Summary
Apresentado aqui é um protocolo para a determinação do estado oligomerico de proteínas de membrana que utiliza um sistema de nanopartículas de membrana celular nativa em conjunto com microscopia eletrônica.
Abstract
As interações proteína-proteína nos sistemas de membrana celular desempenham papéis cruciais em uma ampla gama de processos biológicos, desde interações célula-célula até transdução de sinais; desde a detecção de sinais ambientais até a resposta biológica; da regulação metabólica ao controle do desenvolvimento. Informações estruturais precisas das interações proteína-proteína são cruciais para a compreensão dos mecanismos moleculares dos complexos proteicos de membrana e para o desenho de moléculas altamente específicas para modular essas proteínas. Muitas abordagens in vivo e in vitro foram desenvolvidas para a detecção e análise de interações proteína-proteína. Entre eles, a abordagem da biologia estrutural é única na prática de fornecer informações estruturais diretas de interações proteína-proteína no nível atômico. No entanto, a biologia estrutural da proteína da membrana atual ainda está em grande parte limitada a métodos à base de detergente. A principal desvantagem dos métodos à base de detergente é que eles frequentemente dissociam ou desnaturam complexos proteicos de membrana de desnatura uma vez que seu ambiente de bicamadas lipídicas nativas é removido por moléculas de detergente. Estamos desenvolvendo um sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para biologia estrutural de proteína de membrana. Aqui, demonstramos o uso desse sistema na análise de interações proteína-proteína na membrana celular com estudo de caso do estado oligomerico da AcrB.
Introduction
As interações proteína-proteína (PPI) desempenham papéis fundamentais ao longo da biologia, desde a manutenção da estrutura e função das proteínas até a regulação de sistemas inteiros. Os PPIs vêm de muitas formas diferentes e podem ser categorizados com base em que tipos de interações formam. Uma dessas categorizações é homooligomerica ou heterooligomerica, baseada em se as interações são entre subunidades idênticas ou proteínas diferentes agindo como subunidades. Outra categorização baseia-se na força da interação se as interações levarem à formação de complexos estáveis ou estados complexos transitórios. Informações estruturais sobre os PPIs entre proteínas são cruciais na compreensão do mecanismo pelo qual as proteínas exercem sua função. Estima-se que mais de 80% das proteínas dependem de formação complexa para exercer suas funções funcionais1. Dado que a porcentagem de proteínas observadas para depender de PPIs para o bom funcionamento inato seu significado na biologia é facilmente aparente, mas ser capaz de investigar adequadamente as proteínas que se envolvem nessas interações tem permanecido desafiador devido a limitações nas técnicas disponíveis para observar experimentalmente quando as proteínas estão formando PPIs.
Há um alto grau de discordância entre os resultados de muitos PPIs experimentalmente determinados devido à alta quantidade de ruídos, falsos positivos e falsos negativos que são derivados de muitas das técnicas de determinação do PPI atualmente disponíveis. Isto é particularmente para o sistema de leveduras dois híbridos (Y2H), espectrometria tandem affinity purificação-massa (TAP-MS) e transferência de energia de ressonância fluorescência (FRET), que representam três dos métodos mais utilizados para a determinação do PPI2,3,4,5,6,7. Em comparação, técnicas de biologia estrutural proteica, como ressonância magnética nuclear (RMN), cristalografia de raios-X e microscopia eletrônica (EM), podem ser usadas para obter informações estruturais de alta resolução sobre interações proteína-proteína até o nível atômico e permitir a confirmação visual direta das interações ocorridas para uma proteína alvo de interesse. Todas as técnicas de pesquisa de determinação de PPI não estruturadas atualmente disponíveis (por exemplo, Y2H, TAP-MS e FRET) não têm essa capacidade e, além disso, sofrem com dificuldade em identificar interações fracas e transitórias entre as proteínas5. Essas deficiências são ainda mais aprimoradas ao estudar proteínas de membrana devido à complexidade adicional trazida pela variável adicional do ambiente lipídico que influencia a formação de estrutura quaternária adequada e montagem complexa heteromica.
