Summary
BDNF recombinante contendo uma sequência de Avi (BDNFAvi) é produzido em células HEK293 de forma econômica e é purificado por cromatografia de afinidade. BDNFavi é então diretamente mono-biotiningado com a enzima BirA em um tubo. BDNFavi e BDNFavi mono-biotiniladas mantêm sua atividade biológica quando comparadas com bdnf disponíveis comercialmente.
Abstract
BDNF recombinante contendo uma sequência de Avi (BDNFAvi) é produzido em células HEK293 e, em seguida, purificado por cromatografia de afinidade. Um protocolo reprodutível foi desenvolvido para mono-biotinilato BDNFAvi com a enzima BirA em um tubo. Nesta reação, o BDNFAvi mono-biotinilado mantém sua atividade biológica.
Neurotrophins são fatores de crescimento derivados da meta que desempenham um papel no desenvolvimento e manutenção neuronal. Eles requerem mecanismos de transporte rápido ao longo da via endocítica para permitir a sinalização de longa distância entre diferentes compartimentos neuronais. O desenvolvimento de ferramentas moleculares para estudar o tráfico de neurotrophins permitiu o rastreamento preciso dessas proteínas na célula usando o registro in vivo. Neste protocolo, desenvolvemos um procedimento otimizado e econômico para a produção de BDNF mono-biotinilado. Uma variante BDNF recombinante contendo uma sequência avi biotinítil (BDNFAvi) é produzida em células HEK293 na faixa de microgramas e, em seguida, purificada em um procedimento facilmente escalável usando cromatografia de afinidade. O BDNF purificado pode então ser homogêneo mono-biotiningado por uma reação in vitro direta com a enzima BirA em um tubo. A atividade biológica do BDNF mono-biotinilato (mbtBDNF) pode ser conjugada a extenuante conjugados a diferentes fluoroforos. BDNFAvi e mbtBDNF mantêm sua atividade biológica demonstrada através da detecção de alvos fosfoilados a jusante usando mancha ocidental e ativação do fator de transcrição CREB, respectivamente. Usando pontos streptavidin-quânticos, pudemos visualizar a internalização mbtBDNF concomitante com ativação do CREB, que foi detectado com um anticorpo específico fosfo-CREB. Além disso, mbtBDNF conjugado a pontos streptavidin-quânticos foi adequado para análise de transporte retrógrado em neurônios corticais cultivados em câmaras microfluidas. Assim, no tubo produzido mbtBDNF é uma ferramenta confiável para estudar a sinalização fisiológica e o tráfico de neurônios.
Introduction
Os neurônios são as unidades funcionais do sistema nervoso que possuem uma morfologia complexa e especializada que permite a comunicação sináptica e, portanto, a geração de comportamento coordenado e complexo em resposta a diversos estímulos. Projeções neuronais como dendritos e axônios são características estruturais críticas envolvidas na comunicação neuronal, e neurotrophins são atores cruciais na determinação de sua morfologia e função1. Neurotrophins são uma família de fatores de crescimento secretos que incluem NGF, NT-3, NT-4 e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)2. No sistema nervoso central (SNC), o BDNF participa de diversos processos biológicos, incluindo neurotransmissão, arborização dendrítica, maturação de colunas dendríticas, potencialização a longo prazo, entre outros3,,4. Portanto, o BDNF desempenha um papel crítico na regulação da função neuronal.
Diversos processos celulares regulam a dinâmica e a função do BDNF. Na superfície neuronal, o BDNF liga o receptor de tropomyosina quinase B (TrkB) e/ou o receptor de neurotropfina p75 (p75). Os complexos BDNF-TrkB e BDNF-p75 são endocitados e classificados em diferentes organelas endocíticas5,,6,,7,,8. O correto tráfico intracelular do complexo BDNF/TrkB é necessário para sinalização BDNF adequada em diferentes circuitos neuronais9,,10,,11. Por essa razão, uma compreensão profunda da dinâmica do tráfico de BDNF e suas alterações encontradas nos processos fisiofisiológicos é essencial para compreender a sinalização de BDNF em saúde e doença. O desenvolvimento de novas e específicas ferramentas moleculares para monitorar esse processo ajudará a impulsionar este campo e permitirá uma melhor compreensão dos mecanismos regulatórios envolvidos.
