Summary
Le protocole actuel génère des tissus cardiaques en forme de maille contenant des cellules cardiovasculaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour permettre l’étude de la thérapie d’implantation cellulaire pour les maladies cardiaques.
Abstract
Le protocole actuel décrit les méthodes de production de tissus cardiaques évolutifs et en forme de maille (ECT) composés de cellules cardiovasculaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs), qui sont développées vers l’objectif de l’utilisation clinique. Les cardiomyocytes dérivés de HiPSC, les cellules endothéliales et les cellules murales vasculaires sont mélangés à une matrice de gel, puis versés dans un moule tissual polydiméthylsiloxane (PDMS) avec des poteaux rectangulaires décalés internes. Par jour de culture, 14 ECT mûrissent en une structure en maille de 1,5 cm x 1,5 cm avec des faisceaux de myofiber de 0,5 mm de diamètre. Les cardiomyocytes s’alignent sur le long axe de chaque faisceau et battent spontanément de façon synchrone. Cette approche peut être étendue jusqu’à un plus grand (3,0 cm x 3,0 cm) maillage ECT tout en préservant la maturation de la construction et la fonction. Ainsi, les ECT en forme de maille générées par les cellules cardiaques hiPSC-dérivées peuvent être réalisables pour les paradigmes de régénération cardiaque.
Introduction
De nombreuses études précliniques et essais cliniques ont confirmé l’efficacité des thérapies régénératrices cardiaques à base de cellules pour les cœurs défaillants1,2,3. Parmi divers types de cellules, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs) sont des sources de cellules prometteuses en raison de leur capacité proliférative, le potentiel de générer diverses lignées cardio-vasculaires4,5, et l’allogénicité. En outre, les technologies d’ingénierie tissulaire ont permis de transférer des millions de cellules sur un cœur endommagé5,6,7,8.
Auparavant, nous avons signalé la génération de tissus cardiaques linéaires (ECT) linéaires tridimensionnels (ECT) à partir de lignées cardiovasculaires dérivées de hiPSC à l’aide d’un système de culture disponible dans le commerce pour les tissus bioartificiels 3D5,7. Nous avons constaté que la coexistence des cellules endothéliales vasculaires et des cellules murales avec des cardiomyocytes dans l’ECT a facilité la maturation structurelle et électrophysiologique de tissu. En outre, nous avons validé le potentiel thérapeutique des hiPSC-ECT implantés dans un modèle d’infarctus du myocarde de rat tolérant immunitaire pour améliorer la fonction cardiaque, régénérer le myocarde, et améliorer l’angiogenèse5. Toutefois, les ECT linéaires construits par cette méthode étaient des cylindres de 1 mm sur 10 mm et ne convenaient donc pas à l’implantation dans des études précliniques avec des animaux plus grands ou une utilisation clinique.
Basé sur l’utilisation réussie des moules de tissu pour générer la formation de tissu poreux conçu utilisant des myoblastes squelettiques de rat et des cardiomyocytes9,les cardiomyocytes humains esc-dérivés10 et les iPSCs de souris11, nous avons développé un protocole pour produire des tissus implantables plus grands hilosC-dérivés évolutifs utilisant des moules polydiméthylsiloxanes (PDMS). Nous avons évalué une gamme de géométries de moule pour déterminer les caractéristiques les plus efficaces de moule. Les ECT en forme de maille avec plusieurs faisceaux et jonctions présentaient d’excellentes caractéristiques en matière de viabilité cellulaire, de fonction tissulaire et d’évolutivité par rapport aux formats en feuilles simples ou linéaires qui manquaient de pores ou de jonctions. Nous avons implanté l’ECT en forme de maille dans un modèle d’infarctus du myocarde de rat et confirmé ses effets thérapeutiques similaires aux ECT cylindriques implantés12. Ici, nous décrivons le protocole pour générer un ECT en forme de maille dérivé de hiPSC.
