för källaren membran matris. Kommersiellt tillgängligt medium som utformats för matarfri kultur av hiPSC kan användas som ersättning för MEF-CM. - Använd Versene (0,48 mM etylendiamintetraättik syra (EDTA) lösning) att lossa och dissociate celler när cellkonfluency når 90\u2012100%.
OBS: Andra kommersiellt tillgängliga produkter för cell dissociation kan också användas. - Plattceller vid en densitet på 10 000 celler/mm2 på matrixbelagda cellodlingsplattor i MEF-CM med hbFGF och kultur i två till tre dagar.
- När kulturen blir helt konfluent, täck cellerna med matris (1:60 utspädning med MEF-CM) under en dag.
- Ersätt MEF-CM med RPMI 1640 + B27 medium. Lägg 100 ng/mL av Activin A och 100 ng/mL av Wnt3A till mediet under en dag.
OBS: Detta är dag 0 av differentiering. För att upreglera kanonisk Wnt-signalering kan GSK3β-hämmare också användas istället för Wnt3A. - På dag 1 av differentiering, ändra mediet till nya RPMI 1640 + B27 med 10 ng/mL av BMP4 och 10 ng/mL av hbFGF. Kulturceller för två (MC-protokoll) eller fyra (CM+EC-protokoll) dagar utan mediumändring5.
OBS: CM+EG-protokollet är optimerat för att samtidigt inducera kardiomyocyter (CMs) och vaskulära endotelceller (EC). MC-protokollet är optimerat för att företrädesvis inducera vaskulära väggmålningsceller (MC). - CM+EG-protokoll för induktion av CMs och EC (figur 1A).
- Ersätt mediet på dag 5 av differentiering med RPMI 1640 + B27 kompletterat med 50 ng/mL av VEGF165.
- Ändra odlingsmediet var 48 h till dag 13\u201215 av differentiering.
- MC-protokoll för induktion av vaskuläraväggmålningsceller ( Figur 1B)
- Ersätt mediet med RPMI1640 + 10% fetala nötkreatur serum (FBS) vid dag 3 av differentiering.
- Ändra odlingsmediet var 48 h till dag 13\u201215 av differentiering.
2. Cell skörd och härstamning analys på differentiering dag 13\u201215
- Tvätta cellerna med Ca2+ och Mg2+ gratis fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Lägg till cell dissociation lösning (som innehåller proteaser, kollagenaser och DNAsarer) i cellodling skålen för att täcka plattan. Inkubera plattan i 5 min vid 37 °C.
- Samla och separera cellerna med odlingsmedium med hjälp av en pipett efter inkubation.
- Allokera 1 x10 6 celler för härstamningsanalys med flödescytometri. För att eliminera döda celler, färga cellerna med fixerbara livsduglig färgämne.
- Fläcka cellerna med membranytmarkörer i PBS med 5% FBS. Använd följande utspädningar av antikropp i fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) infärgningsbuffert: anti-PDGFRβ (1:100), anti-VE-kadherin (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
- För intracellulära proteiner, resuspend och fixera cellerna med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS.
- Fläck cellerna med anti-hjärt isoform av Troponin T (cTnT) i PBS med 5% FBS och 0,75% Saponin, sedan märka cTnT antikroppen med 488 mus IgG1 (utspädning 1:50).
- Resuspend de färgade cellerna i PBS med 5% FBS och lägg dem i FACS-rör med cellsil.
- Analysera cellsammansättningen av de färgade cellerna från varje differentieringsprotokoll med flödescytometri för att underlätta genereringen av cellupphängningar med definierade härstamningsfördelningar.
OBS: Medan denna procedur görs, bevaras återstående cellupphängning för ECTs i ett 4 °C kylskåp.
3. Tillverkning av PDMS vävnad mögel
- Gjutet ett 0,5 mm tjockt och över 30 mm x 30 mm skikt polydimetylsiloxan (PDMS) genom att blanda prepolymer- och tvärbindningslösningen vid förhållandet 10:1 och därefter bota vid 80 °C i 3 h.
- Klipp PDMS-arket och bind det med silikonlim för att fabricera ett rektangulärt fack på 21 mm x 20,5 mm med 7 mm lång, 0,5 mm bred och 2,5 mm höga rektangulära stolpar i ett förskjutet läge. Horisontellt inläggsavstånd mellan två stolpar är 2,5 mm (Bild 2B).
- Autoklavera tråget vid 120 °C i 20 min.
- Bestryka brickan med 1% poloxamer 407 i PBS i 1 h. Skölj ur poloxamer 407 och skölj formen med PBS tillräckligt före användning.
