Summary
Præsenteret her er en protokol for Pseudomonas aeruginosa infektion og fagterapi ansøgning i cystisk fibrose (CF) zebrafisk embryoner.
Abstract
Antimikrobiel resistens, en væsentlig konsekvens af diagnostisk usikkerhed og antimikrobiel overrecept, er en stadig mere anerkendt årsag til alvorlige infektioner, komplikationer og dødelighed på verdensplan med en enorm indvirkning på vores samfund og på sundhedssystemet. Især patienter med nedsat immunforsvar eller allerede eksisterende og kroniske patologier, såsom cystisk fibrose (CF), udsættes for hyppige antibiotikabehandlinger for at kontrollere infektioner med udseende og diffusion af multiresistente isolater. Derfor er der et presserende behov for at løse alternative behandlingsformer for at modvirke bakterielle infektioner. Brug af bakteriofager, de naturlige fjender af bakterier, kan være en mulig løsning. Den protokol, der er beskrevet i dette arbejde, beskriver anvendelsen af fagterapi mod Pseudomonas aeruginosa-infektion i CF zebrafiskembryoner. Zebrafisk embryoner blev inficeret med P. aeruginosa at påvise, at fagterapi er effektiv mod P. aeruginosa infektioner, da det reducerer dødelighed, bakteriel byrde og pro-inflammatorisk immunrespons i CF embryoner.
Introduction
Fagterapi, brugen af de naturlige fjender af bakterier til at bekæmpe bakterielle infektioner, er garnering fornyet interesse som bakteriel resistens over for antibiotika bliver udbredt1,,2. Denne behandling, der anvendes i årtier i Østeuropa, kan betragtes som en supplerende behandling af antibiotika i at kurere lungeinfektioner hos patienter med CF og et muligt terapeutisk alternativ for patienter smittet med bakterier, der er resistente over for alle de i øjeblikket i brug antibiotika2,,3. Fordele ved antibiotikabehandling er, at bakteriofager formere sig på infektionsstedet, mens antibiotika metaboliseres og elimineres fra kroppen4,,5. Faktisk har administrationen af cocktails af virulente fager isoleret i forskellige laboratorier vist sig at være effektiv til behandling af Pseudomonas aeruginosa infektioner i dyremodeller så forskellige som insekter og pattedyr6,7,8. Fagterapi viste sig også at være i stand til at reducere bakteriebyrden i brænde sår inficeret med P. aeruginosa og Escherichia coli i et randomiseret klinisk forsøg9.
Zebrafisk (Danio rerio) har for nylig vist sig som en værdifuld model til at studere infektioner med flere patogener, herunder P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus og Burkolderia cepacia12,13. Ved microinjecting bakterier direkte ind i embryoblodcirkulationen 14 er det let at etablere en systemisk infektion, der modvirkes af zebrafisk medfødte immunsystem, som er evolutionære bevaret med neutrofiler og makrofag generation ligner det menneskelige modstykke. Desuden, i løbet af den første måned af livet, zebrafisk embryoner mangler adaptive immunrespons, hvilket gør dem ideelle modeller for at studere den medfødte immunitet, som er den kritiske forsvarsmekanisme i menneskelige lungeinfektioner15. Zebrafisk nylig frem som en kraftfuld genetisk model system til bedre at forstå CF debut og til at udvikle nye farmakologiske behandlinger10,16,17. CF zebrafisk model af cftr knock-down genereret med morpholino injektion i zebrafisk præsenteret en dæmpet respiratorisk burst respons og reduceret neutrofil migration10, mens cftr knock-out fører til nedsat indre organ position og ødelæggelse af eksokrine bugspytkirtel, en fænotype, der afspejler sygdommehos mennesker 16,17. Af største interesse var konstateringen af, at P. aeruginosa bakterielle byrde var betydeligt højere i cftr-tab-of-funktion embryoner end i kontrol på 8 timer efter infektion (hpi), som paralleller resultaterne opnået med mus og menneskelige bronkial epitelceller2,18. cftr
I dette arbejde viser vi, at fagterapi er effektiv mod P. aeruginosa infektioner i zebrafisk embryoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voksne zebrafisk (Danio rerio) fra AB-stammen (European Zebrafish Resource Center EZRC) vedligeholdes i henhold til international (EU-direktiv 2010/63/EU) og nationale retningslinjer (italiensk dekret4. marts 2014, s. 26) om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål. Standardbetingelserne er fastsat i fiskefaciliteten med en 14 timers lys/10 h mørk cyklus og tankvandstemperatur ved 28°C.