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Protocol
1. Entretien des hiPSC et différenciation cardiovasculaire
- Étendre et maintenir les hiPSC sur la matrice membranaire du sous-sol à couche mince (facteur de croissance réduit, dilution de 1:60) dans un milieu conditionné extrait des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF-CM) avec le facteur de croissance du fibroblaste de base humain (hbFGF)4.
NOTE: Nous avons utilisé une ligne hiPSCs (4 facteurs (Oct3/4, Sox2, Klf4 et c-Myc) : 201B6). Ajouter hbFGF à la concentration appropriée pour chaque lignée cellulaire. Le fragment de laminine-511 peut également être utilisé pour le revêtement du plat de culture au lieu de la matrice de membrane de sous-sol. Le support disponible dans le commerce conçu pour la culture sans alimentation des hiPSC peut être utilisé comme substitut au MEF-CM. - Utilisez la solution Versene (0,48 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour détacher et dissocier les cellules lorsque la confluence cellulaire atteint 90\u2012100%.
REMARQUE : D’autres produits disponibles dans le commerce pour la dissociation cellulaire peuvent également être utilisés. - Plaquez des cellules à une densité de 10 000 cellules/mm2 sur des plaques de culture cellulaire enduites de matrice dans MEF-CM avec hbFGF et culture pendant deux à trois jours.
- Lorsque la culture devient complètement confluente, couvrir les cellules avec la matrice (1:60 dilution avec MEF-CM) pendant une journée.
- Remplacez le MEF-CM par un support RPMI 1640 + B27. Ajouter 100 ng/mL d’Activin A et 100 ng/mL de Wnt3A au milieu pour une journée.
NOTE: C’est le jour 0 de la différenciation. Pour upréguler la signalisation canonique Wnt, les inhibiteurs de GSK3β peuvent également être utilisés au lieu de Wnt3A. - Le premier jour de différenciation, changer le milieu à nouveau RPMI 1640 + B27 avec 10 ng/mL de BMP4 et 10 ng/mL de hbFGF. Cellules de culture pour deux jours (protocole MC) ou quatre jours (protocole CM+EC) sans changement moyen5.
REMARQUE : Le protocole CM+EC est optimisé pour induire simultanément les cellules cardiomyocytes (MC) et les cellules endothéliales vasculaires (CE). Le protocole MC est optimisé pour induire de préférence les cellules murales vasculaires (MC). - Cm+EC pour l’induction des MC et DES (Figure 1A).
- Remplacer le milieu le jour 5 de la différenciation par RPMI 1640 + B27 complété par 50 ng/mL de VEGF165.
- Changer le milieu de culture tous les 48 h jusqu’au jour 13\u201215 de différenciation.
- Protocole MC pour l’induction de cellules murales vasculaires (Figure 1B)
- Remplacer le milieu par RPMI1640 + 10% sérum bovin fœtal (FBS) au jour 3 de la différenciation.
- Changer le milieu de culture tous les 48 h jusqu’au jour 13\u201215 de différenciation.
2. Analyse de la récolte cellulaire et de la lignée le jour de différenciation 13\u201215
- Laver les cellules avec ca2+ et Mg2+ saline à tampons de phosphate libre (PBS).
- Ajouter la solution de dissociation cellulaire (contenant des protéases, des collagènes et des DNAses) dans le plat de culture cellulaire pour couvrir l’assiette. Incuber la plaque pendant 5 min à 37 °C.
- Recueillir et dissocier les cellules avec un milieu de culture à l’aide d’une pipette après incubation.
- Allouer 1 x 106 cellules pour l’analyse de lignée avec cytométrie de flux. Pour éliminer les cellules mortes, tachez les cellules avec un colorant de viabilité réparable.
- Tacher les cellules avec des marqueurs de surface membranaires dans PBS avec 5% FBS. Utiliser les dilutions suivantes d’anticorps dans le tampon de coloration des cellules activées par fluorescence (FACS) : anti-PDGFRβ (1:100), anti-VE cadhérine (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
- Pour les protéines intracellulaires, resuspendez et fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans PBS.