Existem várias ferramentas disponíveis para o estudo do tráfico de BDNF em neurônios. Uma metodologia comumente utilizada envolve a transfecção de BDNF recombinante marcado com moléculas fluorescentes como proteína fluorescente verde (GFP) ou a variante monomérica fluorescente de mudança vermelha do GFP mCherry12,13. No entanto, uma grande deficiência da superexpressão do BDNF é que elimina a possibilidade de fornecer concentrações conhecidas dessa neurotropina. Além disso, pode resultar em toxicidade celular, obscurecendo a interpretação dos resultados14. Uma estratégia alternativa é a transfecção de um TrkB marcado por epitope, como Flag-TrkB. Essa metodologia permite o estudo da dinâmica de internalização TrkB15,mas também envolve transfecção, o que pode resultar em alteração da função TrkB e toxicidade celular. Para superar esses obstáculos metodológicos, foram desenvolvidas variantes recombinantes de NGF e BDNF contendo uma sequência avi (BDNFAvi), que pode ser mono-biointinalada pela enzima biotin-ligase BirA,16,,17. BDNF recombinante biotinína pode ser acoplado a diferentes ferramentas ligadas a streptavidin, que incluem fluoroforos, contas, nanopartículas paramagnéticas, entre outras para detecção. Em termos de imagem de células vivas, os pontos quânticos (QD) tornaram-se fluoroforos frequentemente utilizados, pois possuem características desejáveis para o rastreamento de partículas únicas, como aumento do brilho e resistência ao fotobleaching quando comparados com fluoroforos de molécula pequena18.
A produção de BDNF mono-biotinilado (mbtBDNF) usando BDNFAvi foi alcançada pela co-transfecção de plasmídeos que conduzem a expressão de BDNFAvi e BirA, seguido pela purificação da proteína recombinante por cromatografia de afinidade com um rendimento de 1-2 μg de BDNF por 20 mL de mídia cultural hek293-condicionada17. Aqui, propomos uma modificação deste protocolo que permite a purificação do BDNFAvi a partir de 500 mL de mídia hek293, que busca maximizar a recuperação de proteínas em um protocolo baseado em coluna cromatografia para facilitar a manipulação. O agente de transfecção usado, polietileneimina (PEI), garante um método econômico sem sacrificar o rendimento da transfecção. A etapa de mono-biotintilação foi adaptada a uma reação in vitro para evitar as complicações associadas às co-transfecções e garantir a rotulagem homogênea de BDNF. A atividade biológica do mbtBDNF foi demonstrada por experimentos de microscopia de bolhas ocidentais e fluorescência, incluindo ativação de pCREB e imagem de células vivas para estudar o transporte axonal retrógrado de BDNF em câmaras microfluidas. O uso deste protocolo permite uma produção otimizada e de alto rendimento de BDNF mono-biotinilado e biologicamente ativo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas da CONICYT (Comissão Nacional de Pesquisa Científica e Tecnológica do Chile). Os protocolos utilizados neste estudo foram aprovados pelas Comissões de Biossegurança e Bem-Estar Bioético e Animal da Pontificia Universidad Católica de Chile. Os experimentos envolvendo vertebrados foram aprovados pela Comissão de Bem-Estar Bioético e Animal da Pontifícia Universidad Católica de Chile.
NOTA: O protocolo a seguir foi projetado para purificar o BDNFAvi a partir de um volume total de 500 mL de meio condicionado produzido em células HEK293. A quantidade de meio condicionado que é produzido e processado para purificar bdnfavi pode ser para cima ou para baixo, conforme necessário. No entanto, uma maior otimização pode ser necessária nestas circunstâncias. A composição dos meios culturais e tampões utilizados ao longo do protocolo pode ser encontrada em materiais suplementares.
1. Produção e purificação de BDNFAvi da mídia hek293-condicionada
- Transfecção de células HEK293
- Cresça as células HEK293 até 70% de confluência em meio DMEM suplementado (10% soro fetal bovino, 1x suplemento de glutamato, 1x antibiótico/antimíctico) em pratos de cultura de 15 cm a 37 ºC.
- Altere o tampão de transfecção média para transfecção.
- Prepare a mistura PEI-DNA para transfecção. Use dois diferentes tubos cônicos de 15 mL para diluir o DNA e PEI 25 K, respectivamente. Diluir 20 μg de DNA plasmídeo em um volume final de 500 μL em um tubo. Diluir 60 μg de PEI linear 25K em um volume final de 500 μL no outro tubo. Incubar em temperatura ambiente por 5 minutos.
- Pipeta cuidadosamente a solução de DNA no tubo PEI, misturando uma vez por movimento para cima. Incubar em temperatura ambiente por 25 minutos.
- Gotejamento 1 mL da mistura PEI-DNA ao longo de cada prato de 15 cm. Incubar as células com a mistura PEI-DNA por 3 h a 37 ºC.