4. ECT konstruktion
- Efter analysen av cellens härstamning, kombinera cellerna från CM+EC- och MC-protokoll så att den slutliga koncentrationen av MCs är 10 till 20% i ett totalt celltal på sex miljoner celler per konstruera5.
- Suspendblandade sex miljoner celler i ECT odlingsmedium (alfa minimum essentiellt medium kompletterat med 10% FBS, 50 μM 2-merkaptoanol och 100 U/mL Penicillin-Streptomycin).
- Beredning av matrislösning
- Blanda 133 μL av syralöslig råttstjärtkollagen typ I-lösning (2 mg/mL, pH 3) med 17 μL av 10x minimum essential medium (MEM). Blanda sedan lösningen med 17 μL alkalibuffert (0,2 M NaHCO3, 0,2 M HEPES, och 0,1 M NaOH).
OBS: Kollagen måste hållas på is (4 °C). Kontrollera buffertfärg och om mediet inte blir rosaaktigt när alla lösningar blandas, lägg till ytterligare alkalibuffert till mediet. Blandningsstegen måste blanda kollagen I + 10x MEM, och sedan lägga till alkalibuffert. Ändra INTE denna ordning. Generera INTE bubblor i mixen. - Tillsätt 67 μL av källarmembranmatrisen till den neutraliserade kollagenlösningen.
OBS: Den blandade lösningen måste hållas på is (4 °C).
- Blanda 133 μL av syralöslig råttstjärtkollagen typ I-lösning (2 mg/mL, pH 3) med 17 μL av 10x minimum essential medium (MEM). Blanda sedan lösningen med 17 μL alkalibuffert (0,2 M NaHCO3, 0,2 M HEPES, och 0,1 M NaOH).
- Centrifugera den beredda cell suspension som innehåller sex miljoner celler vid 1.100 rpm (240 x g) för 5 min och resuspend cellerna med 167 μL av hög-glukos DMEM + 20% FBS + 1% penicillin-streptomycin (100x).
- Blanda cellupphängningen och matrislösningen. Den totala volymen av cell/matrisblandning för en konstruktion är 400 μL.
OBS: Cell/matrixblandningen ska vara icke-viskös och en rosaaktig färg vid detta steg. Håll den på is eftersom gelen kommer att stelna i rumstemperatur. Den slutliga koncentrationen av kollagen typ I är 0.67 mg/mL. - Häll cellen/ matrisblandningen jämnt över poloxamer 407 belagda PDMS vävnad mögel, som placeras i en sex-väl kultur tallrik12.
OBS: Häll blandningen försiktigt för att undvika att generera bubblor för att förhindra fyllnadsfel i den hällda gelen. - Inkubera cell/matrisblandningen i en vanlig CO2-inkubator (37C, 5 % CO2) i 60 min.
- Efter vävnaden bildas, blöt vävnaden mögel med 4 mL ECT odlingsmedium.
OBS: Även om cellen/ matrisen är korslänkad på 60 min, är konstruktionen fortfarande mycket skör. Tillsätt medium försiktigt för att undvika att skada den. - Odla vävnaden i 14 dagar med medium förändring varje dag.
- Innan ECT-implantationen ska ECT avlägsnas från laststolparna försiktigt med steriliserade fina tyningar.
OBS: Den slutliga ECT dimensioner efter avlägsnande från formen är mindre än den ursprungliga mögel. En 2,1 cm x 2,05 cm mögel genererar en utsläppt ECT på cirka 1,5 cm x 1,5 cm. En större 3,9 cm x 4,05 cm mögel genererar en ECT på cirka 3 cm x 3 cm. Oladstad ECT visar inneboende spontana slå i varm odling medium. Även om det initialt underhåller en nätstruktur, krymper och kondenserar en obelastad ECT över tiden. Det är möjligt att hålla vävnaden mjukt med fina tlyck och sedan använda 7-0 siden sutur för att fästa ECT till epipium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bild 1A,B visar scheman för CM+EG och MC-protokollet. Efter att ha inducera CMs och ECs från CM + EG-protokollet och MC från MC-protokollet, cellerna är blandade justera slutliga MC koncentrationer för att representera 10 till 20% av totala celler. Den 2 cm breda vävnadsformen är påhittad enligt konstruktionsritningen från 0,5 mm tjock PDMS-ark (Figur 2A,B). Sex miljoner CM+EC+MC-celler kombineras med kollagen I, och matris och hälls på vävnadsformen förbelagd med poloxamer 407 (Figur 2C). Under preliminära experiment, vi tillverkade vävnad formar med olika mönster som kännetecknas av olika inlägg längder och avstånd och bekräftade slutliga geometrier av ECTs (Figur 3). Vi valde formen med 7 mm långa stolpar med 2,5 mm breda intervall för denna studie.
