Apresentado é um protocolo para fabricar um dispositivo baseado em papel para o enriquecimento efetivo e isolamento de microvesículos e exosóis.
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Artigo de método
Pré-concentração baseada em papel e isolamento de microvesículos e exosóis
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Microvesículos e exosóis são pequenas vesículas membranous liberadas para o ambiente extracelular e circuladas por todo o corpo. Por conterem várias biomoléculas derivadas de células parentais, como DNA, mRNA, miRNA, proteínas e lipídios, seu enriquecimento e isolamento são passos críticos para sua exploração como potenciais biomarcadores para aplicações clínicas. No entanto, métodos convencionais de isolamento (por exemplo, ultracentrifugação) causam perdas e danos significativos a microvesculas e exosóis. Esses métodos também requerem múltiplas etapas repetitivas de ultracentrifugação, carregamento e desolação de reagentes. Este artigo descreve um método detalhado para fabricar um dispositivo baseado em papel origami (Exo-PAD) projetado para o enriquecimento efetivo e isolamento de microvesículos e exosóis de forma simples. O design único do Exo-PAD, composto por camadas multi-dobradas semelhantes a acordeões com áreas de amostra convergentes, é integrado à técnica de polarização da concentração de íons, permitindo assim o enriquecimento de cinco vezes dos microvesículos e exosóis em camadas específicas. Além disso, os microvesículos enriquecidos e exosóis são isolados simplesmente desdobrando o Exo-PAD.
Introdução
Microvesículos e exosóis são pequenas vesículas de membrana medindo 0,2−1 μm e 30-200 nm, respectivamente. Eles são secretados no ambiente extracelular por vários tipos diferentes de células1,,2,,3,,4,5. Eles contêm informações de células parentais na forma de subconjuntos de DNA, mRNA, miRNA, proteínas e lipídios, e circulam por todo o corpo através de vários fluidos corporais, como soro, plasma, urina, fluido cefalorraquidiano, fluido amniótico e saliva6,,
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Protocolo
1. Fabricação de dispositivos
- Defina a região a ser impressa em papel usando software de impressora(Tabela de Materiais).
NOTA: O desenho possui 12 camadas padrão de cera nas quais os diâmetros das áreas de amostra circular gradualmente diminuem de 5 mm a 2 mm(Figura 1A). - Imprima cera hidrofóbica nas regiões designadas em ambos os lados do papel de celulose(Tabela de Materiais)utilizando uma impressora de cera comercial(Tabela de Materiais)(Figura 1B).
- Coloque o papel impresso em cera em um forno de laboratório para 80 s a 120....
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Resultados
O tempo de operação deve ser otimizado para alcançar o rendimento máximo de recuperação dos microvesículos enriquecidos e exosóis. O tempo insuficiente não permite migração suficiente dos microvesículos e exosóis, o que diminui o enriquecimento, enquanto o tempo excessivo deteriora o foco espacial e, portanto, dispersa os microvesículos e exosóis. Assim, através da etapa de otimização do tempo, pode ser identificado o fator máximo de pré-concentração de microvesículos e exosóis e o local final onde microvesículos e exosó.......
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Discussão
Embora o Exo-PAD tenha sido utilizado com sucesso para o enriquecimento e isolamento de microvesculas e exosóis, vários pontos críticos devem ser cuidadosamente considerados: 1) o tempo de incubação do forno e a temperatura durante a preparação do dispositivo, 2) tempo de processamento, 3) aplicação de tensão com números de camadas variados e diâmetros da área da amostra, e 4) aplicabilidade às amostras clínicas.
O tempo de incubação e a temperatura dado no protocolo são condições otimizadas p.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee foi apoiado por uma bolsa de pesquisa da Universidade Kwangwoon em 2019. Hyerin Kim foi apoiada pelo "Programa de Desenvolvimento de Competências para Especialistas da Indústria" do Ministério do Comércio, Indústria e Energia da Coreia (MOTIE), operado pelo Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (No. P0002397, programa HRD para Convergência Industrial de Dispositivos Inteligentes Vestíveis).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Eletrodos Ag/AgCl | A-M Systems, Inc. | 531500 | Albumina de 0,15" de diâmetro |
| de soro bovino (BSA), conjugado Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA conjugado com Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
| Tampão carbonato-bicarbonato | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Tampão de carbonato |
| Software CorelDraw (Coral Co., Canadá) | Corel Corporation | para definir impressão em cera região | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Impressora de cera | |
| Papel de cromatografia grau 1 | Whatman | 3001-861 | Papel de celulose, dimensão: 20 * 20 cm |
| Padrões de exossomos marcados com fluorescência | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Exossomo marcado com FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 medidor de fonte de corrente/tensão | Keithley Instruments, Inc. | Atual– sistema de medição de fonte de tensão | |
| Solução de resina perfluorada Nafion | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Membrana permselectiva, 20% em peso na mistura de álcoois alifáticos inferiores e água; contém 34% de água |
| Tecnologia NanoSight LM10 | NanoSight Máquina | de análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
Referências
- Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
- Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 ....
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Reimpressões e permissões
