Summary
Presentato qui è un protocollo per l'infezione da Pseudomonas aeruginosa e l'applicazione della terapia del fago negli embrioni di zebrafish della fibrosi cistica (CF).
Abstract
La resistenza antimicrobica, una delle principali conseguenze dell'incertezza diagnostica e della sovraprescrizione antimicrobica, è una causa sempre più riconosciuta di infezioni gravi, complicazioni e mortalità in tutto il mondo con un enorme impatto sulla nostra società e sul sistema sanitario. In particolare, i pazienti con sistema immunitario compromesso o patologie preesistenze e croniche, come la fibrosi cistica (CF), sono sottoposti a frequenti trattamenti antibiotici per controllare le infezioni con l'aspetto e la diffusione di isolati multifarmacologici resistenti. Pertanto, vi è l'urgente necessità di affrontare terapie alternative per contrastare le infezioni batteriche. L'uso di batteriofagi, i nemici naturali dei batteri, può essere una possibile soluzione. Il protocollo dettagliato in questo lavoro descrive l'applicazione della terapia del fago contro l'infezione da Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish CF. Gli embrioni di zebrafish sono stati infettati da P. aeruginosa per dimostrare che la terapia del fago è efficace contro le infezioni da P. aeruginosa in quanto riduce la letalità, il peso batterico e la risposta immunitaria pro-infiammatoria negli embrioni CF.
Introduction
La terapia del fago, l'uso dei nemici naturali dei batteri per combattere le infezioni batteriche, sta raccogliendo rinnovato interesse man mano che la resistenza batterica agli antibiotici diventadiffusa 1,,2. Questa terapia, utilizzata da decenni nell'Europa orientale, potrebbe essere considerata un trattamento complementare agli antibiotici nella cura delle infezioni polmonari nei pazienti con CF e una possibile alternativa terapeutica per i pazienti infetti da batteri resistenti a tutti gli antibiotici attualmente in uso2,,3. I vantaggi della terapia antibiotica sono che i batteriofagi si moltiplicano nel sito di infezione, mentre gli antibiotici vengono metabolizzati ed eliminati dalcorpo 4,5. In effetti, la somministrazione di cocktail di fagi virulenti isolati in diversi laboratori si è dimostrata efficace nel trattare le infezioni da Pseudomonas aeruginosa in modelli animali diversi come insetti e mammiferi6,,7,,8. La terapia del fago ha anche dimostrato di essere in grado di ridurre il carico batterico nelle ferite da ustione infettate da P. aeruginosa ed Escherichia coli in uno studio clinico randomizzato9.
Zebrafish (Danio rerio) è recentemente emerso come un modello prezioso per studiare le infezioni con diversi agenti patogeni, tra cui P. aeruginosa10,,11, Mycobacterium abscessus e Burkolderia cepacia12,,13. Microiniettando batteri direttamente nella circolazione sanguignadell'embrione 14 è facile stabilire un'infezione sistemica che viene contrastata dal sistema immunitario innato zebrafish, che è evolutivo conservato con neutrofili e generazione di macrofagi simile alla controparte umana. Inoltre, durante il primo mese di vita, gli embrioni di zebrafish mancano della risposta immunitaria adattiva, rendendoli modelli ideali per studiare l'immunità innata, che è il meccanismo di difesa critico nelle infezioni polmonariumane 15. Zebrafish è recentemente emerso come un potente sistema di modelli genetici per comprendere meglio l'insorgenza della CF e sviluppare nuovi trattamentifarmacologici 10,,16,,17. Il modello cf zebrafish di cftr knock-down generato con iniezione di morfolino nel pesce zebra ha presentato una risposta di scoppio respiratorio smorzato e una ridotta migrazione neutrofila10, mentre il knock-out cftr porta a una posizione interna dell'organo compromessa e alla distruzione del pancreas esocrina, un fenotipo che rispecchia la malattia umana16,,17. Di maggiore interesse è stato il risultato che il carico batterico P. aeruginosa è stato significativamente più elevato negli embrioni cftr-perdita di funzione che nei controlli a 8 ore dopo l'infezione (hpi), che è parallelo ai risultati ottenuti con topi e cellule epiteliali bronchialiumane 2,18.
In questo lavoro, dimostriamo che la terapia del fago è efficace contro le infezioni da P. aeruginosa negli embrioni di zebrafish.