1. Udarbejdelse af løsninger og værktøjer
- Forbered en 50x lagerløsning og 1x arbejdsløsninger til E3 embryomedium til dyrkning af zebrafiskembryoner (se tabel 1).
- Gør pigmentering blokering løsning, at blokere embryo pigmentering fra 24 timer efter befrugtning (24 hkf) (se tabel 1).
- Forbered 25x lager og 1x fungerende Tricane bedøvelsesmiddel løsning som beskrevet i tabel 1.
BEMÆRK: For at undgå gentagen frysning og optøning af opløsningen, der kan beskadige lageropløsningen, skal der foretages aliquots på 2 ml 25x tricain og opbevares ved -20 °C. - Forbered spor til embryomikroinfektion ved at opløse 1 g agarose i 100 ml destilleret H2O i en mikroaffaldskolbe eller flaske. Mikrobølgeovn i 1-3 min, indtil agarose er helt opløst.
- Anbring mikroinfektionsforme til zebrafisk (se Materialetabel)vendt på hovedet i en petriskål (90 mm x 15 mm), og dæk hele overfladen ved at hælde væsken agarosegel med en bredde på ca. 10 mm.
- Fjern formen, når agarose har størknet. Fyld petriskålen med 1x E3 embryo medium. Dette kan opbevares ved 4 °C i ca. en uge. Før brug udskiftes med det friske E3-medium, der indeholder Tricain.
BEMÆRK: Ældre forme kan udvikle svampe eller bakterielle forureninger. - Brug brand poleret 10 cm borosilikat kapillærer til at forberede nåle til mikroinjektion og fastgøre dem til mikropipette puller ved at stramme håndtagene. Indstil pulleren med følgende indstillinger: varme 500, hastighed 100, tid 150, træk 150.
2. P. aeruginosa (PAO1) inoculumpræparat
- Inokuler 1 koloni af GFP+P. aeruginosa stamme PAO119 i 5 ml LB bouillon (se tabel 1) og vokse natten over ved 37 °C med omrystning (200 rpm).
- Ovenstående natten kultur til OD600 = 0,1 i 10 ml LB bouillon og vokse til OD600 = 0,5 ved 37 °C med omrystning (200 rpm).
- Centrifuge 2 ml af kulturen i 2 min ved 4 °C ved 16.100 x g og resuspenderet cellepellet til OD600 = 1, svarende til ca. 1 x 109 cfu/ml, i 1 ml af den fysiologiske opløsning (se tabel 1).
- Cellesuspensionen fortyndes til ca. 5 x 107cfu/ml i fysiologisk opløsning, og opbevares ved 4 °C.
3. Forberedelse af fagbestande
- Inokuler 1 koloni af P. aeruginosa stamme PAO1 i 5 ml LB bouillon og inkubere natten over ved 37 °C med omrystning. Nattens dyrk til OD600 = 0,01 i 500 ml LB bouillon og vokse ved 37 °C med omrystning til OD600 = 0,05, svarende til ca. 2,5 x 107 cfu/ml.
- Til den fortyndede kultur P. aeruginosa, tilføje omkring 1,25 x 107 fager, for at få den mangevis af infektion (M.O.I.) af 10-3. Inkuberes ved 37 °C med omrystning, indtil OD600 falder til ca. 0,1-0,3 (ca. 3 til 5 timer, afhængigt af den anvendte fag).
BEMÆRK: Fire fager blev udvalgt til dette eksperiment, der inficerer PAO1 stamme: To Podoviridae, GenBank tiltrædelse numre vB_PaeP_PYO2, MF490236, og vB_PaeP_DEV, MF490238, og to Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241, og vB_PaeM_E217, 490240. Udfør nedenstående trin for hver individuelt. - Lysatet inkuberes med 1 mg/ml DNase og RNase i 30 minutter ved 37 °C. Centrifuge ved 5.000 x g i 30 minutter ved 4 °C og gendan forsigtigt supernatanten (SN). SN-filteret filtreres med et filter med en porediameter på 0,8 μm.