- Altere o tampão de incubação médio para fresco.
- Coleta e armazenamento de mídia
- Colete o meio de todos os pratos 48 h após a transfecção das células HEK293. Prepare os estoques concentrados das soluções descritas na seção "tampão de modificação supernaca" do Arquivo Suplementar 1 e adicione-os ao supernatante HEK293 para alcançar as concentrações finais listadas.
NOTA: As células podem ser descartadas ou recuperadas para análise posterior. - Incubar o meio no gelo por 15 minutos.
- Alíquotar o meio em tubos de centrífuga.
- Centrifugar o meio a 10.000 x g por 45 min em uma centrífuga de 4 °C. Esta etapa permite a eliminação de detritos celulares e células mortas suspensas na mídia.
- Recolher os supernantes, adicionar BSA em uma concentração final de 0,1%. e depois armazenar a -20 °C. A mídia pode ser alitada antes de congelar para um descongelamento mais rápido durante a etapa de purificação.
NOTA: Os tempos de armazenamento de mídia condicionada congelada de até 2 meses produziram resultados positivos, tempos de armazenamento mais longos não foram avaliados.
- Colete o meio de todos os pratos 48 h após a transfecção das células HEK293. Prepare os estoques concentrados das soluções descritas na seção "tampão de modificação supernaca" do Arquivo Suplementar 1 e adicione-os ao supernatante HEK293 para alcançar as concentrações finais listadas.
- Concentração e purificação da mídia
- Descongele a mídia em um banho termoregulado de 37 °C.
- Alíquotar a mídia em tubos de centrífugas.
- Centrifugar o meio por 1h a 3.500 x g em uma centrífuga resfriada de 4 °C. Esta etapa permite a eliminação de detritos celulares remanescentes para garantir o fluxo adequado através da coluna cromatografia.
- Use os concentradores de proteínas com um corte de 10 kDa para reduzir a mídia de 500 mL para 100 mL. Siga os parâmetros de centrifugação recomendados pelo fabricante para uma concentração ideal.
- Adicione 500 μL de contas ni-nta à mídia concentrada e incubar durante a noite a 4 °C em um roqueiro.
- Monte o aparelho de cromatografia e despeje a mídia nele. Deixe descansar por 5 minutos e depois abra a torneira de 2 vias para deixar o meio fluir.
- Lave as contas com 5 mL de tampão de lavagem por 5 minutos. Certifique-se de resuspensar as contas da coluna. Escorra o tampão de lavagem abrindo a torneira de 2 vias. Repita 3 vezes.
- Adicione 1 mL de tampão de eluição à coluna. Certifique-se de resuspensar as contas na coluna. Incubar por 15 min e, em seguida, coletar o elunato em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL. Repita esta etapa 3 vezes para a elução completa do BDNFAvi.
- Carga 5 μL de cada elunato e concentrações diferentes de BDNF comercialmente disponível (40-160 ng) em um gel de poliacrilamida de 15%. Detecte a proteína purificada por manchas ocidentais usando um anticorpo anti-BDNF.
- Determine a concentração do BDNFAvi purificado em cada elunato utilizando a curva de concentração preparada com o BDNF comercialmente disponível.
- Aliquot e armazene o BDNFAvi purificado a -80 °C.
2. Mono-biotintilação in vitro de BDNFAvi usando a enzima BirA
-
Reação de mono-biotintilação in vitro
- Prepare soluções concentradas de estoque dos reagentes tampão de biotiningação. O uso de estoques concentrados minimizará a diluição da proteína recombinante.
- Pegue uma alíquota de 800 ng de BDNFAvi e adicione os reagentes tampão de biotinilação e a enzima BirA em uma relação molar 1:1 com bDNF. Por exemplo, para um acréscimo de volume final de reação de 200 μL; 100 μL de solução contendo 800 ng de BDNFAvi, 20 μL Bicine 0,5 M pH 8.3, 20 μL ATP 100 mM, 20 μL MgOAc 100 mM, 20 μL d-biotina 500 μM, 0,8-1 μg a 1 μL de BirA-GST, e completam até 200 μL com água ultrapura.
NOTA: Reações bem-sucedidas de biotinilação foram realizadas com alíquotas de 400 μL contendo uma concentração de cerca de 30 ng/ μL BDNFAvi, resultando em um BDNFAvi homogêneo biotinilado para uma concentração final de ~20 ng/ μL na reação final. - Incubar a mistura a 30 °C em forno de hibridização por 1 h. Misture o conteúdo por inversão de tubo a cada 15 minutos.