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Protocol
I pesci zebra adulti (Danio rerio) del ceppo AB (European Zebrafish Resource Center EZRC) sono mantenuti secondo le linee guida internazionali (Direttiva UE 2010/63/UE) e nazionali (decreto italiano 4marzo 2014, n. 26) sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. Le condizioni standard sono fissate nell'impianto ittico con un ciclo di buio di 14 ore /10 h e una temperatura dell'acqua del serbatoio a 28 °C.
1. Preparazione di soluzioni e strumenti
- Preparare una soluzione stock 50x e 1x soluzioni di lavoro per il mezzo embrionale E3 per la coltivazione di embrioni di zebrafish (vedi tabella 1).
- Fare la soluzione di blocco della pigmentazione, per bloccare la pigmentazione dell'embrione da 24 ore dopo la fecondazione (24 hpf) (vedi tabella 1).
- Preparare 25 volte stock e 1 soluzione anestetica Tricane funzionante come descritto nella tabella 1.
NOTA: Per evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti della soluzione che potrebbero danneggiare la soluzione di stoccaggio, effettuare aliquote di 2 mL di 25x tricaina e conservarle a -20 °C. - Preparare tracce per la microiniezione embrionale sciogliendo 1 g di agarosio in 100 ml di H2O distillato in un pallone o in una bottiglia microwavable. Microonde per 1-3 minuti fino a quando l'agarosio non è completamente sciolto.
- Posizionare gli stampi di microiniezione zebrafish (vedi Tabella dei materiali)capovolti in una piastra di Petri (90 mm x 15 mm) e coprire l'intera superficie versando il gel di agarosio liquido con una larghezza di circa 10 mm.
- Rimuovere lo stampo una volta che l'agarosio si è solidificato. Riempire la piastra di Petri con 1x mezzo embrione E3. Questo può essere conservato a 4 °C per circa una settimana. Prima dell'uso, sostituire con il mezzo fresco E3 contenente Tricaine.
NOTA: Gli stampi più vecchi potrebbero sviluppare funghi o contaminazioni batteriche. - Utilizzare capillari borosilicati di 10 cm lucidati dal fuoco per preparare gli aghi per la microiniezione e fissarli all'estrattore di micropipette stringendo le maniglie. Impostare l'estrattore con le seguenti impostazioni: calore 500, velocità 100, tempo 150, tirare 150.
2. P. aeruginosa (PAO1) preparazione dell'inoculo
- Inoculare 1 colonia di GFP+P. aeruginosa ceppo PAO119 in 5 mL di brodo LB (vedi tabella 1) e crescere durante la notte a 37 °C con scuotimento (200 giri/min).
- Diluire la coltura notturna di cui sopra in OD600 = 0,1 in 10 mL di brodo LB e crescere fino a600 OD = 0,5 a 37 °C con scuotimento (200 giri/min).
- Centrifugare 2 mL della coltura per 2 min a 4 °C a 16.100 x g e resuspendare il pellet cellulare a OD600 = 1, equivalente a circa 1 x 109 cfu/mL, in 1 mL della soluzione fisiologica (cfr. tabella 1).
- Diluire la sospensione cellulare a circa 5 x 10 7 cfu/mL insoluzionefisiologica e conservare a 4 °C.
3. Preparazione stock di fago
- Inoculare 1 colonia di P. aeruginosa ceppo PAO1 in 5 mL di brodo LB e incubare durante la notte a 37 °C con scuotimento. Diluire la coltura notturna in OD600 = 0,01 in 500 mL di brodo LB e crescere a 37 °C con scuotimento a OD600 = 0,05, equivalente a circa 2,5 x 107 cfu/mL.
- Alla coltura diluita di P. aeruginosa, aggiungere circa 1,25 x 107 fagi, per ottenere la molteplicità di infezione (M.O.I.) di 10-3. Incubare a 37 °C con agitazione fino a quando l'OD600 scende a circa 0,1-0,3 (in circa 3-5 ore, a seconda del fago utilizzato).