- Tacher les cellules avec l’isoforme anti-cardiaque de Troponin T (cTnT) dans PBS avec 5% FBS et 0,75% Saponin, puis étiqueter l’anticorps cTnT avec 488 souris IgG1 (dilution 1:50).
- Resuspendez les cellules tachées dans PBS avec 5% FBS et les mettre dans des tubes FACS avec passoire cellulaire.
- Analyser la composition cellulaire des cellules tachées de chaque protocole de différenciation avec cytométrie de flux pour faciliter la génération de suspensions cellulaires avec des distributions de lignée définies.
REMARQUE : Lors de cette procédure, la suspension cellulaire restante pour les ECT est conservée dans un réfrigérateur à 4 °C.
3. Fabrication de moule de tissu de PDMS
- Lancer une couche de polydiméthylsiloxane (PDMS) de 0,5 mm d’épaisseur et plus de 30 mm x 30 mm, puis guérir à 80 °C pendant 3 h.
- Coupez la feuille PDMS et attachez-la à de l’adhésif en silicone pour fabriquer un plateau rectangulaire de 21 mm x 20,5 mm de 7 mm de long, 0,5 mm de large et des poteaux rectangulaires de 2,5 mm de haut à une position décalée. L’espacement horizontal des poteaux entre deux lignes de poteaux est de 2,5 mm (figure 2B).
- Autoclavez le plateau à 120 °C pendant 20 min.
- Enrober le plateau de 1% de poloxamère 407 en PBS pendant 1 h. Rincer le poloxamère 407 et rincer le moule avec pbs suffisamment avant l’utilisation.
4. Construction ECT
- Après l’analyse de la lignée cellulaire, combiner les cellules des protocoles CM+EC et MC de sorte que la concentration finale de MC est de 10 à 20% dans un nombre total de cellules de six millions de cellules par construction5.
- Suspendre six millions de cellules mélangées dans le milieu de culture ECT (milieu essentiel minimum alpha complété par 10% FBS, 50 μM 2-mercaptoethanol et 100 U/mL Péicilline-Streptomycine).
- Préparation de la solution matricielle
- Mélanger 133 μL de solution de collagène de type I de collagène de queue de rat soluble acide (2 mg/mL, pH 3) à 17 μL de milieu essentiel minimum de 10 x (MEM). Mélanger ensuite la solution avec 17 μL de tampon alcalin (0,2 M NaHCO3, 0,2 M HEPES et 0,1 M NaOH).
REMARQUE : Le collagène doit être conservé sur la glace (4 °C). Vérifiez la couleur de la mémoire tampon et si le milieu ne devient pas rosé lorsque toutes les solutions sont mélangées, ajoutez un tampon alcalin supplémentaire au milieu. Les étapes de mélange doivent être mélanger collagène I + 10x MEM, puis ajouter tampon alcalin. NE MODIFIEZ PAS cet ordre. Ne pas générer de bulles dans le mélange. - Ajoutez 67 μL de matrice de membrane de sous-sol à la solution neutralisée de collagène.
REMARQUE : La solution mixte doit être conservée sur la glace (4 °C).
- Mélanger 133 μL de solution de collagène de type I de collagène de queue de rat soluble acide (2 mg/mL, pH 3) à 17 μL de milieu essentiel minimum de 10 x (MEM). Mélanger ensuite la solution avec 17 μL de tampon alcalin (0,2 M NaHCO3, 0,2 M HEPES et 0,1 M NaOH).
- Centrifuger la suspension cellulaire préparée contenant six millions de cellules à 1 100 tr/min (240 x g)pendant 5 min et resuspender les cellules avec 167 μL de DMEM à haute teneur en glucose + 20 % FBS + 1 % de pénicilline-streptomycine (100x).
- Mélangez la suspension cellulaire et la solution matricielle. Le volume total du mélange cellule/matrice pour une construction est de 400 μL.
