Præsenteret her er en protokol for Pseudomonas aeruginosa infektion og fagterapi ansøgning i cystisk fibrose (CF) zebrafisk embryoner.
Antimikrobiel resistens, en væsentlig konsekvens af diagnostisk usikkerhed og antimikrobiel overrecept, er en stadig mere anerkendt årsag til alvorlige infektioner, komplikationer og dødelighed på verdensplan med en enorm indvirkning på vores samfund og på sundhedssystemet. Især patienter med nedsat immunforsvar eller allerede eksisterende og kroniske patologier, såsom cystisk fibrose (CF), udsættes for hyppige antibiotikabehandlinger for at kontrollere infektioner med udseende og diffusion af multiresistente isolater. Derfor er der et presserende behov for at løse alternative behandlingsformer for at modvirke bakterielle infektioner. Brug af bakteriofager, de naturlige fjender af bakterier, kan være en mulig løsning. Den protokol, der er beskrevet i dette arbejde, beskriver anvendelsen af fagterapi mod Pseudomonas aeruginosa-infektion i CF zebrafiskembryoner. Zebrafisk embryoner blev inficeret med P. aeruginosa at påvise, at fagterapi er effektiv mod P. aeruginosa infektioner, da det reducerer dødelighed, bakteriel byrde og pro-inflammatorisk immunrespons i CF embryoner.
Fagterapi, brugen af de naturlige fjender af bakterier til at bekæmpe bakterielle infektioner, er garnering fornyet interesse som bakteriel resistens over for antibiotika bliver udbredt1,,2. Denne behandling, der anvendes i årtier i Østeuropa, kan betragtes som en supplerende behandling af antibiotika i at kurere lungeinfektioner hos patienter med CF og et muligt terapeutisk alternativ for patienter smittet med bakterier, der er resistente over for alle de i øjeblikket i brug antibiotika2,,3. Fordele ved antibiotikabehandling er, at bakteriofager formere sig på infektionsstedet, mens antibiotika metaboliseres og elimineres fra kroppen4,,5. Faktisk har administrationen af cocktails af virulente fager isoleret i forskellige laboratorier vist sig at være effektiv til behandling af Pseudomonas aeruginosa infektioner i dyremodeller så forskellige som insekter og pattedyr6,7,8. Fagterapi viste sig også at være i stand til at reducere bakteriebyrden i brænde sår inficeret med P. aeruginosa og Escherichia coli i et randomiseret klinisk forsøg9.
Zebrafisk (Danio rerio) har for nylig vist sig som en værdifuld model til at studere infektioner med flere patogener, herunder P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus og Burkolderia cepacia12,13. Ved microinjecting bakterier direkte ind i embryoblodcirkulationen 14 er det let at etablere en systemisk infektion, der modvirkes af zebrafisk medfødte immunsystem, som er evolutionære bevaret med neutrofiler og makrofag generation ligner det menneskelige modstykke. Desuden, i løbet af den første måned af livet, zebrafisk embryoner mangler adaptive immunrespons, hvilket gør dem ideelle modeller for at studere den medfødte immunitet, som er den kritiske forsvarsmekanisme i menneskelige lungeinfektioner15. Zebrafisk nylig frem som en kraftfuld genetisk model system til bedre at forstå CF debut og til at udvikle nye farmakologiske behandlinger10,16,17. CF zebrafisk model af cftr knock-down genereret med morpholino injektion i zebrafisk præsenteret en dæmpet respiratorisk burst respons og reduceret neutrofil migration10, mens cftr knock-out fører til nedsat indre organ position og ødelæggelse af eksokrine bugspytkirtel, en fænotype, der afspejler sygdommehos mennesker 16,17. Af største interesse var konstateringen af, at P. aeruginosa bakterielle byrde var betydeligt højere i cftr-tab-of-funktion embryoner end i kontrol på 8 timer efter infektion (hpi), som paralleller resultaterne opnået med mus og menneskelige bronkial epitelceller2,18. cftr
I dette arbejde viser vi, at fagterapi er effektiv mod P. aeruginosa infektioner i zebrafisk embryoner.
I dette manuskript beskrev vi protokollen til at udføre P. aeruginosa (PAO1) infektion i zebrafisk embryoner og hvordan man anvender fagterapi med en cocktail af fager tidligere identificeret som i stand til at inficere PAO1 at løse det. Brugen af bakteriofager som et alternativ til antibiotikabehandlinger har været af stigende interesse siden de sidste par år. Dette skyldes hovedsagelig udbredelsen af multiresistente bakterielle infektioner (MDR), som udgør et alvorligt problem for folkesundheden. Selvføl…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den italienske cystisk fibrose Foundation (FFC #22/2017; Associazione “Gli amici della Ritty” Casnigo og FFC#23/2019; Ueståsom respiro i più Onlus La Mano tesa Onlus).
Bacto Agar | BD | 214010 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Stereomicroscope | Leica | S9I | |
Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |