Summary
Een voorwaarts genetisch scherm op basis van Ca2 + hoogte als een read-out leidt tot de identificatie van genetische componenten die betrokken zijn bij calcium afhankelijke signalering trajecten in planten.
Abstract
Voorwaartse genetische schermen zijn belangrijke instrumenten geweest bij de onbevooroordeelde identificatie van genetische componenten die betrokken zijn bij verschillende biologische trajecten. De basis van het scherm is het genereren van een mutant populatie die kan worden gescreend met een fenotype van belang. EMS (ethylmethaansulfonaat) is een veelgebruikt alkylaatmiddel voor het induceren van willekeurige mutatie in een klassiek voorwaarts genetisch scherm om meerdere genen te identificeren die betrokken zijn bij een bepaald proces. Cytosolic calcium (Ca2 +) hoogte is een belangrijke vroege signalering traject dat wordt geactiveerd op stress perceptie. Maar de identiteit van receptoren, kanalen, pompen en transporters van Ca2 + is nog steeds ongrijpbaar in veel studiesystemen. Aequorin is een cellulair calcium reporter eiwit geïsoleerd van Aequorea victoria en stabiel uitgedrukt in Arabidopsis. Door dit te benutten, ontwierpen we een voorwaarts genetisch scherm waarin we ems-mutagenized de aequorine transgene. De zaden van de gemuteerde planten werden verzameld (M1) en screening op het fenotype van belang werd uitgevoerd in de segregatie (M2) populatie. Met behulp van een 96-well high-throughput Ca2+ meetprotocol kunnen verschillende nieuwe mutanten worden geïdentificeerd die een wisselende calciumrespons hebben en in realtime worden gemeten. De mutanten met het fenotype van belang worden gered en gepropageerd tot een homozygoot gemuteerde plantenpopulatie wordt verkregen. Dit protocol biedt een methode voor voorwaartse genetische schermen in Ca2 + reporter achtergrond en identificeren van nieuwe Ca2 + gereguleerde doelen.
Introduction
Een verandering in cytosolic calcium (Ca2+) concentratie op de perceptie van biotische of abiotische stimulus is een goed bestudeerde vroege signalering gebeurtenis die veel signalering trajectenactiveert 1,2,3,4. Een cel in zijn basale rusttoestand behoudt een lagere Ca2+ concentratie in de cytosol en sekwestreert overtollige Ca2+ in verschillende intracellulaire organellen en extracellulaire apoplast die leidt tot een steile Ca2+ hellingsgraad 5,6. Bij signaalperceptie stijgen ca2+ niveaus in de cytosol als gevolg van een toestroom van Ca2+ uit extracellulaire en/of intracellulaire bronnen en genereren ze een stimulispecifieke calciumsignatuur7,8,9. Ca2+ verhogingen in de cytosol worden geactiveerd door vele stimuli, maar de specificiteit wordt gehandhaafd door verschillende winkels die Ca2+vrijgeven, een unieke Ca2+ handtekening en geschikte sensoreiwitten10,11.
Het gebruik van alkylaatmiddel, ethyl-methaansulfonaat (EMS) voor mutagenesis is een krachtig hulpmiddel in klassieke voorwaartse genetische schermen om meerdere onafhankelijke genen te identificeren die betrokken zijn bij een proces. EMS is een chemische mutageen die voornamelijk C tot T en G naar A leidt, willekeurig door het genoom en produceert een verandering van 1 bp in elke 125 kb van het genoom. EMS mutagenesis zal leiden tot ≈1000 single base pair veranderingen, hetzij inbrengen / schrappingen (InDel) of single nucleotide polymorfisme (SNP) per genoom12. EMS-geïnduceerde mutaties zijn meervoudige puntmutaties met een mutatiefrequentie variërend van 1/300 tot 1/30000 per locus. Dit vermindert het aantal M1 planten die nodig zijn om een mutatie in een bepaald gen te vinden. Een M1 zaadpopulatie bereik van 2000-3000 wordt meestal gebruikt om mutaties van belang in Arabidopsis thaliana13,14te verkrijgen .
Aequorin transgenics zijn Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) ecotype planten uitdrukken p35S-apoaequorin (pMAQ2) in de cytosol15. Aequorin is een Ca2+ bindend eiwit bestaande uit apoproteïne en een prothetische groep bestaande uit luciferine molecuul, coelenterazine. De binding van Ca2+ aan aequorin, dat drie Ca2+ bindende EF-hands sites heeft, resulteert in coelenterazine wordt geoxideerd en cyclized om de dioxetanon intermediair te geven, gevolgd door een conformatieverandering van het eiwit vergezeld van het vrijkomen van kooldioxide en singlet-opgewonden coelenteramide16. De aldus geproduceerde coelenteramide zendt een blauw licht (λmax, 470 nm) uit dat kan worden gedetecteerd door de luminometer17. De extreem snelle Ca2+ verhogingen kunnen dus in real time worden gemeten en worden benut voor snelle voorwaartse genetische schermen. Dit protocol is bedoeld om de specificiteit van calciumrespons te gebruiken om nieuwe belangrijke spelers te identificeren die betrokken zijn bij de Ca2+ handtekening. Om deze taak te volbrengen, gebruiken we EMS mutagenesis in transgene aequorine en identificeren we de SNPs die zijn gekoppeld aan gewijzigde Ca2+ signalering. Het protocol identificeert mutanten die geen of verminderde Ca2+ verhogingen vertonen bij toevoeging van stimuli. Deze mutanten kunnen vervolgens in kaart worden gebracht om de genen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de Ca2+ respons. De methode is van toepassing op elke vorm van vloeibare stimuli in planten die resulteert in een Ca2 + hoogte. Aangezien Ca2 + hoogte is een van de eerste reacties in de plant verdediging signalering traject, de identificatie van upstream respons componenten kunnen kandidaten voor genetische manipulatie om veerkrachtige planten te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. EMS mutagenesis en zaadverzameling op basis van één stamboom (1-3 maanden)
- Weeg 150 mg zaden (~ 7500) van aequorine voor EMS mutagenesis (M0 zaden). Weeg nog eens 150 mg zaden om te worden gebruikt als een controle.
- Breng de zaden over op een buis van 50 mL en voeg 25 mL ems (v/v) (v/v) (VOOR behandeling) of 25 mL autoclaved water (voor controle) toe.
OPMERKING: Ethyl-methaansulfonaat is een chemisch middel voor het mutageniseren van plantaardig materiaal. - Verzegel de buis met parafilm en wikkel deze in aluminiumfolie. Draai de buis 18 uur overeind bij kamertemperatuur.
- Laat de zaden te regelen. Verwijder de EMS-oplossing zorgvuldig en gooi deze weg in een afvalcontainer met 1 M NaOH in gelijke volumes (NaOH helpt ems te neutraliseren/inactiveren, waardoor het veilig is om te verwijderen). Gooi het gebruikte plasticgoed weg in een NaOH-oplossing van 1 M.
OPMERKING: Na 24 uur moet u de teruggooi verwijderen volgens laboratoriumpraktijken voor gevaarlijke stoffen. - Was de gemutageniseerde zaden grondig met 40 mL autoclaved water ten minste 8 keer. Gooi EMS met water in een NaOH afvalcontainer zoals hierboven vermeld.
- Voeg voor de laatste wasbeurt 40 mL natriumthiosulfaat van 100 mM toe en spoel 3 keer om sporen van EMS te verwijderen.
- Week de zaden in 40 mL autoclaved water voor ~ 1 uur om EMS diffuus uit zaden en leg ze op filterpapier tot volledig droog.
- Breng de zaden over op een microcentrifugebuis en stratificeer de zaden 2-4 dagen in 4 °C in 40 mL autoclaved water. Dit helpt bij het breken van zaad sluimeren en zorgt voor homogene groei.
- Breng zowel de gemutageniseerde zaden (M0) als de controlezaden over op de bodem (bodemsamenstelling: agropet: soilrite, 1:1) en breng ze over naar groeiruimten met een 16 uur licht/8 uur donkere fotoperiode, een lichtintensiteit van 150 μ·m−2−1 en ~70% relatieve vochtigheid.