REMARQUE : Le mélange cellule/matrice doit être non visqueux et une couleur rosée à cette étape. Gardez-le sur la glace pendant que le gel se solidifie à température ambiante. La concentration finale de collagène de type I est de 0,67 mg/mL. - Verser le mélange cellulaire/matrice uniformément sur le moule de tissu pdms enduit de poloxamer 407, qui est placé dans une plaque de culture de six puits12.
REMARQUE : Versez soigneusement le mélange pour éviter de générer des bulles afin d’éviter de remplir les défauts dans le gel versé. - Incuber le mélange cellule/matrice dans un incubateur standard de CO2 (37C, 5 % CO2) pendant 60 min.
- Après la formation du tissu, tremper le moule tissulaire avec 4 mL de milieu de culture ECT.
REMARQUE : Bien que la cellule/matrice soit croisée en 60 min, la construction est encore très fragile. Ajouter le milieu doucement pour éviter de l’endommager. - Culture du tissu pendant 14 jours avec changement moyen chaque jour.
- Avant l’implantation ect, retirez l’ECT des poteaux de chargement doucement à l’aide de forceps fins stérilisés.
NOTE: Les dimensions ect finale après l’enlèvement du moule sont inférieures au moule d’origine. Un moule de 2,1 cm x 2,05 cm génère un ECT libéré d’environ 1,5 cm x 1,5 cm. Un moule plus grand de 3,9 cm x 4,05 cm génère un ECT d’environ 3 cm x 3 cm. L’ECT déchargé montre des battements spontanés intrinsèques dans le milieu de culture chaude. Bien qu’il maintienne d’abord une structure en maille, un ECT déchargé rétrécit et se condense au fil du temps. Il est possible de tenir le tissu doucement avec des forceps fins et ensuite utiliser 7-0 suture de soie pour attacher l’ECT à l’épicardium.
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Representative Results
La figure 1A,B montre les schémas du protocole CM+EC et MC. Après avoir induit les MC et les EC du protocole CM+EC et des MC à partir du protocole MC, les cellules sont mélangées en ajustant les concentrations finales de MC pour représenter 10 à 20 % du total des cellules. Le moule tissulaire de 2 cm de large est fabriqué selon le dessin de conception à partir de 0,5 mm d’épaisseur de la feuille PDMS (Figure 2A,B). Six millions de cellules CM+EC+MC sont combinées avec le collagène I, et la matrice et versé sur le moule tissulaire précoxé avec poloxamère 407 (Figure 2C). Au cours d’expériences préliminaires, nous avons fabriqué des moules tissulaires avec divers motifs caractérisés par diverses longueurs de poste et d’espacement et confirmé les géométries finales des ECT (Figure 3). Nous avons sélectionné le moule avec des poteaux de 7 mm de long avec des intervalles de 2,5 mm de large pour cette étude.
Poloxamer 407 empêche l’adhérence cellulaire au moule et a permis la formation d’une structure de maille caractéristique après un compactage rapide du gel en 14 jours (Figure 4). Cette structure est maintenue même après que l’ECT est libéré de son moule. Le tissu entier est d’environ 1,5 cm de large et 0,5 mm d’épaisseur, et la largeur de chaque faisceau dans la maille est d’environ 0,5 mm en moyenne.
Il est possible de générer un CET de maille de largeur finale de 3 cm contenant vingt-quatre millions de cellules à partir d’un moule quatre fois plus grand avec la même conception de poteau décalée (Figure 5A,B). Cet ECT de maille plus grand peut être enlevé du moule facilement et génère la force active locale équivalente à l’ECT de maille plus petite (Figure 5C).