- Til SN skal du tilføje 58 g/l NaCl og 105 g/L PEG6000. Opløs under omrøring ved RT 20 min og hold den natten over ved 4 °C. Centrifuge ved 20,000 x g i 30 min. ved 4 °C for fagfældning. Fjern SN'en, og fagpellet opløses forsigtigt i 15 ml TN-buffer (se tabel 1).
- Rens fagerne med CsCl tæthed gradient som beskrevet i trin nedenfor.
- I et polyallomer ultracentrifugerør til SW41-rotor skal du forberede en CsCl-trintæthedsgradient ved at stratificere 2 ml af de fire CsCl-opløsninger, der er beskrevet i tabel 1. Der tilsættes 3,5 ml fagaffjedring i hvert af de 4 rør.
BEMÆRK: CsCl er giftigt, vedtage ordentlig sikkerhedsprocedurer til at håndtere og kassere det. - Rørene indføres i rotoren, og rørene vejes i balance (vægtforskellen mellem de to modstående rør skal være ≤ 0,01 g).
- Centrifuge i 2 timer ved 4 °C og 100, 000 x g (25.000 omdr./min. for SW41 rotor). Efter centrifugering fjernes rørene langsomt og de immobiliseres forsigtigt på en understændelse. Ved hjælp af en sprøjte med 19 G nål, udarbejde den hvide / opalescent bånd, der er placeret normalt mellem d = 1,5 og d = 1,4 tæthed region.
- Overfør suspensionerne fra sprøjten til nye polyallomerrør til SW60 rotor og brug d=1.4-opløsningen til præcist at afbalancere rørene.
- Centrifuge suspensionen ved 4 °C og 150.000 x g (38.000 omdr./min. for SW60-rotoren) i mindst 16 timer.
- Saml det synlige bånd som ovenfor (se trin 3.3.3) og overfør dem til dialyserør med 6.000 Da cut-off. Dialyze den opnåede synlige bånd 2x i 20 min mod 500 ml vand og natten over mod 500 ml TN buffer. Der filtreres med et 0,22 μm porefilter og opbevares ved 4 °C.
- I et polyallomer ultracentrifugerør til SW41-rotor skal du forberede en CsCl-trintæthedsgradient ved at stratificere 2 ml af de fire CsCl-opløsninger, der er beskrevet i tabel 1. Der tilsættes 3,5 ml fagaffjedring i hvert af de 4 rør.
4. Phage cocktail forberedelse
- Lav en blanding af fire fager, der inficerer stammen PAO1, tidligere isoleret og karakteriseret8. Før blanding, anslå titer af hver lager ved plaque assay20.
- Fagcocktailen samles med en samlet titer på 5 × 108 pfu/ml ved at blande fire fagpræparater på samme pfu/ml lige før hvert forsøg på lige fod for at sikre nøjagtige fagtitre.
5. Indsamling og fremstilling af zebrafiskembryoner til cftr morfos mikroinjektion
BEMÆRK: Opsaml 1-2 celle embryoner fra vild type zebrafisk til cftr morpholinos(cftr-MOs) mikroinjektion.
- To dage før det bakterielle mikroinfektionsforsøg skal der oprettes avlspar og indsamle embryoner som beskrevet tidligere21. Voksen zebrafisk (Danio rerio) af AB stammen blev købt fra det europæiske Zebrafisk Resource Center, EZRC.
- Dagen efter opsaml embryonerne umiddelbart efter befrugtningen med en plastpipette eller ved hjælp af en finmasket si. De indsamlede embryoner sættes i en petriskål, der indeholder E3-embryomediet, og fjernes forsigtigt snavset med en plastpipette for at undgå forurening, der kan skade embryonets udvikling.