- Om te bepalen of mutagenesis succesvol was, op zoek naar verminderde kiemsnelheid en zaailing groei, en chlorofyl sectoring18 (Figuur 1A). Vergelijk de gemutageniseerde planten met de controleplanten om deze fysiologische en ontwikkelingsverschillen te identificeren.
LET OP: Verschillende methoden kunnen worden gebruikt voor het oogsten van zaden van M1 planten. In dit protocol hebben we gebruik gemaakt van de single stamboomgebaseerde zaadverzamelingsmethode. Elke M1 plant krijgt een uniek nummer, van A1 tot A3500. - Houd individueel genummerde planten in stand als afzonderlijke plantenlijnen (figuur 1B).
- Bij rijping oogst u zaden van deze afzonderlijke gemuteerde planten en bewaar deze als afzonderlijke M1-lijnen (figuur 2). Uit de single pedigree-based seed collectie, verkregen we ongeveer 5000 M1 lijnen waarvan 3500 M1 lijnen werden gescreend.
2. Screening met hoge doorvoer op geselecteerde mutanten (8 maanden)
- Identificeer nieuwe mutanten op basis van de Ca2+ reactie op een geselecteerde stimulus. Hier gebruikten we H2O2 als voorbeeld.
- Voor het identificeren van mutanten, het scherm van de M2 generatie. Aangezien recessieve mutanten bij 1/8-frequentie in M2-generatie scheiden op EMS mutagenesis14,beslaat screening van 8-12 M2-segregaterende planten één M1-lijn en identificeert een homozygoot recessieve mutant (met behulp van 12 zaailingen verhoogt de kans op het vinden van een mutant). Test van elke onafhankelijke M1-lijn 12 M2 zaailingen voor Ca2+ respons op H2O2 (12 M2 zaailingen per M1-lijn).
- Gebruik een hoge doorvoer zaad sterilisatie en hydrocultuur plantengroei protocol19. Plaats bijna 12-15 M2 zaden per M1 lijn in individuele putten van een 24-well weefsel kweekplaat en steriliseren met behulp van chloorgas (40 mL van 12% natriumhypochloriet en zoutzuur, 3:1, v/ v) in een desiccator voor 4 uur in een rookkap. Open na de procedure de desiccator en laat 's nachts chloorgas verdampen.
- Breng na sterilisatie platen naar buiten en voeg vloeibare 1/2 MS-media (halfsterkte MS zonder agar) toe aan individuele putten. Verzegel de platen met parafilm en stratificeer de zaden gedurende 2-4 dagen bij 4 °C en verplaats zaden naar een groeikamer met 10 uur licht/ 14 uur donkere fotoperiode bij 20-22 °C met 70% relatieve vochtigheid.
- Zodra de zaailingen zijn 8-12 dagen oud, plaats 12 M2 zaailing van elke lijn individueel in een 96-well luminometer plaat. Voor het meten van Ca2+ respons op H2O2, gebruik een luminometer plaatlezer.
- Voeg na zaailingoverdracht 150 μL 5-10 μM coelentrazineoplossing (verdund in autoclaved water uit een voorraad van 5 mM in methanol) (LET OP) toe in afzonderlijke putten in een donkere/weinig lichtruimte en bewaar deze in het donker bij 21 °C gedurende 8 uur.
OPMERKING: Coelentrazine is een prothesegroep die zich bindt aan apo-aequorin en deze reconstrueert tot functioneel aequorin. Coelentrazine is lichtgevoelig en wordt dus opgeslagen in donkergekleurde flessen, beschermd tegen licht. - De volgende dag voert u mutantenscherm uit met 10 mM H2O2 als stimulus en meet u de daaropvolgende Ca2+ respons.
- Voor gelijktijdige meting van 24 putten, maak een geautomatiseerd kinetisch programma dat de achtergrond meet voor 1 min, gevolgd door stimuli toevoeging (40 μL) en meting gedurende 10 min, gevolgd door totale aequorine ontlading (2 M CaCl2 in 150 μL 20% ethanol) voor 1-2 min.