- Adicione o mesmo volume de ATP e BirA como na etapa 2.1.2 e repita o passo 2.1.3.
- Armazene a -80 °C para análises futuras ou mantenha no gelo para uso imediato (por exemplo, controle de qualidade de biotinylation).
- Análise de biotintilação
- Bloco 30 μL de contas magnéticas streptavidin por amostra BDNF em 1 mL de tampão de bloqueio. Incubar à temperatura ambiente por 1 h em um rotador de tubo de microcentrifuagem.
- Precipitar as contas magnéticas usando um rack de separação magnética por 3 a 5 minutos ou até que o buffer pareça completamente limpo das contas e descarte o tampão de bloqueio.
- Adicione 50 μL de tampão de bloqueio fresco e 80 ng de amostra de BDNFAvi mono-biotinilado (mbtBDNF) às contas, certificando-se de resuspensá-las completamente por tubulação.
- Incubar a 4 °C por 1h em um rotador de tubo de microcentrifutração girando a aproximadamente 20 RPM.
- Colete as contas usando o rack de separação magnética por 3 a 5 minutos, e colete o supernatante, mantendo uma alíquota de 30 μL para análise.
- Lave as contas uma vez com 500 μL de PBS e, em seguida, colete-as usando o rack de separação magnética por 3 a 5 minutos. Recupere o supernatante e mantenha uma alíquota de 30 μL para análise.
- Adicione 10 μL de tampão de carregamento de 4x às contas.
- Aqueça as amostras a 97 °C por 7 minutos para elutar o mbtBDNF.
- Detecte mbtBDNF usando um anticorpo específico anti-BDNF19.
3. Verificação da atividade biológica mbtBDNF
- Detecção de pTrkB e pERK por mancha ocidental.
- Sementes 2 milhões de neurônios cortical de rato em pratos de cultura de 60 mm.
- Cultura dos neurônios por 7 dias (DIV7). Em seguida, mude o mediun neurobásal médio para não-suplementado ao iniciar o experimento.
- Uma hora após a troca média, adicione mbtBDNF a uma concentração final de 50 ng/mL. Incubar por 30 min a 37 ºC. Mantenha um prato de controle negativo (não estimulado com BDNF) e um prato de controle positivo (tratado com 50 ng/mL de BDNF comercialmente disponível).
- Colete o meio e levemente lavar cada prato com 1x PBS. Coletar e descartar o PBS 1x.
- Coloque os pratos no gelo e adicione 50-80 μL de tampão de lise a cada prato. Use um raspador de células para lise as células.
NOTA: A etapa de lise deve ser realizada o mais rápido possível para evitar a desfosforilação e degradação da proteína. 1-2 minutos de raspagem vigorosa são suficientes para visualizar as proteínas de interesse por manchas ocidentais. - Colete o tampão de lise e mexa em uma batedeira de vórtice na velocidade mais alta para 5 s.
- Centrifugar o tampão de lise a 14.000 x g (4 °C) por 10 minutos. Cole o supernatante.
- Quantifique o teor proteico do supernasce pelo protocolo de quantificação de proteínas BCA20.
- Adicione o tampão de carga a uma alíquota contendo 30-50 μg de proteína por condição e carregue-o em um gel de poliacrilamida de 12% para a mancha ocidental. Detecte pTrkB e pERK usando fosfo-anticorpos específicos para verificar a atividade biológica BDNFAvi.
- Verificação da atividade biológica BDNF-QD por imunofluorescência pCREB.
- Sementes 40.000 neurônios cortical de rato em tampas de 10 mm, previamente autoclavados e tratados com poli-L-lisina como descrito anteriormente21.
- Cultura os neurônios por 7-8 dias em tampão de manutenção neuronal (ver materiais suplementares) a 37 ºC.
- Para iniciar o experimento, mude o meio neurobásico médio para não-espesso e incubar a 37 ºC por 1h.
- Prepare mbtBDNF conjugado aos pontos quânticos (BDNF-QD) adicionando a uma alíquota mbtBDNF, o volume necessário de ponto quântico streptavidin conjugado (streptavidin-QD) para alcançar uma razão molar BDNF-QD de 1:1. Em seguida, diluir para 20 μL com meio neurobásal. Enrole o tubo em papel alumínio para protegê-lo da luz.
NOTA: Prepare outro tubo com o mesmo volume de ponto quântico streptavidin conjugado e dilua-o a 20 μL com meio neurobásal como um controle negativo. - Incubar a mistura mbtBDNF/ streptavidin-QD por 30 minutos à temperatura ambiente em um roqueiro.