- Der klargøres 5 μL morfiningsopløsning ved at fortynde de to morfoolinobestandopløsninger (1 mM) i sterilt vand til en endelig koncentration på 0,25 pmol/embryo ATG-MO + 0,25 pmol/embryo splejsning-MO. For at spore embryoinjektionen tilsættes 0,5 μL fenolrød til blandingen af morolinoinjektionsopløsningen.
- Der indbelæses en mikroinjektionsnål med ca. 5 μL af morfoolinblandingsopløsningen med en 20 μL mikropipette med en fin gelbelastningsspids. Fastgør nålen til den mikromanipulator, der er tilsluttet et stativ, og placer den under et stereomikroskop.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt, at opløsningen når spidsen af nålen, da mikroinjektorpumpens tryk vil skubbe den. - Klip spidsen af nålen af ved at skære nålespidsen med fine sterile pincet. Mål dråbens diameter ved hjælp af en skalabjælke i mikroskopets okulære. Alternativt kan du oprette en dråbe mineralsk olie på et mikrometerskreds og indstille mikroinjektionsvolumenet ved at indsprøjte opløsningen i oliedråbe for at vurdere dråbestørrelsen. Brug en dråbe med en diameter på 156 μm til at injicere et volumen på 2 nL.
- Indstil mikroinjektoren ved at justere kompensationstrykket til 15 hPa, injektionstiden til 0,5 s og injektionstrykket mellem 300 og 600 hPa for at opnå det korrekte injektionsvolumen afhængigt af den anvendte nål.
- Med en plastikpipette arrangere embryoner fra trin 5.2 på et glas placeret i en 96 mm diameter Petri fad.
BEMÆRK: For meget E3-medium vil forhindre korrekt indtrængen af mikroinjektionsnålen i embryons chorion. - Trænge ind i chorion og derefter æggeblomme med nålen til at injicere 2 nL i fosteret som beskrevet tidligere22.
- Der indsprøjtes embryoner i en petriskål med E3-medium, og læg dem i en kuvøse ved 28 °C, så de kan udvikle sig til dagen efter.
6. Mikroinjektion af zebrafiskembryoner med bakterier og fagcocktail
BEMÆRK: For at udføre en systemisk infektion skal fosteret have blodcirkulation, der normalt starter efter 26 hk.
- Efter 26 hkf (for zebrafisk udviklingsstadier henvise til Kimmel21) dechorionate embryoner med pronaseopløsning fremstillet ved opløsning af pronasepulver i E3 medium i en koncentration på 2 mg/ml. Forsigtigt pipette embryoner til at bryde chorion. Pronase/E3-mediet kasseres, og skålen skylles flere gange med frisk E3 for at fjerne al pronase.
- Bedøve zebrafisk embryoner i E3 medium indeholder Tricaine ca 5 min før injektioner.
- Pipette de bedøvede embryoner ind i sporet forberedt i trin 1. Brug en fin gel læssetip til at linje embryonerne i sidestilling.
- Der indbelæsser en mikroinjektionsnål med ca. 5 μL af P. aeruginosa-præparatet som beskrevet i del 5.
- Sæt nålen dorsally til udgangspunktet for kanalen af Cuvier, hvor det begynder at sprede sig over æggeblomme sæk. Indsprøjt et volumen på 1-3 nL, og sørg for, at lydstyrken udvides direkte i kanalen og kommer i omløb.
- Ca. efter hver 50 injiceret-embryo, injicere en dråbe af bakterierne i en 1,5 ml centrifuge rør med 100 μL steril PBS at kontrollere, om injektion volumen forbliver den samme. Inokulumet på LB agar (se tabel 1) ved 37 °C natten over for at vurdere CFU.
- De mikroindsjævnede embryoner overføres i to rene petriskåle med frisk E3-medium + PTU, og de inkuberes ved 28 °C.
- På to udvalgte tidspunkter: 30 min eller 3 timer efter bakteriel injektion, tage en af petriskåle med bakteriel-injicerede embryoner fra inkubatoren og tilpasse dem i sporet som beskrevet i 6,3 for cocktail injektion.
- Der indbelæses en mikroinjektionsnål med ca. 5 μL af fagcocktailpen (fremstillet i trin 4) med en fin gelbelastningsspids, og fastgør den til mikroinjektoren (se trin 5).