OPMERKING: Een eindontlading voor het totale aequorin is nodig om de gemeten Ca2+ te kwantificeren en als extra controle voor functioneel aequorin. Het einde kwijting is een korte termijn van 1-2 min en veroorzaakt geen significante plantendood. Als alternatief, als de planten sterven na de ontlading stap, dan opnieuw scherm van de specifieke M1 lijn en redding zonder ontlading. Dergelijke mutanten kunnen worden bevestigd in M3 en M4 generaties met behulp van de ontlading stap. - Gebruik een 24-well formaat scanmethode die elke rij meet in 7 s interval met 300 ms integratietijd per put per meetpunt. Gebruik een wild-type zaailing als controle in elke rij voor vergelijking en evaluatie van de mutant.
OPMERKING: Een enkele 96 putplaat met M2 zaailingen zal betrekking hebben op 8 individuele M1 lijn (8 M1* 12 = 96 M2) en kan worden vertoond in 2,5 uur en elke dag 32 M1 lijnen zou worden gescreend, 640 M1 planten per maand. De hele screening procedure nadat de planten klaar zijn zou ongeveer 8 maanden duren. - Identificeer mutanten op basis van verlies van of verminderde Ca2+ respons met H2O2. Red de geselecteerde mutanten door middel van een op antibiotica gebaseerd wasproces. Was de zaailing twee keer met 25 mg/L cefotaxime-oplossing en breng vervolgens over naar het reddingsmedium dat 25 mg/L cefotaxime bevat in 1/2 MS agar.
- Laat de platen groeien met een 10 uur licht/ 14 uur donkere fotoperiode om een gemuteerde plant te verkrijgen. De cefotaxime wash helpt om schadelijke micro-organismen op de zaailing te verwijderen. Aangezien de zaailingen na de reconstructie niet-verzegeld worden gehouden, minimaliseert u verontreiniging bij het overbrengen naar steriele toestand.
- Breng de gemuteerde plant naar de bodem voor het verkrijgen van de homozygoot M3 populatie.
3. Gegevensanalyse en identificatie van mutanten (1-3 maanden)
OPMERKING: De metingen van de bovenstaande methode zijn in relatieve lichteenheden (RLU).
- Gebruik voor de berekening van decytconcentratie [Ca2+] de volgende concentratievergelijking20.
pCa = 0,332588(−log (L/Lmax))+ 5,5593
Luminescentie telt () en het totale resterende aantal(max). - Converteer de verkregen pCa-waarden naar [Ca2+]cytwaarden in μM door te vermenigvuldigen met 106. Vervolgens grafisch plot tegen een aequorin (transgene Col-0 aequorin) controle voor het identificeren van vermeende H2O2 mutanten ca2 + reactie.
- Redding zaailingen met een verlies van of verminderde reactie op H2O2 applicatie gered.
- Bij rijping, oogst zaden van de geredde mutant en opnieuw screenen op reactie op H2O2 in M3 zaailingen. Als alle 12 M3 zaailingen een Ca2+ respons vertonen vergelijkbaar met de moederplant, beschouw de populatie dan als een homozygoot M3 mutant populatie. Als alle 12 zaailingen een dergelijke reactie niet vertonen, neem ze dan mee naar M4-generatie en opnieuw te screenen om homozygoot populatie te verkrijgen.
- Zodra een homozygoot plantenlijn is verkregen, identificeert u het gen dat leidt tot gewijzigd fenotype met behulp van de volgende generatie sequencing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De EMS-populatie werd gescreend op H2O2 geïnduceerde Ca2+ hoogte. Zoals eerder besproken, 12 individuele M2 zaailingen werden gescreend van elke M1 lijn. In figuur 3wordt een dergelijke M1-lijn uitgezet met elk paneel met 12 individuele M2 zaailingen. Een wild-type aequorin wordt gebruikt als controle voor het vergelijken en evalueren van de mutant respons. Een recessieve mutant scheidt in de verhouding van 1:7 (mutant: non mutant). Bij het screenen van 12 individuele zaailingen per M1 lijn, kunnen we 1 of 2 mutanten per lijn identificeren. We hebben 2 vermeende mutanten geïdentificeerd van 12 M2 zaailingen (figuur 3). Deze mutanten worden verder naar M3 en M4 gebracht en er ontstaat een homozygootpopulatie. De homozygoot mutant wordt verder in kaart gebracht om het oorzakelijke gen te identificeren.