As proteínas da membrana compõem uma grande parte do proteome e são conhecidas por desempenhar muitos papéis cruciais no bom funcionamento celular dentro de todos os organismos vivos. Apesar de as proteínas de membrana serem estimadas em 27% do genoma humano e constituir ~60% de todos os alvos atuais de medicamentos, há uma anomalia importante no número de modelos resolvidos para proteínas de membrana que compõem apenas ~2,2% de todas as estruturas proteicas publicadas8,9,10. A principal causa da discrepância na disponibilidade de informações estruturais está nas propriedades intrínsecas das próprias proteínas de membrana. Devido à sua baixa solubilidade, dependência de interações com um ambiente lipídico para manter a estrutura e a função nativas, e várias propriedades físico-químicas da própria membrana lipídica, as proteínas da membrana continuam a representar um problema substancial ao implementar técnicas de biologia estrutural para estudá-las. Dessas propriedades intrínsecas, a mais importante para obter informações estruturais precisas é a exigência de ter interações com seu ambiente lipídico natural para que eles mantenham sua estrutura e função nativas. O ambiente lipídico é uma parte tão integral da estrutura e função das proteínas de membrana que o conceito de memteina (uma combinação das palavras membrana e proteína) tem sido proposto como a unidade fundamental da estrutura e função membrana-proteína11. Apesar da importância das interações lipídica-proteínas, as técnicas de determinação do PPI atualmente disponíveis na estrutura exigem que as proteínas que estão sendo estudadas sejam solúveis ou solubilizadas com detergentes. A exposição a detergentes severos pode desnaturar as proteínas ou causar falsos positivos e negativos devido à delipidação, que pode induzir agregação, desnaturação de proteínas, dissociação de interações não covalentes e formação de estados oligomeóricos artificiais. Devido à necessidade de manter um ambiente lipídico natural para determinação precisa do estado oligomerico nativo das proteínas da membrana, desenvolvemos um sistema de nanopartículas de membrana celular nativa (NCMNs)12 com base no método Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13.
O SMALP usa copolímero de ácido estireno macho como polímero ativo de membrana para extrair e solubilizar proteínas de membrana. Poly (Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) é um polímero anfílico único devido à sua moiety hidrofóbica e diametralmente oposta moiety ácido hidrofílico masculino. Ele forma nanopartículas por adsorviar, desestabilizar e interromper a membrana celular em um mecanismo dependente de pH14. Esta atividade funcional de SMA é o que permite que ela seja utilizada como um sistema livre de detergente para extração e solubilização de proteínas de membrana. O sistema NCMN é distinto do sistema SMALP em vários aspectos. A característica mais única do sistema NCMN é que ele possui uma biblioteca de polímeros ativos de membrana com uma infinidade de polímeros que têm propriedades únicas que os tornam adequados para o isolamento de muitas proteínas de membrana diferentes que requerem condições diferentes para estabilidade e funcionamento nativo. O sistema NCMN também tem protocolos diferentes em comparação com o método SMALP quando se trata de preparar as nanopartículas. Um exemplo é que os NCMNs utilizam uma purificação de coluna de afinidade de níquel de um passo único para determinação da estrutura de alta resolução; o efeito desses diferentes protocolos pode ser observado ao comparar o protocolo NCMNs, que gerou estruturas AcrB 3.2 e 3.0 Å crio-EM, com estudo semelhante utilizando o método SMALP, que resultou em uma estrutura crio-EM AcrB em uma resolução12,15. Essas características únicas do sistema NCMN são as melhorias feitas no método SMALP previamente estabelecido e o tornam um candidato ideal para o estudo de PPIs.