NOTA: Per questo esperimento sono stati selezionati quattro fagi che infettano la tensione PAO1: due Podoviridae, i numeri di adesione genbank vB_PaeP_PYO2, MF490236 e vB_PaeP_DEV, MF490238 e due Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 e vB_PaeM_E217, MF490240. Eseguire i passaggi seguenti per ogni fago singolarmente. - Incubare il lisato con 1 mg/mL di DNasi e RNasi per 30 min a 37 °C. Centrifuga a 5.000 x g per 30 min a 4 °C e recupera con cura il supernatante (SN). Filtrare l'SN con un filtro con un diametro dei pori di 0,8 μm.
- All'SN aggiungere 58 g/L di NaCl e 105 g/L di PEG6000. Sciogliere con agitazione a RT 20 min e quindi tenerlo durante la notte a 4 °C. Centrifuga a 20.000 x g per 30 min a 4 °C per la precipitazione del fago. Rimuovere l'SN e sciogliere accuratamente il pellet di fago in 15 mL di tampone TN (vedere tabella 1).
- Purificare i fagi con gradiente di densità CsCl come descritto nei passaggi seguenti.
- In un tubi ad ultracentrifugo poliallomero per rotore SW41, preparare un gradiente di densità del passo CsCl stratificando 2 ml delle quattro soluzioni CsCl descritte nella tabella 1. Aggiungere 3,5 ml di sospensione del fago in ciascuno dei 4 tubi.
NOTA: CsCl è tossico, adotta procedure di sicurezza adeguate per maneggiarlo e scartarlo. - Introdurre i tubi nel rotore e assicurarsi che i tubi siano bilanciati (la differenza di peso tra i due tubi rivolti deve essere ≤ 0,01 g).
- Centrifuga per 2 ore a 4 °C e 100.000 x g (25.000 giri/min per rotore SW41). Dopo la centrifugazione, rimuovere lentamente i tubi e immobilizzarli con cura su un supporto. Utilizzando una siringa con ago da 19 G, disegnare la banda bianca/opalescente che di solito si trova tra la regione di d=1,5 e la regione di densità d=1,4.
- Trasferire le sospensioni dalla siringa in nuovi tubi in poliallomero per rotore SW60 e utilizzare la soluzione d=1.4 per bilanciare con precisione i tubi.
- Centrifugare la sospensione a 4 °C e 150.0000 x g (38.000 giri/min per il rotore SW60) per almeno 16 ore.
- Raccogliere la banda visibile come sopra (vedere il passaggio 3.3.3) e trasferirli in tubi di dialisi con taglio da 6.000 Da. Dializzare la banda visibile ottenuta 2x per 20 min contro 500 mL di acqua e durante la notte contro 500 mL di tampone TN. Filtrare con un filtro poro da 0,22 μm e conservare a 4 °C.
- In un tubi ad ultracentrifugo poliallomero per rotore SW41, preparare un gradiente di densità del passo CsCl stratificando 2 ml delle quattro soluzioni CsCl descritte nella tabella 1. Aggiungere 3,5 ml di sospensione del fago in ciascuno dei 4 tubi.
4. Preparazione cocktail di fago
- Fare un mix di quattro fagi che infettano il ceppo PAO1, precedentemente isolato e caratterizzato8. Prima della miscelazione, stimare il titolo di ogni fago per saggio diplacca 20.
- Assemblare il cocktail di fago, con un ttarello complessivo di 5 × 108 pfu/mL, mescolando allo stesso modo quattro preparati di fago allo stesso pfu/mL immediatamente prima di ogni esperimento, per garantire lettori di fago accurati.
5. Raccolta e preparazione di embrioni di zebrafish per la microiniezione di cftr morpholinos
NOTA: Raccogliere 1-2 embrioni cellulari da zebrafish di tipo selvatico per la microiniezione di cftr morpholinos (cftr-MOs).
- Due giorni prima dell'esperimento di microiniezione batterica, impostare coppie riproduttive e raccogliere embrioni come descritto in precedenza21. Il pesce zebra adulto(Danio rerio)del ceppo AB è stato acquistato presso l'European Zebrafish Resource Center, EZRC.
- Il giorno dopo, raccogliere gli embrioni immediatamente dopo la fecondazione con una pipetta di plastica o utilizzando un colino a maglie fini. Posizionare gli embrioni raccolti in una piastra di Petri contenente mezzo embrionale E3 e rimuovere accuratamente i detriti con una pipetta di plastica per evitare contaminazioni che potrebbero danneggiare lo sviluppo dell'embrione.