Figuur 1: EMS mutagenized Arabidopsis. (A) Om een succesvolle EMS mutagenesis te bepalen, zochten we naar chlorofylsectoring in de gemutageiseerde plantenpopulatie (aangegeven door pijl). Statistisch gezien moet 0,1 tot 1% van de M1-installaties chlorotische sectoren vertonen. (B) Individuele poting van M1-planten werd gedaan om één zaadverzameling op basis van stamboom uit te voeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Een schematische weergave van de voorwaartse genetische schermmethodologie. 7500 transgene Arabidopsis planten die cytosolic Aequorin (Aeq) uitdrukken in Col-0 worden verminkt met ethylmethaansulfonaat (EMS) in de M0-generatie. Ongeveer 5000 zaailingen van M1 generatie worden individueel gepropageerd door enkele stamboom methode en gepropageerd tot M2 generatie. 12 planten van elke M2 lijn worden gescreend op het fenotype van belang (ongeveer 3000-3500 M1 lijnen). Mutant voor het fenotype van belang wordt gered en gepropageerd naar de M3 generatie en gescreend op homozygositeit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Identificatie van mutanten met een gewijzigde respons op H2O2-behandeling. Een representatieve figuur om mutantselectie van één enkele scheidingslijn M1 te tonen wordt getoond. De panelen tonen het screeningresultaat (12 scheidende M2 zaailingen per individuele M1 lijn) bij stimulatie met 10 mM H2O2. WT (Aequorin) controle (groene lijn), gemiddelde van alle 12 M2 zaailingen is de gemiddelde respons (rode lijn) en A1-X (zwarte lijn) zijn individuele zaailingen genummerd van 1-12. Voor elke grafiek is de y-as de [Ca2+]cyt (μM) en de x-as is tijd (min). [Ca2+] cyt niveaus werden berekend op basis van relatieve lichteenheden (RLU's). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EMS mutagenesis is een krachtig hulpmiddel om mutaties in de bevolking te genereren. De klassieke voorwaartse genetische schermen met EMS zijn een effectief instrument geweest om nieuwe genen te identificeren om twee belangrijke redenen: ten eerste vereisen ze geen eerdere veronderstellingen over de genidentiteit en ten tweede introduceren ze geen vooringenomenheid. Er zijn verschillende methoden om een screening populaties zoals EMS, T-DNA inserties, straling etc. genereren. Van alle methoden heeft ems-gebaseerde mutagenese weinig voordelen ten opzichte van de andere methoden. Ten eerste is het gemakkelijker om een gemuteerde populatie te genereren door blootstelling aan EMS zoals beschreven in het huidige protocol21,22. Ten tweede kan een voldoende groot aantal mutante zaadpopulaties worden gegenereerd, die voor meerdere schermen voor een of meer stimuli kan worden gebruikt. Ten derde kan een zwak allel van een essentieel gen worden geïdentificeerd dat wordt gegenereerd als gevolg van een missense mutatie. Ten vierde kan een reeks genfunctie-effecten worden geïdentificeerd aan de hand van het EMS-scherm, inclusief volledig verlies van functie, gedeeltelijk functieverlies, gewijzigde functie en een constitutieve genfunctie. Het kan helpen bij de identificatie van dubbele mutanten die niet haalbaar zijn door andere mutagenesis methoden23,24,25. De enkele stamboom gebaseerde M1 zaad collectie gebruikt in dit protocol is ook voordelig als het mogelijk maakt om terug te gaan naar de moeder bevolking om dezelfde mutant opnieuw te identificeren, als het nageslacht verloren gaat in de volgende toekomstige generaties. Het biedt de mogelijkheid voor het herstellen van mutaties die onvruchtbaar zijn wanneer homozygoot en kunnen worden teruggewonnen via de heterozygoot broers en zussen van de gemuteerde planten. Ten tweede garandeert deze strategie de onafhankelijkheid van alle geïsoleerde mutanten in vergelijking met het ophopen van zaden in M1-generatie. Het zorgt ervoor dat mutaties geïsoleerd uit de M2 collectie zijn verschillende allelen op dezelfde locus in plaats van dezelfde mutatie gebeurtenis26.