- Injicer fagcocktail i kanalen af Cuvier af embryoner tidligere injiceret med bakterier.
- De mikroindsjævnede embryoner overføres i to rene petriskåle med frisk E3-medium + PTU, og de inkuberes ved 28 °C.
7. Vurdering af bakteriebyrden for embryoner, der injiceres med PAO1 og fager
- Ved 8 hpi pipettes 15 bedøvede embryoner fra petriskålen til et 1,5 ml centrifugerør.
- Den anæstesiopløsningen skal erstattes med 300 μL på 1 % Triton X-100 i PBS (PBSTritonX), og embryonerne homogeniseres ved at sende dem mindst 15x gennem en insulinsprøjte med en steril 27-G nål.
- Der forberes serielle fortyndinger af homogenater i steril PBS ved at overføre 100 μL af det fortyndede homogenat til 900 μL steril PBS.
- For at vælge den naturligt ampresistente PAO1-stamme, plade 100 μL af fortyndingerne på LB agar tilsat ampicillin (100 μg/ml) og inkubere ved 37 °C over natten.
- Dagen efter tælles antallet af kolonier, multipliceres med fortyndingsfaktoren for at bestemme det samlede antal CFU og divideres med antallet af embryoner, der homogeniseres for at opnå det gennemsnitlige antal CFU/inficerede embryoner.
8. Vurdering af dødeligheden af embryoner, der injiceres med PAO1 og fager
- For at vurdere dødeligheden af PAO1-infektionen skal de injicerede embryoner være 20 hpi under et stereomikroskop og tælle for de døde embryoner (hvide/ikke gennemsigtige).
- Den halve maksimale letale koncentration 50 (LD50) p PAO1, der bestemmer 50% af de injicerede embryoners død ved 20 hkf.
9. Embryoforberedning til stereomikroskop time-lapse-infektion af GFP+ PAO1-infektion
- Preparat formen til levende-embryo billeddannelse ved at opløse 1,5% lav smeltende agarose i 100 ml E3 opløsning.
- Der tilsættes 1 % tricain (se tabel 1)for at bedøve embryonerne.
- Ved 4 hpi overføre et foster med en plast pipette i et glas bund fad og tilsæt den varme lav-smeltepunkt agarose opløsning.
- Anbring glasbundsskålen under et stereomikroskop og med en spidsposition af fosteret i den ønskede retning. Brug en plastikpipette til forsigtigt at tilsætte en dråbe agarose på fosteret.
- Lad agarose afkøle i 5-10 min og forsigtigt fylde glasbundskålen med E3 indeholdende bedøvelsesopløsningen for at holde fosteret fugtigt.
- Glasbundskålen skal sættes i bunden med fosteret under det fluorescerende stereomikroskop med et fluorescerende filter (kanal 488 nm) for GFP+ bakterier. Petriskålen må ikke fjernes før yderligere anskaffelser med de samme parametre ved 9, 14 og 18 hpi.
10. Ekspressionsanalyser af proinflammatoriske cytokiner
- Ved 20 hpi bedøve embryoner med tricain 1x opløsning og overføre dem fra Petriskålen til en 1,5 ml centrifuge rør.
- Under en røghætte fjernes bedøvelsesopløsningen og udskiftes med 200 μL reagens af guanidiumhydrorid.
- Homogeniser embryoner ved at pipettere dem gentagne gange gennem en 200 μL pipette først og derefter mindst 15x med en insulinsprøjt med en steril 27 G nål.
- Der udvindes total RNA fra homogeniserede zebrafiskembryoner ved hjælp af et kommercielt tilgængelige guanidiumhydroriumhydrorium reagenser i henhold til producentens anvisninger.
- 1 μg af hver prøve af RNA med 2 μL 1U/μL DNase I (RNase-fri) efter fabrikantens anvisninger.
- Brug 1 μg DNase I behandlet RNA til reverse-transskriptionsreaktion (RT) ved hjælp af kommercielt tilgængelige kit (se Tabel over materialer),i et samlet volumen på 20 μL i henhold til producentens anvisninger.