Figure 1 : Protocoles visant à différencier les cellules cardiovasculaires des cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Diagrammes schématiques des protocoles utilisés pour induire des cardiomyocytes et des cellules endothéliales vasculaires (protocole A, CM+EC) et pour induire des cellules murales vasculaires (protocole B, MC). CM = cardiomyocyte; EC = cellule endothéliale; MC = cellule murale vasculaire; iPSC = cellules souches pluripotentes induites; MG = matrice de membrane de sous-sol; ActA = Activin A; Wnt3a, BMP4, Protéine morphogénétique osseuse 4; bFGF = facteur de croissance fibroblastique de base; VEGF = facteur de croissance cellulaire endothéliale vasculaire; FBS = sérum bovin fœtal. Ce chiffre est adapté de la référence Masumoto et al.5. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Fabrication de moules à tissus PDMS et construction ECT. (A) Image représentative d’un moule ECT fabriqué à partir de feuilles PDMS de 0,5 mm d’épaisseur. (B) Conception du moule tissulaire PDMS avec des poteaux internes de 7 mm de long disposés en position décalée; vue avant (panneau supérieur) et vue latérale (panneau inférieur). (C) Le protocole schématique de la construction ECT à partir de cellules cardiovasculaires dérivées de hiPSC et de gel matriciel. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Incidence des conceptions de moisissures tissulaires sur les géométries finales de l’ECT. (A) Définitions de la longueur du poteau (PL) et de l’espacement horizontal des poteaus (HPS). (B) Un moule de tissu sans poteaux rectangulaires (PL0) et a formé une ect de feuille. (C\u2012E) Moules de tissu avec différents PL/HPS et ECTs de maille. (F) Un moule de tissu avec de longs poteaux parallèles et a formé un ECT linéaire multiple. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Formation d’ECT en maille après compactage du gel. Des séries représentatives d’images d’une maturation d’ECT de maille du jour 0 au 14 sont montrées. La cellule/matrice est versée dans le moule tissulaire de PDMS (jour 0_0 h), puis le milieu de culture est ajouté une heure plus tard (Jour 0_1 h). Le premier jour, des pores elliptiques sont observés autour des poteaux de chargement. La construction a montré le compactage rapide de gel et a mûri dans un tissu de maille par la suite. Le jour 14, le tissu est libéré du moule. L’ECT déchargé maintient la géométrie de la maille. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Images représentatives d’un ECT à mailles plus grande destiné aux essais précliniques et aux essais cliniques sur les grands animaux. (A) Conception du moule de tissu PDMS de 4 cm x 4 cm avec des poteaux de 7 mm de long et (B) une image du moule. (C) Image représentative d’un ECT de maille de 3 cm x 3 cm de plus. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1 : Évaluation pathologique et électrophysiologique des ECT de maille. (A) Image représentative d’un paquet dans un ECT en maille taché de Hoechst 33342 (bleu) pour les cellules vivantes et d’Ethidium Homodimer III (rouge) pour les cellules mortes. Barre d’échelle : 250 μm. (B) Image représentative d’une image confocale tridimensionnelle d’un faisceau dans un ECT de maille taché de troponine cardiaque T (vert). Les orientations cardiomyocytes locales à l’intérieur du faisceau sont visualisées comme de petites lignes, où la couleur de la ligne indique la magnitude dans les directions circumférentielles (vertes), radiales (rouges) et axiales (bleues). (C) L’histogramme sphérique affiche des orientations cardiomyocytes locales. Le volume de chaque rayon représente le nombre relatif pour chaque direction et l’épaisse ligne rouge indique l’orientation cm moyenne. (B) et C) sont adaptés de la référence13 avec révision. (D) Image représentative de la mesure de la force contractile. Un segment a été coupé à la ligne pointillée rouge dans un ECT de maille de 1,5 cm x 1,5 cm et attaché au système d’essai musculaire à l’aide d’une suture en nylon de 10-0. La pointe de flèche blanche indique le transducteur de force et la pointe de flèche jaune indique le contrôleur de longueur à grande vitesse. (E) Formes d’onde représentatives de stress actif à différentes fréquences de rythme de 1,5 Hz à 4 Hz. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.