- Preparare 5 μL di soluzione di iniezione di morfolino diluire le due soluzioni di morpholino stock (1 mM) in acqua sterile ad una concentrazione finale di 0,25 pmol/embrione ATG-MO + 0,25 pmol/embrione splice-MO. Per rintracciare l'iniezione embrionale, aggiungere 0,5 μL di rosso fenolo alla miscela di soluzione di iniezione di morfolino.
- Caricare un ago di microiniezione con circa 5 μL della soluzione di miscela di morfolino utilizzando una micropipetta da 20 μL con una punta di carico del gel fine. Fissare l'ago al micromanipolatore collegato a un supporto e posizionarlo sotto uno stereomicroscopio.
NOTA: Non è necessario che la soluzione raggiunga la punta dell'ago poiché la pressione della pompa del microiniettore lo spingerà. - Ritagliare la punta dell'ago tagliando la punta dell'ago con una pinzetta sterile fine. Misurare il diametro della goccia utilizzando una barra di scala nell'oculare del microscopio. In alternativa, creare una goccia di olio minerale su uno scivolo micrometrico e impostare il volume di microiniezione iniettando la soluzione nella goccia d'olio per valutare la dimensione della goccia. Utilizzare una goccia con un diametro di 156 μm per iniettare un volume di 2 nL.
- Impostare il microiniettore regolando la pressione di compensazione a 15 hPa, il tempo di iniezione a 0,5 s e la pressione di iniezione tra 300 e 600 hPa per ottenere il volume di iniezione corretto a seconda dell'ago utilizzato.
- Con una pipetta di plastica disporre gli embrioni dal passo 5.2 su un vetro posizionato in una piastra di Petri di 96 mm di diametro.
NOTA: Troppo mezzo E3 impedirà la corretta penetrazione dell'ago di microiniezione nel corore degli embrioni. - Penetrare il corore e quindi il tuorlo con l'ago per iniettare 2 nL nell'embrione come descritto inprecedenza 22.
- Mettere gli embrioni iniettati in una piastra di Petri con mezzo E3 e metterli in un'incubatrice a 28 °C per lasciarli sviluppare fino al giorno dopo.
6. Microiniezione di embrioni di zebrafish con batteri e cocktail di fago
NOTA: Per eseguire un'infezione sistemica, l'embrione deve avere una circolazione sanguigna che di solito inizia dopo 26 HPF.
- Dopo 26 hpf (per le fasi di sviluppo del pesce zebra si riferiscono a Kimmel21) gli embrioni di dechorionato con soluzione di pronasi preparati sciogliendo la polvere di pronasi nel mezzo E3 ad una concentrazione di 2 mg/mL. Pipettare delicatamente gli embrioni per rompere il corone. Scartare il mezzo pronasi/E3 e sciacquare il piatto più volte con E3 fresco per rimuovere tutta la pronasi.
- Anestetizzare embrioni di zebrafish in mezzo E3 contenente Tricaina circa 5 minuti prima delle iniezioni.
- Pipettare gli embrioni anesteizzati nella pista preparata al passaggio 1. Utilizzare una punta di caricamento del gel fine per allineare gli embrioni in posizione laterale.
- Caricare un ago di microiniezione con circa 5 μL del preparato P. aeruginosa come descritto nella parte 5.
- Inserire l'ago dorsalmente al punto di partenza del condotto di Cuvier dove inizia a diffondersi sul sacco del tuorlo. Iniettare un volume di 1-3 nL e assicurarsi che il volume si espanda direttamente all'interno del condotto ed entri nella circolazione.
- Circa dopo ogni 50 embrioni iniettati, iniettare una goccia di batteri in un tubo di centrifuga da 1,5 ml con 100 μL di PBS sterile per verificare se il volume di iniezione rimane lo stesso. Placcare l'inoculo sull'agar LB (cfr. tabella 1) a 37 °C durante la notte per valutare la CFU.
- Trasferire gli embrioni microiniettati in due piastre di Petri pulite con mezzo E3 fresco + PTU e incubarli a 28 °C.
- In due punti di tempo selezionati: 30 min o 3 h dopo l'iniezione batterica, espulsi una delle piastre di Petri con embrioni iniettati battericamente dall'incubatore e allinearli in pista come descritto al punto 6.3 per l'iniezione di cocktail di fago.