O transporte multidroug efflux AcrB existe como homotrimer funcional em E. coli12. Uma análise mutagênica sugeriu que uma única mutação de ponto P223G, localizada em um loop responsável pela estabilidade do aparador AcrB, desestabiliza o estado do aparador e produz um monômero AcrB quando preparado com o detergente DDM, que poderia ser detectado com eletroforese de gel azul nativo16. No entanto, a análise FRET do mutante AcrB-P223G sugeriu que quando no ambiente de bicamadas lipídicas da membrana celular nativa, a maioria dos mutantes AcrB-P223G ainda existiam como um aparador e que os níveis de expressão tanto para o tipo selvagem AcrB quanto para AcrB-P223G são semelhantes. No entanto, apesar dos resultados da análise do FRET, um ensaio de atividade para o transportador mutante mostrou que a atividade diminuiu drasticamente quando comparada com o tipo selvagem16. Embora a tecnologia FRET tenha sido popularmente utilizada para a análise de interações proteína-proteína, pesquisas têm mostrado que ela pode frequentemente dar falsos positivos17,18,19,20.
Recentemente, foram determinadas estruturas crio-EM de alta resolução do aparador AcrB que mostraram a interação da AcrB com sua bicamada lipídica de membrana celular nativa associada através do uso das NCMNs12. Em princípio, os NCMNs podem ser facilmente utilizados para a análise de interações proteína-proteína encontradas na membrana celular nativa. Em um teste deste sistema, foram realizados experimentos para observar diretamente o estado oligomerico de AcrB-P223G com o uso de nanopartículas de membrana celular nativa e microscopia eletrônica de coloração negativa. Para comparar com as nanopartículas AcrB do tipo selvagem, utilizamos a mesma membrana polímera ativa (SMA2000 fabricada em nosso laboratório, que é indexada como NCMNP1-1 na biblioteca NCMN) usada para determinação de estrutura crio-EM de alta resolução de AcrB e polímeros alternativos encontrados na biblioteca NCMNs12. Com base nos resultados relatados anteriormente, esperava-se que a maioria do mutante AcrB-P223G existisse na forma de nanopartículas de membrana celular nativa trimeric21. No entanto, não foram encontrados aparadores AcrB presentes na amostra, como os observados com o tipo selvagem AcrB. Isso sugere que a maioria do AcrB-P223G não forma aparadores na membrana celular nativa como sugerido anteriormente.
Aqui relatamos uma análise detalhada do mutante E. coli AcrB-P223G em comparação com o tipo selvagem E. coli AcrB usando as NCMNs. Este estudo de caso da AcrB sugere que as NCMNs são um bom sistema para análise de interação proteína-proteína.
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Protocol
1. Expressão proteica
- Inocular 15 mL de mídia de caldo fantástico (TB) com antibióticos específicos para plasmídeos com células pLysS BL21(DE3) contendo o AcrB expressando plasmídeos em tubos de 50 mL durante a noite a 37 °C com agitação a 250 rpm.
- Verifique a densidade óptica da cultura overnight em 600 nm (OD600) e certifique-se de que ela tenha mais de 2,0.
- Diluir 5 mL de cultura celular em 1 L de mídia de TB contendo antibióticos específicos para plasmídeos e incubar a 37 °C com agitação até OD600=0,8 e, em seguida, induzir com IPTG que tem uma concentração final de 1 mM.
- Realizar indução a 20 °C com agitação por 20 h.
- Pelota para baixo das células usando centrifugação por 15 minutos a 4 °C e 4.000 x g.
2. Lise celular e isolamento da membrana
- Resuspenda a pelota de célula no Buffer A (Tabela 1, use buffer DDM A ou NCMNs Buffer A, dependendo do esquema de purificação a seguir) usando 80 mL para cada 20 g da pelota celular.
- Homogeneize as pelotas de células resuspended usando um homogeneizador do Dounce de vidro a 4 °C ou se à temperatura ambiente certifique-se de colocar no gelo imediatamente depois.
- Transfira a amostra para um béquer metálico no gelo e lise as células carregando-as em um homogeneizador de alta pressão a 4 °C e 1.500 bar.