- Diluir o BDNF-QD à concentração final desejada (200 pM e 2 nM) no meio neurobásal.
- Após 1 h de incubação com meio neurobásal não suplementado, estimule os neurônios com BDNF-QD ou streptavidin-QD (controle) até uma concentração final de 200 pM e 2 nM de BDNF para 30 min a 37 °C.
- Lave as tampas 3 vezes com 1x PBS (37 °C) e fixe as células por 15 minutos tratando o deslizamento com 4% de solução paraformaldeída contendo inibidores de fosfatase.
- Lave as células 3 vezes com PBS e, em seguida, incubar com tampão de bloqueio/permeabilização (BSA 5%, Triton X-100 0,5%, 1x inibidor de fosfabilização) por 1 h.
- Incubar com anticorpo anti-pCREB 1:500 (em 3% BSA, 0,1% Triton X-100) durante a noite a 4 °C.
- No dia seguinte, lave 3 vezes com 1x PBS e incuba por 1h com o anticorpo secundário 1:500 (3% BSA, 0,1% Triton X-100).
- Lave 3 vezes com 1x PBS. Adicione a solução de mancha nuclear Hoechst (5 μg/mL) por 7 min.
- Lave 3 vezes com 1x PBS e monte.
- Visualização do transporte axonal retrógrado de BDNF-QD em neurônios vivos
- Prepare câmaras microfluidas e neurônios de sementes como descrito anteriormente16.
- Após 7-8 dias na cultura, mude o meio neurobásal médio para não suplementado.
- Prepare mbtBDNF conjugado aos pontos quânticos (BDNF-QD) adicionando a uma alíquota mbtBDNF, o volume necessário de ponto quântico streptavidin conjugado (streptavidin-QD) para alcançar uma razão molar BDNF-QD de 1:1. Em seguida, diluir para 20 μL com meio neurobásal. Enrole o tubo em papel alumínio para protegê-lo da luz.
NOTA: Prepare outro tubo com o mesmo volume de ponto quântico streptavidin conjugado e dilua-o a 20 μL com meio neurobásal como controle. - Incubar a mistura mbtBDNF/ streptavidin-QD por 30 minutos à temperatura ambiente em um roqueiro.
- Diluir o BDNF-QD à concentração final desejada (2 nM).
- Após 1 h de incubação com meio neurobásico não suplementado adicione o BDNF-QD ou a mistura de controle aos compartimentos axonais da câmara microfluida. Incubar por 210 min a 37 °C para garantir um transporte líquido retrógrado de BDNF-QD.
- Para imagens de células vivas, visualize o transporte retrógrado axonal no segmento dos microgrooves que é proximal ao compartimento do corpo celular usando um objetivo de 100x usando um microscópio adequado para este fim (37 °C e 5% de CO2). Adquira imagens a 1 frame/s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O uso de um protocolo cromatográfico baseado em coluna permite o processamento de volumes significativos de mídia condicionada HEK293. Na Figura 1,são mostrados os resultados da purificação do BDNFAvi a partir de 500 mL de mídia condicionada. Eluções consecutivas de BDNFAvi do Ni-NTA produzem contas de diminuição das concentrações de BDNFAvi (Figura 1A). Após quatro eluções consecutivas (cada uma com duração de 15 min), a maioria do BDNF capturado pelas contas é recuperada. As concentrações dos elunatos variam de 6 a 28 ng/μL, e o rendimento total foi de aproximadamente 60 μg de BDNFAvi (Tabela 1). O BDNFAvi produzido foi então eficientemente biotinado por uma reação in vitro mediada pelo BirA-GST, como demonstrado pela falta de BDNFAvi não biotiningado no sobrenante(Figura 1B). Observe que a biotintilação apresentada na Figura 1B corresponde a uma alíquota do BDNF total produzido, mas a reação pode ser ampliada para volumes maiores.