- Caricare un ago di microiniezione con circa 5 μL del cocktail di fago (preparato nella fase 4) con una punta di caricamento del gel fine e fissarlo al microiniettore (vedere il passaggio 5).
- Iniettare il cocktail di fago nel condotto di Cuvier degli embrioni precedentemente iniettati con batteri.
- Trasferire gli embrioni microiniettati in due piastre di Petri pulite con mezzo E3 fresco + PTU e incubarli a 28 °C.
7. Valutazione del carico batterico degli embrioni iniettati con PAO1 e fagi
- A 8 hpi, pipetta 15 embrioni anestetizzati dalla piastra di Petri a un tubo di centrifuga da 1,5 ml.
- Sostituire la soluzione anestetica con 300 μL dell'1% di Tritone X-100 in PBS (PBSTritonX) e omogeneizzare gli embrioni passandoli almeno 15 volte attraverso una siringa per insulina con un ago sterile da 27 G.
- Preparare diluizioni seriali di omogeneati in PBS sterile trasferendo 100 μL dell'omogeneato diluito in 900 μL di PBS sterile.
- Per selezionare la deformazione PAO1 naturalmente resistente agli amplificatori, placcare 100 μL delle diluizioni sull'agar LB aggiunte con ampicillina (100 μg/mL) e incubare a 37 °C durante la notte.
- Il giorno dopo, conta il numero di colonie, moltiplica per il fattore di diluizione per determinare il numero totale di CFU e dividi per il numero di embrioni omogeneizzati per ottenere il numero medio di CFU /embrione infetto.
8. Valutazione della letalità degli embrioni iniettati con PAO1 e fagi
- Per valutare la letalità dell'infezione da PAO1, segnare gli embrioni iniettati a 20 hpi sotto uno stereomicroscopio e contare per gli embrioni morti (bianchi / non trasparenti).
- Calcolare la dose di concentrazione letale semi-massima 50 (LD50) di PAO1 che determina la morte del 50% degli embrioni iniettati a 20 hpf.
9. Preparazione dell'embrione per l'imaging stereomicroscopio time-lapse dell'infezione da GFP+ PAO1
- Preparare lo stampo per l'imaging di embrioni vivi sciogliendo l'1,5% di agarosio a bassa fusione in 100 mL di soluzione E3.
- Aggiungere l'1% di tricaina (cfr. tabella 1) per anestetizzare gli embrioni.
- A 4 hpi trasferire un embrione con una pipetta di plastica in un piatto inferiore di vetro e aggiungere la soluzione calda di agarosio a basso punto di fusione.
- Posizionare la piastra inferiore in vetro sotto uno stereomicroscopio e con una punta posizionare l'embrione nell'orientamento desiderato. Utilizzare una pipetta di plastica per aggiungere con cura una goccia di agarosio sull'embrione.
- Lasciare raffreddare l'agarosio per 5-10 minuti e riempire delicatamente il piatto inferiore in vetro con E3 contenente la soluzione anestetica per mantenere umido l'embrione.
- Posizionare la piastra inferiore in vetro con l'embrione sotto lo stereomicroscopio fluorescente con un filtro fluorescente (canale 488 nm) per i batteri GFP+. Non rimuovere la piastra di Petri fino a ulteriori acquisizioni con gli stessi parametri a 9, 14 e 18 hpi.
10. Analisi di espressione delle citochine pro-infiammatorie
- A 20 hpi anestetizza gli embrioni con soluzione di tricaina 1x e trasferiscili dalla piastra di Petri a un tubo di centrifuga da 1,5 ml.
- Sotto una cappa aspirante rimuovere la soluzione anestetica e sostituirla con 200 μL di reagente di cloridrato di guanidio.
- Omogeneizzare gli embrioni tubazionandoli ripetutamente attraverso una pipetta da 200 μL prima e poi almeno 15 volte con una siringa per insulina con un ago sterile da 27 G.
- Estrarre l'RNA totale da embrioni di zebrafish omogeneizzati utilizzando un reagente di cloridrato di guanidio disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore.
- Trattare 1 μg di ciascun campione di RNA con 2 μL di 1U/μL di DNA I (senza RNasi), seguendo le istruzioni del produttore.
- Utilizzare 1 μg di DNasi Ho trattato l'RNA per la reazione di trascrizione inversa (RT) utilizzando il kit disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali),in un volume totale di 20 μL secondo le istruzioni del produttore.