Poloxamer 407 förhindrar celladhesion till formen och möjliggjorde bildandet av karakteristiska nätstruktur efter snabb gelkompasation i 14 dagar (Figur 4). Denna struktur bibehålls även efter ECT frigörs från sin form. Hela vävnaden är cirka 1,5 cm bred och 0,5 mm tjock, och bredden på varje bunt i nätet är ungefär 0,5 mm i genomsnitt.
Det är möjligt att generera en 3 cm slutlig bredd maska ECT som innehåller tjugofyra miljoner celler från en fyra gånger större mögel med samma förskjutna post design (Figur 5A,B). Denna större mesh ECT kan tas bort från formen enkelt och genererar lokal aktiv kraft motsvarande den mindre nät ECT (Figur 5C).
Figur 1: Protokoll för att skilja kardiovaskulära celler från humaninducerade pluripotenta stamceller. Schematiska diagram över protokoll som används för att inducera kardiomyocyter och vaskulära endotelceller (A, CM+EG-protokollet) och för att inducera vaskulära väggmålningsceller (B, MC-protokoll). CM = kardiomyocyte; EC = endotelcell; MC = kärl väggmålning cell; iPSC = inducerad pluripotent stamcell; MG = källaren membran matris; ActA = Activin A; Wnt3a, BMP4, Benmorfogetiskt protein 4; bFGF = grundläggande fibroblasttillväxtfaktor; VEGF = kärl endotelcelltillväxtfaktor; FBS = fetalt bovint serum. Denna siffra är anpassad från referens Masumoto et al.5. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Tillverkning av PDMS vävnad mögel och ECT konstruktion. (A) Representativ bild av en ECT-form som är tillverkade av 0,5 mm tjocka PDMS-ark. (B) Utformning av PDMS vävnad mögel med 7 mm långa interna stolpar arrangerade i förskjutet läge; framläge (övre panelen) och sidovy (nedre panelen). (C) Det schematiska protokollet för ECT konstruktion från hiPSC-härledda kardiovaskulära celler och matris gel. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Inverkan av vävnad mögel mönster på slutliga ECT geometrier. (A) Definitioner av längd på inlägg (PL) och horisontellt inläggsavstånd (HPS). (B) En vävnad mögel utan rektangulära inlägg (PL0) och bildade ett ark ECT. (C\u2012E) Vävnadsformar med olika PL/HPS och mesh-ECTs. (F) En vävnad mögel med långa parallella stolpar och bildade en multipel linjär ECT. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Bildande av nät ECT efter gelkompaktonering. Representativa bildserier av en nät ECT-mognad från dag 0 till 14 visas. Cell /matrix hälls i PDMS vävnad mögel (Dag 0_0 h), sedan odlingsmedium läggs en timme senare (Dag 0_1 h). Dag 1 observeras elliptiska porer runt lastningsstolpar. Konstruktionen visade snabb gelkompakering och mognat till en nätvävnad därefter. På dag 14 frigörs vävnaden från formen. Den obelastade ECT bibehåller nätgeometrin. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Representativa bilder av en större nät ECT avsedd för stora prekliniska prövningar av djur och kliniska prövningar. (A) Design av den 4 cm x 4 cm PDMS vävnad mögel med 7 mm långa inlägg och (B) en bild av formen. (C) Representativ bild av en 3 cm x 3 cm större nät ECT. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Patologisk och elektrofysiologisk utvärdering av mesh-EKT. (A) Representativ bild för en bunt i ett nät ECT färgas med Hoechst 33342 (blå) för levande celler och Ethidium Homodimer III (röd) för döda celler. Skala bar: 250 μm. (B) Representativ bild av en tredimensionell konfokal bild av en bunt i ett nät ECT färgas med hjärt troponin T (grön). Lokala kardiomyocyte orienteringar inom bunten visualiseras som små linjer, där linjefärg anger magnitud i den cirkumferential (grön), radiella (röd), och axiella (blå) riktningar. (C) Det sfäriska histogrammet visar lokala kardiomyocyteorienteringar. Volymen för varje stråle representerar det relativa antalet för varje riktning och den tjocka röda linjen visar medelvärdet CM orientering. (B) och (C) anpassas från referens13 med revidering. (D) Representativ bild av contractile kraftmätning. Ett segment var avskurna vid den röda prickade linjen i en 1,5 cm x 1,5 cm mesh ECT och fästs på muskeln testsystem med hjälp av 10-0 nylon sutur. Den vita pilspetsen indikerar kraftgivare och den gula pilspetsen anger höghastighetslängdsregulator. (E) Representativa vågformer av aktiv stress vid olika pacing frekvenser från 1,5 Hz till 4 Hz. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande Video 1: Inneboende misshandel av en korsning i ett nät ECT på dag 14. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Kompletterande Video 2: Inneboende misshandel av en bunt i ett nät ECT på dag 14. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Kompletterande Video 3: Inneboende misshandel av ett nät ECT på dag 14 efter frigörs från vävnaden mögel. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Efter slutförandet av vår undersökning av ett linjärt format, hiPSC härledd ECT5, vi anpassade protokollet för att blanda hiPSC-härledda CMs, ECs och MCs för att underlätta in vitro-expansionen av vaskulära celler inom ECTs och efterföljande in vivo Vaskulär koppling mellan ECTs och mottagare hjärtmuskulatur.