Em seguida, a atividade biológica do mbtBDNF foi avaliada utilizando-se 2 abordagens experimentais diferentes. Primeiro, os neurônios corticais semeados em placas de 60 mm (2 milhões de neurônios, DIV7) foram estimulados com 50 ng/mL de mbtBDNF por 30 minutos, e então as proteínas foram preparadas para a análise de manchas ocidentais. A atividade biológica do mbtBDNF foi quantificada pela detecção de pTrkB (Y515) e pERK (T202/Y204). A vinculação do BDNF ao TrkB desencadeia a ativação do receptor através de uma reação de autofosforilação em seu domínio intracelular, e o ERK é um alvo conhecido da via de sinalização BDNF22. As bandas para ambas as proteínas fosfoiladas apresentaram intensidade semelhante em neurônios tratados com BDNF comercial e mbtBDNF, e ambas apresentaram um sinal mais forte do que a condição de controle(Figura 2A). Em seguida, a atividade biológica de mbtBDNF acoplada ao streptavidin-QD foi avaliada para demonstrar que eles podem ser usados em experimentos de imagem ao vivo. Os neurônios corticais foram semeados em coberturas de 10 mm (40.000 células por cobertura, DIV7) e tratados com uma concentração final de 200 pM ou 2 nM BDNF-QD por 30 minutos antes de fixação e coloração para pCREB. CREB é um fator de transcrição que é alvo de ERK1/2 ativado em neurônios corticais22,23. Estimular neurônios com concentrações crescentes de BDNF-QD resultou em um aumento dependente de dose de fosforilação de CREB e presença de partículas QD ao redor do núcleo (Figura 2B),indicando que as partículas BDNF-QD foram endocitadas e desencadearam a ativação de vias de sinalização associadas à ativação TrkB mediada pelo BDNF. Foi detectado um aumento duplo no sinal pCREB ao estimular neurônios com baixa concentração de BDNF-QD (200 pM), enquanto estimular com 2 nM resultou em um aumento de 3,5 vezes no sinal pCREB(Figura 2C). Esses resultados demonstram que o BDNFAvi biotinilado é biologicamente ativo, e que não perde sua atividade quando acoplado ao streptavidin-QD, tornando-o adequado para imunofluorescência e imagem de células vivas.
Finalmente, o potencial de imagem do BDNF-QD foi avaliado em culturas compartimentadas utilizando câmaras microfluidas. Os neurônios corticais foram semeados em câmaras microfluidas (coberturas de 15 mm, 50.000 neurônios por câmara microfluida, DIV7) para separar os compartimentos axonasais e somatodendriticos e foram estimulados com 2 nM BDNF-QD para 3,5 h. Foi realizada microscopia celular viva , e os kymogramas resultantes foram usados para quantificar a velocidade de BDNF-QD contendo organelas(Figura 3A). Foi detectada uma velocidade móvel média de 0,91 μm/s(Figura 3B),que está em consonância com as análises anteriores do transporte mediado por dyneina citoplasmica7,16. As câmaras microfluídicas tratadas com 2 nM streptavidin-QD não apresentaram QDs móveis nos microvalôos, como mostra o kymograph (Figura 3A). As células cultivadas sob as mesmas condições foram estimuladas com 500 pM ou 2 nM BDNF-QD por 210 min, e depois fixadas e rotuladas com uma coloração nuclear. Como mostrado na Figura 3C,os neurônios mostram um acúmulo dependente de dose de BDNF-QD em todos os subcompartidás analisados, incluindo as porções proximais e distais do microrresor e do compartimento somatodendritic. Em contraste, os neurônios de controle não mostraram quase nenhum sinal QD em toda a câmara. Portanto, o BDNF-QD pode ser detectado em células vivas e fixas em câmaras microfluidas.
Figura 1: Produção e mono-biotintilação de BDNFAvi em células HEK293. As células HEK293 foram transfectadas usando o reagente PEI e um plasmídeo de codificação BDNFAvi e a mídia condicionada foi coletada após 48 h. BDNFAvi contém uma etiqueta histidina de 6x permitindo purificação usando cromatografia de ácido nitrilotriacêtic (Ni-NTA). BDNF humano recombinante comercialmente disponível tem um peso molecular esperado de ~13 kDa, enquanto bdnfavi exibe um peso molecular de ~18 kDa. BDNFAvi ligado à resina foi totalmente elucido com quatro passos consecutivos de elução. (A) Mancha ocidental usando anticorpos anti-BDNF para detectar em casa preparado BDNF recombinante e BDNF comercial. As alíquotas contendo quantidades conhecidas de BDNF humanos comercialmente disponíveis e 5 μL de cada eluato foram carregadas em um gel SDS-PAGE para detecção de BDNFAvi usando um anticorpo contra BDNF. A Tabela 1 indica as concentrações de BDNFAvi presentes em cada elunato. A quantidade e concentração de BDNF em cada elunato foi obtida por análise densitométrica e interpolação a partir da curva de concentração de BDNF comercialmente disponível. (B) Verificação da biotinylation BDNFAvi. Oitenta nanogramas de BDNFAvi biotinalado (mbtBDNF) foram incubados com 30 μL de streptavidin acoplado a contas magnéticas (20% de chorume) por 1 hora a 4 °C. Então, contas magnéticas foram isoladas usando um separador magnético. As contas streptavidin foram aquecidas com tampão de carga para elute o BDNFAvi biotinilado (pista de contas). O supernascimento (pista SN) também foi tratado com tampão de carga, aquecido e carregado no gel (pista de SN). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Verificação da atividade biológica mbtBDNF. (A) Os neurônios corticais DIV7 foram soros famintos por 1h, e então estimuladas com 50 ng/mL de BDNF ou mbtBDNF comercialmente disponíveis para 30 min. Proteínas foram extraídas e carregadas em um gel SDS-PAGE para análise de TrkB e ERK1/2 fosforilação usando anticorpos específicos do fosfo e comparados aos níveis totais da proteína usando anticorpos contra TrkB e ERK1/2. (B) Os neurônios corticais DIV7 foram sorum famintos por 1 h, e depois estimulados com uma concentração final de 200 pM ou 2 nM de mbtBDNF acoplado a streptavidin-QD (BDNF-QD) por 30 min. Em seguida, as células foram fixadas e o pCREB foi rotulado para análise de microscopia de fluorescência. (C) Quantificação da intensidade de fluorescência pCREB nuclear. Os resultados correspondem a 90 neurônios agrupados a partir de 3 experimentos independentes, mostrados como média ± SEM. A análise estatística corresponde a um ANOVA unidirecional com o teste de comparações múltiplas de Tukey (***p < 0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Visualização de BDNF-QD em células vivas e fixas. (A) Os neurônios corticais DIV7 cultivados em câmaras microfluidas foram estimulados no compartimento axonal com concentração final de 2 nM BDNF-QD por 3,5 horas, e então a porção proximal dos microgrooves foi imagens usando uma configuração de microscopia celular viva. São mostrados kymogramas representativos para condição de controle (tratados com streptavidin-QD) e após o tratamento com BDNF-QD. (B) Quantificação da velocidade de movimento BDNF-QD. Puncta móvel foram definidos como aqueles que moveram mais de 10 μm nos 120 s de gravação. (C) Os neurônios corticais DIV7 cultivados em câmaras microfluídicas foram estimulados no compartimento axonal com uma concentração final de BDNF-QD de 500 pM ou 2 nM por 3,5 horas e, em seguida, fixados e rotulados com Hoechst para visualizar os núcleos. São mostradas imagens representativas do compartimento somatodendritic e das porções distais e proximais dos microgrooves. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Eluato | BDNF (ng) em 5μl | [ng/μl] | BDNF total [μg] |
| E1 | 142.2 | 28.4 | 28.4 |
| E2 | 101.2 | 20.2 | 20.2 |
| E3 | 65.6 | 13.1 | 13.1 |
| E4 | 30.4 | 6.1 | 6.1 |
| 67.8 |
Tabela 1: Quantificação do rendimento de purificação do BDNFAvi (relacionado à Fig. 1A). As células HEK293 foram transfectadas com uma expressão de plasmídeo dirigindo BDNFAvi, e a proteína foi purificada pela cromatografia de afinidade Ni-NTA. A concentração proteica e o rendimento final foram calculados por análise densitométrica e interpolação na curva de concentração conhecida do BDNF humano recombinante comercialmente disponível.
Arquivo Suplementar 1: Mídia de cultura e componentes de buffer Por favor clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste artigo, descreve-se uma metodologia otimizada para a produção e purificação do mbtBDNF em um procedimento baseado em cromatografia de afinidade, a partir do trabalho de Sung e colaboradores17. As otimizações incluem o uso de um reagente de transfecção econômico (PEI) mantendo a eficiência de métodos de transfecção mais caros, como a lipofectamina. Essa otimização se traduz em uma redução significativa de custos no protocolo, permitindo a escalabilidade, mantendo o alto custo-benefício. O protocolo também inclui a facilidade de uso das considerações, incluindo o congelamento de mídias condicionadas por até 2 meses. Essas otimizações tornam o procedimento adaptável às necessidades de cada laboratório, melhoram o custo-efetividade e produzem BDNF recombinante homogêneo e biologicamente ativo. O protocolo também pode ser adaptado a produções de menor escala, substituindo o uso do aparelho cromatógrafo por precipitação gravitacional das contas em tubos cônicos. Isso constitui uma metodologia viável, mas é menos eficiente no tempo e resultou em rendimentos menores em nossa experiência. O BDNF rotulado por biotina pode então ser acoplado a diferentes sondas ligadas a estreptavidinas, incluindo fluoroforos e nanopartículas paramagnéticas, tornando-se uma ferramenta valiosa para realizar diversos tipos de experimentos para a análise do tráfico pós-endocítico BDNF. Portanto, um protocolo de produção otimizado e simples para essa proteína é altamente útil para laboratórios que trabalham neste campo.