- Eseguire la reazione RT qPCR in un volume totale di 10 μL contenente 1x SYBR Green mastermix usando 1,5 μL di una diluizione 1:6 della reazione RT. Ai fini della normalizzazione, utilizzare i primer per i geni di conservazione rpl8 e per le citochine pro-infiammatorie, utilizzare primer per TNF-α e IL-1β (vedi tabella 2). il protocollo qPCR era: ciclo 1 fase 1: 95 °C, 2 min, ripetere una volta; ciclo 2: fase 1 95 °C, 10 s, passo 2 55 °C, 30 s, ripetere 40x; ciclo 3: fase 1 72 °C, 15 min.
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Representative Results
I risultati e le cifre qui presentati sono riferiti agli embrioni di CF generati attraverso l'iniezione di cftr morpholinos come descritto inprecedenza 10 e nella fase 5. Per convalidare il fenotipo CF, è stata presa in considerazione la posizione compromessa di organi interni come cuore, fegato e pancreas come descritto in precedenza17 (Figura 1). Risultati analoghi sono stati ottenuti nel caso degli embrioni WT, come riportato nella nostra precedente pubblicazione19.
Il carico batterico è stato ridotto dalla terapia del fago negli embrioni CF infetti da PAO1. Inoltre, abbiamo valutato il carico batterico a 8 hpi omogeneizzando gruppi di 15 embrioni: il numero medio di batteri (cfu/embrione) presenti negli embrioni infetti pao1 è stato ridotto a circa il 20% dopo il trattamento di somministrazione del fago, confermando così un'infezione meno grave in presenza del cocktail difago (Figura 2).
La letalità è stata ridotta dalla terapia del fago negli embrioni CF infetti da GFP+ batteri PAO1. Embrioni di zebrafish CF a 48 hpf sono stati iniettati con GFP+ batteri del ceppo PAO1 a una dose che ha causato il 50% di letalità dopo 20 hpi (30 cfu / embrione, Figura 3A). Il sito di iniezione era il tuorlo o il condotto di Cuvier per generare un'infezione sistemica. La terapia del fago contro l'infezione da PAO1 è stata testata iniettando 2 nL del cocktail di fago altrettanto misto (300-500 pfu / embrione). L'iniezione è stata eseguita in due diversi punti di tempo: 30 minuti (presto) e 7 ore (in ritardo) dopo l'iniezione batterica. In entrambi i casi, la letalità è stata ridotta a 20 hpi, indicando che la terapia del fago è efficace (Figura 3B).
Con l'imaging dal vivo, utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente, abbiamo anche seguito la progressione dell'infezione negli embrioni CF iniettati con GFP+ PAO1 e abbiamo mostrato l'efficacia della terapia del fago nel ridurre la diffusione di batteri fluorescenti sul sacco del tuorlo. L'embrione iniettato CF+PAO1 con moltiplicazione batterica GFP+ a 4, 9, 14 e 18 hpi è mostrato nella parte superiore della Figura 4, mentre l'embrione CF+PAO1+phages con ridotta fluorescenza dovuta all'azione del fago contro i batteri è mostrato nella parte inferiore (Figura 4).
La terapia del fago ha ridotto la risposta infiammatoria generata dall'infezione da PAO1 negli embrioni CF. Inoltre, abbiamo valutato la risposta immunitaria generata dall'iniezione di PAO1 e PAO1 + fagi a 8 hpi. Come previsto, l'espressione delle citochine pro-infiammatorie TNF-a e IL-1β analizzate con tecniche qPCR è stata significativamente aumentata a seguito dell'iniezione di PAO1 rispetto ai controlli, mentre è stata ridotta con la co-iniezione del cocktail di fago(Figura 5A,B).