De genen die via EMS mutagenesisschermen worden geïdentificeerd, zijn afhankelijk van het fenotype dat wordt gebruikt voor het screenen van de populatie. Hoe sneller het fenotype van belang kan worden gescreend, hoe makkelijker het is om nieuwe paden te identificeren. Ca2+ is een alomtegenwoordige secundaire boodschapper die een van de eerste signaleringscascade's is die worden geactiveerd. Het fungeert als bemiddelaar voor de reactie van planten tegen een breed scala van biotische en abiotische stimuli. Bovendien kan de calcium reporter aequorin worden gelokaliseerd op verschillende subcellulaire compartimenten en organellen27,28,29. Dit opent mogelijkheden voor het identificeren van rollen van eiwit gelokaliseerd in deze compartimenten in calciumresponsdynamiek30,31,32.
Forward genetische schermen op basis van EMS-mutagenesis in aequorin en het gebruik van Ca2 + als uitlezingen zijn eigentijds gebleven sinds hun ontdekking. De voordelen van deze methode zijn opwegen tegen de valkuilen. Er hoeven echter nog maar weinig beperkingen van de techniek zorgvuldig te worden geëvalueerd. Het scherm is arbeid en tijd-intensief en vereist identificatie van gemuteerde planten uit een enorme verminkte bevolking. Daarom moet gedetailleerde planning op basis van beschikbaarheid van hulpbronnen, werkpersoneel en ruimte beperkt worden gedaan voordat u aan het experimentele plan begint. De tweede grote uitdaging met de aequorin-gebaseerde Ca2 + schermen is de mogelijkheid van valse positieven zonder een ontlading stap. Daarom is een zeer korte kwijtingsstap opgenomen in het protocol. Willekeurige mutaties kunnen ook leiden tot het genereren van steriele planten die niet kunnen worden gered als gevolg van meerdere mutaties. Ten derde is ca2+ signatuur zeer weefselspecifiek en moet de consistentie in de screening worden gewaarborgd4.
Niet veel voorwaartse genetische schermen hebben receptoren, kanalen, pompen en transporteurs van Ca2+ geïdentificeerd als gebruik van Ca2+ als een screening fenotype in voorwaartse genetica was zeldzaam. Stimuli (bijvoorbeeld H2O2)geïnduceerde Ca2+ hoogte wordt gebruikt als marker voor een voorwaarts genetisch scherm in onze methodologie, om nieuwe genetische componenten te identificeren die betrokken zijn bij het proces. Een soortgelijke strategie met behulp van EMS mutagenized aequorin populatie heeft geleid tot de ontdekking van vele receptoren zoals DORN1 dat is eATP receptor33, calcium kanaal OSCA34, LORE receptor die betrokken zijn bij lipopolysaccharide sensing35 en de ribonuclease PARN136. Een recente studie gepubliceerd door Wu et al. heeft gebruik gemaakt van een zeer vergelijkbare methode van screening EMS-mutagenized aequorin planten op H2O2 uitlokking om de nieuwe waterstofperoxide sensor HPCA137te identificeren . Vandaar dat het protocol met behulp van EMS mutagenesis in Ca2 + reporter achtergrond is een veelbelovende methode voor nieuwe gen discovery betrokken bij stimuli sensing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te verklaren.
Acknowledgments
Wij danken National Institute of Plant Genome Research - Phytotron Facility voor plantengroei, Bombay Locale voor de videoshoot, en het Department of Biotechnology- eLibrary Consortium voor het verstrekken van toegang tot e-resources. Dit werk werd ondersteund door het Department of Biotechnology, India via het National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group program; en CSIR-Junior Research Fellowship (aan D.M. en S.M) en Department of Biotechnology-Junior Research Fellowship (naar R.P).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. Rosato, E. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