Vidéo supplémentaire 1 : Battement intrinsèque d’une jonction dans un ECT de maille le jour 14. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo supplémentaire 2 : Battement intrinsèque d’un paquet dans un ECT de maille le jour 14. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo supplémentaire 3 : Battement intrinsèque d’un ECT de maille le jour 14 après libéré du moule de tissu. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Après l’achèvement de notre étude d’un format linéaire, hiPSC dérivé ECT5, nous avons adapté le protocole pour mélanger hiPSC-dérivés CM, EC, et MC pour faciliter l’expansion in vitro des cellules vasculaires dans les ECT et le couplage vasculaire in vivo ultérieur entre ects et myocardium receveur.
Pour faciliter la génération de géométries ECT de mailles plus grandes et implantables, nous avons utilisé de fines feuilles DEDM pour concevoir les moules 3D avec des poteaux de chargement disposés à des positions décalées. Au cours des expériences préliminaires, nous avons noté que les ECT ont adhéré aux postes de PDMS pendant le compactage de gel et nous avons donc modifié notre méthode pour enrober chaque moule avec le poloxamer surfactant pour empêcher l’adhérence cellulaire qui est une étape critique du protocole actuel9. Les ECT restent détachés des poteaux de chargement internes et du fond du moule pendant la maturation in vitro, ce qui facilite le compactage du gel et l’élimination de l’ECT du moule. Une autre étape critique du protocole est de verser uniformément le mélange de matrice cellule-gel dans le moule PDMS avant que la matrice se solidifie. Il est essentiel d’accomplir la procédure dans un court laps de temps. Les bulles dans le mélange de matrice de cellule-gel devraient également être évitées parce qu’elles peuvent causer la vacuolation structurelle et la perturbation fonctionnelle des ECT.
Selon les tests de viabilité, environ 97 % des cellules étaient vivantes au cours de la 14e journée (Figure supplémentaire 1A). La figure supplémentaire 1B montre l’image confocale de montage entière tachée de cTNT représentant l’alignement de myofiber parallèle à l’axe long du faisceau local (Figure supplémentaire 1C)13. Toutes les constructions commencent intrinsèquement spontané battement in vitro dans les 72 h et continue à battre tout au long de la durée de la culture (Vidéos supplémentaires 1\u20123). Nous avons analysé les propriétés électromécaniques de 1,5 cm x 1,5 cm ECT à l’aide d’un système d’essai musculaire isolé personnalisé (Figure supplémentaire 1D). Les ECT affichaient des taux de captage maximal de 4 Hz et généraient un stress actif moyen de 0,55 mN/mm2 à 2 Hz, protocole de rythme de 5 V (n = 11, erreur de moyens standard = 0,063; Figure supplémentaire 1E).
Bien que nous ayons sélectionné des postes de chargement interne de 7 mm de long avec des intervalles de 5 mm, il est possible de varier la géométrie finale de l’ECT en arrangeant la longueur des poteaux de chargement et l’intervalle entre les poteaux adjacents (figure 3). En outre, il est possible d’étendre l’échelle de 1,5 cm x 1,5 cm ECT à des formats plus grands tels que 3 cm x 3 cm de large maille ECT. Selon la mesure de la force, les ECT de 3 cm x 3 cm présentaient des propriétés électromécaniques semblables à des ECT de 1,5 cm x 1,5 cm12. La flexibilité des formes tissulaires et l’évolutivité avec la fonction tissulaire préservée sont des significations du protocole actuel par rapport aux méthodes déjà existantes.
L’une des limites du présent protocole est que les moules PDMS sont assemblés à la main à partir de feuilles PDMS. Bien que la construction de moules millimétriques serait possible par assemblage à la main, les moules de la photolithographie ou de coulée à partir de moules maîtres serait plus approprié pour la génération ECT élargi et stable.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas de conflits financiers ou scientifiques à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu financièrement par le Kosair Charities Pediatric Heart Research Program de l’Université de Louisville et le projet Organoïde du RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. Les HiPSC utilisés dans nos protocoles publiés ont été fournis par le Center for iPS Cell Research and Application, Université de Kyoto, Kyoto, Japon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
References
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