Figura 1: Generazione e convalida di embrioni di CF su iniezione di cftr morpholinos(cftr-MOs). (A) Posizione compromessa e looping del cuore negli embrioni iniettati di CF rispetto agli embrioni di tipo selvatico (WT). Il cuore viene visualizzato con l'espressione cmlc2 con la tecnica di ibridazione in situ. (B) La posizione compromessa del fegato (frecce) e del pancreas negli embrioni di CF rispetto a WT. Il fegato e il pancreas sono visualizzati con espressione di prox1a mediante tecniche di ibridazione in situ. Le barre di scala indicano 100 μm. liv: fegato; p: pancreas. La cifra viene ristampata da19 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Carico batterico negli embrioni CF infetti da PAO1 o PAO1+phages. Viene data la percentuale relativa di cfu/embrione negli embrioni PAO1+phages vs PAO1. Viene riportata la media e l'SD di tre esperimenti indipendenti. La cifra viene ristampata a partireda 19. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Letalità degli embrioni di zebrafish CF infettati da PAO1 e da PAO1+phages. (A) Determinazione dell'LD50 in embrioni di zebrafish da 48 HPF microiniettati con cftr-MO allo stadio a 1 cella (embrioni CF) e infettati a 48 HPF con 2 nL di una coltura di PAO1 contenente un numero crescente di batteri (cfu/embrione). La letalità degli embrioni è stata osservata a 20 hpi. (B) Letalità a 20 hpi di embrioni CF infettati da PAO1 a 48 hpf e trattati con il cocktail di fago (PAO1+ Φ). La media e l'SD riportati provengono rispettivamente da sei e quattro esperimenti, ciascuno con 25-40 embrioni. La trasformazione angolare è stata applicata alla percentuale di letalità e a un solo senso è stata utilizzata ANOVA seguita dal test di Duncan. La cifra viene ristampata a partireda 19. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Imaging dell'efficacia della terapia del fago nel pesce zebra. Progressione dell'infezione negli embrioni CF a seguito dell'iniezione di PAO1 (embrione superiore) ed efficacia della terapia del fago negli embrioni iniettati PAO1 + fagi (embrione inferiore) a 4, 9, 14 e 18 hpi. La barra di scala indica 100 micron. La cifra viene ristampata a partireda 19. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Espressione di citochine pro e antinfiammatorie dopo la somministrazione di PAO1 e PAO+phage. Livelli di espressione dei geni TNF-a (A) e IL-1β misurati da RT-qPCR a 8 hpi in embrioni CF iniettati con PAO1 e PAO1+Φ a 48 hpf e normalizzati usando l'espressione di rpl8. Vengono riportati la media e l'SD di quattro esperimenti. La significatività statistica è stata valutata da ANOVA seguita dal test di Duncan: per TNF- a (CF) vs (CF+PAO1) p = 0,015*; (CF) vs (CF+PAO1+Φ) p = 0,019*; (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,77 n.s.; per IL-1β (CF) vs (CF+PAO1) p = 0,00014***; (CF) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,00068***; (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,031*. La cifra viene ristampata a partireda 19. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Soluzioni | Preparazione |
| Soluzione di stock anestetico 25X | 4 mg/mL di Tricaina in H2O distillato. |
| Soluzione di lavoro anestetico 1X | diluire in H2O distillato la soluzione di stock di Tricaine preparazione 25X per raggiungere la concentrazione 1X (0,16 mg/mL) Tricaine di H2O distillato. |
| CsCl d=1,3 | 20,49 g in 50 mL TN |
| CsCl d=1,4 | 20,28 g in 50 mL TN |
| CsCl d=1,5 | 34,13 g in 50 mL TN |
| CsCl d=1,6 | 41,2 g in 50 mL di TN |
| Mezzo embrione E3 per embrione zebrafish | 1 L 1 di E3 (diluire lo stock 50X con H2O distillato) + 200 μl di 0,05% blu metile . Negozio presso RT. |
| Soluzione embrionale a medio stock E3 (50X) | 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl , 9,15 g CaCl2 e 9,95 g MgSO4 in 5 L di H2O. Distillato Negozio presso RT. |
| Agar LB | 10 g/L di triptono, 5 g/L estratto di lievito, 5 g/L NaCl, 10 g/L di agar |
| Brodo LB | per 1L: 950 mL H2O, 10 g Triptono, 10 g NaCl, 5 g Estratto di lievito |
| Pbst | PBS 1X + Tritone X 1% |
| Soluzione fisiologica | 0,9% NaCl |
| Soluzione di blocco del materiale di blocco della pigmentazione 10X | 0,3 mg/mL di tiourea fenile (PTU) in polvere nel mezzo embrionale E3 per l'embrione zebrafish |
| Soluzione stock Pronase 5X | 5 mg/mL di pronasi in polvere in embrione E3 per embrione zebrafish |
| Buffer TN | 10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl |
Tabella 1: Preparazione delle soluzioni.