A produção de proteínas recombinantes com modificações pós-translacionais complexas, como o BDNF24,em sistemas procarióticos muitas vezes resulta em proteínas que não são corretamente dobradas e, portanto, têm má atividade biológica25. Portanto, a expressão em células mamíferas é necessária para obter uma proteína bioativa. O uso do PEI tem sido descrito anteriormente como uma alternativa viável para a produção em larga escala de proteínas recombinantes em células transfeinadas de mamíferos25,,26, e sua eficiência na transfecção das células HEK293 no contexto dos laboratórios acadêmicos foi destacada27. Portanto, o uso desta linha celular representa uma opção válida para produzir BDNFAvi em uma escala que pode ser gerenciada por um laboratório acadêmico. O protocolo proposto poderia ser otimizado ainda mais pela geração de uma linha celular HEK293 transfeccionada com bdnfavi, o que eliminaria a etapa de transfecção transitória, economizando tempo e recursos. Outra fonte potencial de otimização é o uso de células em suspensão em vez de células aderentes. As células HEK293 podem ser mantidas em suspensão, gerando quantidades significativas de proteína recombinante na faixa de gramas por litro28.
Outra melhoria no protocolo é a biotiningação da proteína BDNFAvi utilizando uma estratégia in vitro, substituindo o protocolo anterior de co-transfecção in vivo. A co-transfecção transitória pode ter resultados inesperados em termos de expressão dos construtos, como foi demonstrado em múltiplas linhas celulares e com vários reagentes de transfecção29. Vários fatores podem afetar a expressão de proteínas transfectionadas em um contexto de co-transfecção, incluindo vetores, tipos de células e concentração de plasmídeos. Essa multiplicidade de fatores torna a otimização e a reprodutibilidade uma tarefa complexa. Por outro lado, uma metodologia in vitro permite um melhor controle sobre as condições em que ocorre a reação de biotintilação. Essa metodologia resulta em rotulagem reprodutível e homogênea de BDNF recombinante.
Como demonstrado pelos experimentos de verificação de atividades biológicas, o mbtBDNF produzido usando este protocolo é comparável ao BDNF humano recombinante disponível comercialmente em termos de ativação da via de sinalização BDNF-TrkB. Os dados também mostram que o acoplamento do BDNF ao streptavidin-QD não interfere na sinalização BDNF-TrkB. Além disso, mostramos que o BDNF-QD pode ser detectado por microscopia de epifluorescência em células vivas e fixas. Portanto, o mbtBDNF representa uma ferramenta valiosa para estudar o tráfico axonal retrógrado e apresenta vantagens significativas sobre sondas alternativas, como o BDNF-GFP16. O protocolo descrito neste artigo fornece uma metodologia confiável e consistente para a produção de mbtBDNF, que pode então ser usada em estudos de dinâmica pós-endocítica em diferentes modelos neuronais expressando TrkB ou p75. A sinalização BDNF tem efeitos potentes na morfologia neuronal e na função3,,4,,21, e foi recentemente proposta como uma potencial ferramenta terapêutica para melhorar a regeneração neuronal30,31, tornando seu estudo relevante nos campos da biologia celular e biomedicina. O estudo dos efeitos da sinalização e do tráfico de BDNF avançará ainda mais nossa compreensão da biologia celular neuronal e poderá permitir o aproveitamento de seu potencial regenerativo em ambientes clínicos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem o apoio financeiro da Fondecyt (1171137) (FCB), do Centro Basal de Excelência em Ciência e Tecnologia (AFB 170005) (FCB), do Millenium-Nucleus (FCB). P07/011-F) (FCB), o Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) e um prêmio da Uk Dementia Research Institute Foundation (GS). Este trabalho contou com o apoio da Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
References
- Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
- Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
- Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
- Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
- Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. Lewin, G., Carter, B. 220, Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
- Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
- Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
- Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
- Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, Suppl 1 11-14 (2007).
- Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
- Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
- Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
- Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
- Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important. , Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012).
- Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
- Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
- Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
- Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
- Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
- Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
- Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
- Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
- Gonzalez, A., Lazo, O. M., Bronfman, F. C. The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons. , Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019).
- Mowla,, et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
- Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
- Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
- Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
- Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
- Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).