- RT qPCR-reaktion udføres i et samlet volumen på 10 μL indeholdende 1x SYBR Green mastermix med 1,5 μL af en 1:6 fortynding af RT-reaktion. Til normaliseringsformål anvendes primere til de husholderske gener rpl8 og til proinflammatoriske cytokiner ved hjælp af primere til TNF-α og IL-1β (se tabel 2). qPCR protokol var: cyklus 1 trin 1: 95 °C, 2 min, gentag én gang; cyklus 2: trin 1 95 °C, 10 s, trin 2 55 °C, 30 s, gentag 40x cyklus 3: trin 1 72 °C, 15 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultater og tal, der præsenteres her, omtales cf embryoer, der genereres ved injektion af cftr morpholinos som beskrevet tidligere10 og i trin 5. For at validere CF fænotype, den svækkede position af indre organer såsom hjerte, lever, og bugspytkirtel som tidligere beskrevet17 (Figur 1) blev overvejet. Lignende resultater blev opnået i tilfælde af WT embryoner som rapporteret i vores tidligere publikation19.
Bakteriebyrden blev reduceret ved fagterapi i CF-embryoner inficeret med PAO1. Desuden evaluerede vi bakteriebyrden ved 8 hpi ved at homogenisere grupper af 15 embryoner: det gennemsnitlige antal bakterier (cfu/embryo), der findes i PAO1-inficerede embryoner, blev reduceret til ca. 20 % efter behandling med fagadministration, hvilket bekræftede en mindre alvorlig infektion i nærværelse af fagcocktail (figur 2).
Dødeligheden blev reduceret ved fagterapi i CF-embryoner inficeret med GFP+ bakterier PAO1. CF zebrafisk embryoner på 48 hkf blev injiceret med GFP+ bakterier af PAO1 stamme ved en dosis, der forårsagede 50% dødelighed efter 20 hpi (30 cfu / embryo, Figur 3A). Injektionsstedet var æggeblomme eller Duct of Cuvier for at generere en systemisk infektion. Fagbehandling mod PAO1-infektion blev testet ved injektion af 2 nL af den lige så blandede fagcocktail (300-500 pfu/embryo). Injektionen blev udført på to forskellige tidspunkter: 30 min (tidligt) og 7 timer (sent) efter bakteriel injektion. I begge tilfælde blev dødeligheden reduceret ved 20 hpi, hvilket indikerer, at fagterapi er effektiv (figur 3B).
Med levende billeddannelse, ved hjælp af et fluorescerende stereomikroskop, fulgte vi også udviklingen af infektionen i CF embryoner injiceres med GFP+ PAO1 og viste effekten af fagterapi til at reducere spredningen af fluorescerende bakterier over blommesækken. CF+PAO1-indsprøjtet embryo med GFP+-bakterieformering ved 4, 9, 14 og 18 hpi er vist på oversiden af figur 4, mens CF+PAO1+fag fosteret med nedsat fluorescens på grund af faghandling mod bakterier er vist i den nederste del (figur 4).
Fagterapi reducerede den inflammatoriske respons, der genereres ved PAO1-infektion i CF-embryoner. Vi evaluerede også immunresponset genereret af PAO1 og PAO1 + faginjektion ved 8 hpi. Som forventet blev ekspressionen af de proinflammatoriske cytokiner TNF-a og IL-1β analyseret ved qPCR-teknikker signifikant forøget efter PAO1-injektion i forhold til kontroller, mens det blev reduceret med sammeninjektion af fagcocktailen (Figur 5A, B).