För att underlätta generering av större, implanterbara mesh ECT geometrier vi använde tunna PDMS ark för att utforma 3D-formar med lastning inlägg arrayed på förskjutna positioner. Under preliminära experiment noterade vi att ECTs anslutit sig till PDMS inlägg under gel kompaktering och så vi modifierade vår metod för att belägga varje mögel med den ytaktiva poloxamer att förhindra celladhesion som är ett kritiskt steg i det nuvarande protokollet9. ECTs förblir fristående från den inre lastning stolpar och mögel botten under in vitro-mognad, vilket underlättar gel kompaktering och ECT borttagning från mögel. Ett annat kritiskt steg i protokollet är att jämnt hälla cell-gel matris blandningen i PDMS mögel innan matrisen stelnar. Det är kritiskt att utföra förfarandet inom en kort tid. Bubblor i cell-gel-matrisblandningen bör också undvikas eftersom det kan orsaka strukturell vakuolation och funktionella störningar av ECTs.
Enligt lönsamhetsanalyser var ungefär 97% av cellerna vid liv inom dagen 14 konstruktioner (Supplemental Figure 1A). Kompletterande Figur 1B visar hela fästet confocal bilden färgas med cTnT representerar myofiber anpassning parallellt med den lokala bunten lång axel (Kompletterande Figur 1C)13. Alla konstruktioner börjar inneboende spontana slå in vitro inom 72 h och fortsatte slå under hela varaktigheten av kultur (Kompletterande Videos 1\u20123). Vi analyserade elektromekaniska egenskaper på 1,5 cm x 1,5 cm ECTs med hjälp av en anpassad isolerad muskeltestsystem (Kompletterande Figur 1D). ECTs visade maximal pacing capture priser på 4 Hz och genererade en genomsnittlig aktiv stress på 0,55 mN/mm2 vid 2 Hz, 5 V pacing protokoll (n = 11, standard fel av medel = 0,063; Kompletterande figur 1E).
Även om vi valt 7 mm långa inre lastningsstolpar med 5 mm intervall, är det möjligt att variera den slutliga ECT geometrin genom att ordna längden på lastningsstolpar och intervallet mellan angränsande stolpar (Figur 3). Dessutom är det möjligt att utöka skalan 1,5 cm x 1,5 cm ECTs till större format som 3 cm x 3 cm stora maskor ECT. Enligt kraftmätning visade 3 cm x 3 cm ECTs elektromekaniska egenskaper som liknar 1,5 cm x 1,5 cm ECTs12. Vävnadsformernas flexibilitet och skalbarheten med bevarad vävnadsfunktion är signifikans av det föreliggande protokollet med avseende på redan existerande metoder.
En begränsning av det föreliggande protokollet är att PDMS-formarna är handmonterade från PDMS-ark. Även om byggandet av millimeter-enhet formar skulle vara genomförbart genom hand-montering, formar från fotolitografi eller gjutning från master formar skulle vara mer lämpade för expanderad och stabil ECT generation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga ekonomiska eller vetenskapliga konflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes ekonomiskt av Kosair Charities Pediatric Heart Research Program vid University of Louisville och Organoid Project vid RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. HiPSCs används i våra publicerade protokoll tillhandahölls av Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
References
- Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
- Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure. Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).
- Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1. European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).
- Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Scientific Reports. 4, 6716 (2014).
- Masumoto, H., et al. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Scientific Reports. 6, 29933 (2016).
- Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).
- Fujimoto, K. L., et al. Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function. Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).
- Lancaster, J. J., et al. Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue. Vessel Plus. 2019, (2019).
- Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues. Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
- Christoforou, N., et al. Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues. PloS one. 8, 65963 (2013).
- Nakane, T., et al. Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue. Scientific Reports. 7, 45641 (2017).
- Kowalski, W. J., et al. Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue. Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).