| Nome genico | Sequenza primer |
| TNF-alfa Fw | 5'-TGCTTCACGCTCCATAAGACC-3' |
| TNFalpha Rev | 5'-CAAGCCACCTGAAGAAAGG-3' |
| IL1-beta Fw | 5'-TGGACTTCGCAGCACACAAAATG-3' |
| IL1-beta Rev | 5'-CGTTCACTTCACGCTCTTGGATG-3' |
| rpl8 Fw | 5'-CTCCGTCTTCAAAGCCCAT-3' |
| rpl8 Rev | 5'-TCCTTCACGATCCCCTTGAT-3' |
Tabella 2: Primer utilizzati per RT-qPCR.
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Discussion
In questo manoscritto, abbiamo descritto il protocollo per eseguire l'infezione da P. aeruginosa (PAO1) negli embrioni di zebrafish e come applicare la terapia del fago con un cocktail di fagi precedentemente identificati come in grado di infettare PAO1 per risolverlo. L'uso di batteriofagi come alternativa ai trattamenti antibiotici è stato di crescente interesse dagli ultimi anni. Ciò è dovuto principalmente alla diffusione di infezioni batteriche multi-resistenti ai farmaci (MDR), che costituiscono un grave problema per la salute pubblica. Naturalmente, l'ambito di questo lavoro è limitato all'applicazione della terapia del fago a un modello animale e non all'uomo. Tuttavia, abbiamo generato un modello di zebrafish della fibrosi cistica con l'iniezione di un morfolino mirato al gene cftr, dimostrando l'efficacia della terapia del fago anche in un modello patogenetico particolarmente suscettibile all'infezione da P.aeruginosa.
È da notare che potremmo facilmente ottenere la terapia del fago, poiché in un lavoro precedente, abbiamo isolato e caratterizzato diversi fagi in grado di infettare P. aeruginosa sia in vitro che in vivo8. Questo passaggio è fondamentale per ottenere l'attività antimicrobica dei fagi. L'isolamento e la caratterizzazione dei fagi in grado di infettare uno specifico ceppo batterico sono passaggi critici dell'applicazione della terapia del fago. Infatti, per evitare effetti negativi dei fagi sull'ospite animale/umano, è necessario utilizzare fagi litici invece di quelli lisogenici. Ancora più importante, è necessario controllare i genomi del fago per la presenza di geni dannosi come quelli per la resistenza agli antibiotici, la virulenza e il trasferimento genico.
La terapia del fago è già stata utilizzata con successo in altri modelli animali. Siamo consapevoli che il pesce zebra non è un modello di mammifero e alcuni effetti dei fagi potrebbero essere diversi. Tuttavia, poiché i pesci zebra possiedono un sistema immunitario innato paragonabile a quello umano con una popolazione conservata di neutrofili e macrofagi23, speculiamo che i dati sulla risposta immunitaria potrebbero essere riproducibili nell'uomo. Inoltre, il pesce zebra è ben valutato per gli studi sulle infezioni batteriche, il suo uso come tester per l'efficacia della terapia del fago potrebbe essere promettente per gli approcci terapeutici. Infatti, l'infezione può essere sistemica se i batteri vengono iniettati nella circolazione attraverso il condotto di Cuvier, o localizzati comeriportato 17. Abbiamo eseguito infezioni sistemiche e localizzate e dimostrato che hanno generato in modo simile una maggiore letalità e un carico batterico che sono stati entrambi diminuiti a seguito dell'applicazione della terapia del fago. Inoltre, poiché i batteri GFP+ FLUORESCENT PAO1 sono stati iniettati, è stato facile seguire l'infezione in diversi punti di sviluppo dell'embrione confermando la riduzione dei batteri fluorescenti quando i fagi sono stati iniettati.
Per quanto ne so, questa è la prima descrizione dell'applicazione della terapia del fago nel pesce zebra, con il valore aggiunto per la dimostrazione dell'attività antimicrobica dei fagi contro P. aeruginosa in un contesto CF, che è particolarmente suscettibile a questa infezione batterica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione Italiana Fibrosi Cistica (FFC#22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo e FFC#23/2019; Un respiro in più Onlus La Mano tesa Onlus).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
References
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