Figur 1: Generering og validering af CF-embryoner ved cftr.h.-indsprøjtning cftr (cftr-MOs). A) Nedsat position og løkke af hjertet i CF-indsprøjtede embryoner i forhold til vilde embryoner (WT). Hjertet visualiseres med cmlc2 udtryk ved in situ hybridiseringsteknik. (B) Nedsat position af leveren (pile) og bugspytkirtel i CF embryoner i forhold til WT. Lever og bugspytkirtel visualiseres med prox1a udtryk ved in situ hybridisering teknikker. Skalastænger angiver 100 μm. liv: lever; p: bugspytkirtel. Tallet er genoptrykt fra19 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Bakteriel byrde i CF-embryoner inficeret med PAO1 eller PAO1+fager. Den relative procentdel af cfu/embryo i PAO1+fag vs PAO1-embryoner angives. Middelværdi og SD for tre uafhængige eksperimenter rapporteres. Tallet genoptrykes fra19. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Dødeligheden af CF zebrafiskembryoner inficeret med PAO1 og med PAO1+fager. a) Bestemmelse af LD50 i 48 hpf zebrafisk embryoner microinjected med cftr-MO på 1-celle fase (CF embryoner) og inficeret med 48 hkf med 2 nL af en kultur PAO1 indeholder stigende antal bakterier (cfu / embryo). Embryonernes dødelighed blev observeret ved 20 hpi. b) Dødelighed ved 20 hpi CF-embryoner inficeret med PAO1 ved 48 hkf og behandlet med fagcocktail (PAO1+ Φ). Den gennemsnitlige og SD rapporterede er fra seks og fire forsøg, henholdsvis hver med 25-40 embryoner. Vinkeltransformation blev anvendt på den procentdel af dødelighed og envejs ANOVA efterfulgt af Duncan's test blev brugt. Tallet genoptrykes fra19. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Billeddannelse af effekten af fagterapi hos zebrafisk. Progression af infektionen i CF-embryoner efter PAO1-injektion (øvre embryo) og effekten af fagbehandlingen i PAO1+fagindsprøjtede embryoner (bundembryon) ved 4, 9, 14 og 18 hpi. Skalalinjen angiver 100 mikron. Tallet genoptrykes fra19. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Ekspression af pro- og antiinflammatoriske cytokiner efter administration af PAO1 og PAO+fag. Ekspressionsniveauer af TNF-a (A) og IL-1β-generne målt ved RT-qPCR ved 8 hpi i CF-embryoner injiceret med PAO1 og PAO1+Φ ved 48 hk og normaliseret ved hjælp af ekspressionen rpl8. Middelværdi og SD for fire forsøg rapporteres. Statistisk signifikans blev vurderet af ANOVA efterfulgt af Duncans test: for TNF- a (CF) vs (CF+PAO1) p = 0,015*; (CF) vs (CF+PAO1+Φ) p = 0,019*; (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,77 n.s.; for IL-1β (CF) vs (CF+PAO1) p = 0,00014*** (CF) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,00068*** (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,031*. Tallet genoptrykes fra19. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Løsninger | Under forberedelse |
| Bedøvelsesbestandsopløsning 25X | 4 mg/ml tricain i destilleret H2O. |
| Anæstesiarbejdsløsning 1X | fortyndes i destilleret H2O Tricaine-stamopløsningen 25X præparat for at nå 1X-koncentrationen (0,16 mg/ml) Tricaine af destilleret H2O. |
| CsCl d=1,3 | 20,49 g i 50 ml TN |
| CsCl d=1,4 | 20,28 g i 50 ml TN |
| CsCl d=1,5 | 34,13 g i 50 ml TN |
| CsCl d=1,6 | 41,2 g i 50 ml TN |
| E3 embryo medium for zebrafisk embryo | 1 L 1of E3 (fortyndes 50X-bestanden med destilleret H2O) + 200 μl 0,05% methylblåt . Store hos RT. |
| E3 embryo medium lager opløsning (50X) | 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl , 9,15 g CaCl2 og 9,95 g MgSO4 i 5 L destilleret H2O. Opbevaring på RT. |
| LB agar | 10 g/L tryptone, 5 g/L gærekstrakt, 5 g/L NaCl, 10 g/L agar |
| LB bouillon | for 1L: 950 ml H2O, 10 g Tryptone, 10 g NaCl, 5 g Gærekstrakt |
| PBST | PBS 1X + Triton X 1% |
| Fysiologisk løsning | 0,9% NaCl |
| Pigmentering blokering lager løsning 10X | 0,3 mg/ml phenyl thiourea (PTU) pulver i E3 embryomedium til zebrafiskembryon |
| Pronase lager løsning 5X | 5 mg/ml pronasepulver i E3 embryomedium til zebrafiskeembryon |
| TN-buffer | 10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl |
Tabel 1: Udarbejdelse af opløsninger.
| Gennavn | Primer sekvens |
| TNF-alpha Fw | 5'-TGCTTCACGCTCCATAAGACC-3' |
| TNFalpha Rev | 5'-CAAGCCACCTGAAGAAAAGG-3' |
| IL1-beta Fw | 5'-TGGACTTCGCAGCAAAATG-3' |
| IL1-beta Rev | 5'-CGTTCACTTCACGCTCTTGGATG-3' |
| rpl8 Fw | 5'-CTCCGTCTTCAAAGCCCAT-3' |
| rpl8 Rev | 5'-TCCTTCACGATCCTTGAT-3' |
Tabel 2: Primere, der anvendes til RT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskript beskrev vi protokollen til at udføre P. aeruginosa (PAO1) infektion i zebrafisk embryoner og hvordan man anvender fagterapi med en cocktail af fager tidligere identificeret som i stand til at inficere PAO1 at løse det. Brugen af bakteriofager som et alternativ til antibiotikabehandlinger har været af stigende interesse siden de sidste par år. Dette skyldes hovedsagelig udbredelsen af multiresistente bakterielle infektioner (MDR), som udgør et alvorligt problem for folkesundheden. Selvfølgelig er omfanget af dette arbejde begrænset til anvendelse af fagterapi til en dyremodel og ikke til mennesker. Men vi genererede en cystisk fibrose zebrafisk model med injektion af en morfoolino rettet mod cftr genet, viser effekten af fagterapi også i en patogenetisk model særligt modtagelige for P.aeruginosa infektion.
Det er at bemærke, at vi let kunne opnå fagterapi, som i et tidligere arbejde, vi isolerede og karakteriseret forskellige fager i stand til at inficere P. aeruginosa både in vitro og in vivo8. Dette trin er afgørende for at opnå den antimikrobielle aktivitet af fager. Isolation og karakterisering af fager i stand til at inficere en bestemt bakteriel stamme er kritiske trin i fagterapi ansøgning. For at undgå negative virkninger af fager på dyret/den menneskelige vært er det nødvendigt at anvende lytiske fager i stedet for disse lysogene. Vigtigst er det nødvendigt at kontrollere faggenomerne for tilstedeværelsen af skadelige gener som dem for antibiotikaresistens, virulens og genoverførsel.
Fagterapi er allerede blevet anvendt med succes i andre dyremodeller. Vi er bevidste om, at zebrafisk ikke er en pattedyrmodel, og nogle virkninger af fager kan være anderledes. Men da zebrafisk har et medfødt immunsystem, der kan sammenlignes med det menneskelige med en bevaret population af neutrofiler og makrofager23, spekulerer vi på, at dataene om immunresponset kan reproduceres hos mennesker. Desuden er zebrafisk godt vurderet for bakteriel infektion undersøgelser, dens anvendelse som en tester for fagterapi effekt kan være lovende for terapeutiske tilgange. Faktisk kan infektionen være systemisk, hvis bakterier injiceres i omløb gennem Duct of Cuvier, eller lokaliseret som rapporteret17. Vi udførte både systemiske og lokaliserede infektioner og viste, at de på samme måde genereret øget dødelighed og bakteriel byrde, der begge var nedsat efter fagterapi ansøgning. Da GFP+ fluorescerende PAO1-bakterier blev injiceret, var det desuden let at følge infektionen på forskellige tidspunkter af embryonudvikling, der bekræfter reduktionen af fluorescerende bakterier, når fager blev injiceret.
Så meget som vi ved, er dette den første beskrivelse af fagterapi ansøgning i zebrafisk, med merværdien til demonstration af fager antimikrobiel aktivitet mod P. aeruginosa i en CF baggrund, der er særligt modtagelige for denne bakterielle infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den italienske cystisk fibrose Foundation (FFC #22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo og FFC#23/2019; Ueståsom respiro i più Onlus La Mano tesa Onlus).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
References
- Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
- Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
- Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
- Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
- Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
- McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
- Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
- Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
- Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
- Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
- Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
- Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).
- Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
- Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
- Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
- Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).