- Repita o processo de carregar as células no homogeneizador e permitindo que elas passem pelo homogeneizador por 3-4 ciclos ou até que o lise comece a esclarecer.
- Centrifugar o lysate a 15.000 x g para 30 min a 4 °C.
- Colete o supernatante e carregue em tubos ultracentrífugas e centrífuga a 215.000 x g por 1 h a 4 °C.
- Descarte o supernatante e colete as pelotas de membrana dos tubos ultracentrífugas. Armazene qualquer excesso de pelota de membrana a -80 °C.
3. Preparação de nanopartículas de membrana celular nativa
- Resuspend 1 g de pelota de membrana em 10 mL NCMNs Buffer A (Tabela 1).
- Homogeneize a amostra de membrana celular resuspended com um homogeneizador do Dounce de vidro a 20 °C.
- Transfira a amostra de membrana suspensa para um tubo de polipropileno de 50 mL e adicione a solução de estoque de polímeros ativos de membrana e nCMNs buffer A adicional para levar a amostra a uma concentração final de polímero ativo de membrana de 2,5% (w/v) (NCMNP1-1 ou NCMNP5-2).
NOTA: As soluções de estoque de polímeros ativos de membrana devem ser feitas em água dupla destilada e podem ser mantidas em concentrações variadas, mas tipicamente 10% (w/v). - Agite a amostra por 2h a 20 °C.
- Carregue a amostra em uma ultracentrifuagem e gire a 150.000 x g por 1 h a 20 °C.
- Enquanto a amostra está sendo ultra-centrífugas começam a equilibrar uma coluna Ni-NTA de 5 mL com 25 mL de NCMNs Buffer A.
- Colete o supernatante após a ultracentrifugação estiver completa e carregue-o em 5 mL de coluna Ni-NTA à temperatura ambiente com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min usando uma bomba de seringa.
- Lave linhas de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) com o suficiente NCMNs Buffer B(Tabela 1) para lavar completamente o sistema e, em seguida, conectar a coluna à máquina FPLC.
- Lave a coluna com 30 mL de NCMNs Buffer B com uma taxa de fluxo de 1 mL/min e colete o fluxo através.
- Lave a coluna com 30 mL de NCMNs Buffer C(Tabela 1) com uma taxa de fluxo de 1 mL/min e colete o fluxo através.
- Elute a proteína com 20 mL de NCMNs Buffer D(Tabela 1) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min e colete a amostra usando um coletor de frações e as frações cada uma sendo definidas para 1,0 mL.
- Armazene as amostras de proteína a 4 °C.
- Execute um ensaio de eletroforese de gel SDS-PAGE para verificar as amostras que correspondem aos picos observados no gráfico de eluição FPLC.
4. Eletroforese de gel SDS-PAGE
- Prepare a câmara de fundição fixando o vidro no aparelho de fundição.
- Prepare o gel de separação de 12% de acordo com a receita listada na Tabela 1.
NOTA: Uma vez que temed é adicionado o gel irá polimerizar rapidamente, por isso só adicione esta uma vez pronta para derramar o gel. - Despeje o gel, deixando 2 cm abaixo da parte inferior do pente para o gel de empilhamento.
- Remova as bolhas colocando a parte superior do gel com isopropanol 100% e espere o gel de separação polimerizar.
- Remova o isopropanol e lave os traços do isopropanol com água destilada.
- Prepare o gel de empilhamento de acordo com a receita listada na Tabela 1.
NOTA: Uma vez que temed é adicionado o gel irá polimerizar rapidamente, por isso só adicione esta uma vez pronta para derramar o gel. - Despeje o gel de empilhamento em cima do gel de separação.
- Adicione um pente à câmara para formar os poços e espere que o gel de empilhamento polimerize completamente.
- Coloque 1 μL de 1 M DTT em um tubo de microcentrífuga para cada amostra de fração que precisa ser executada no gel.
- Adicione 7 μL de 4x tampão de carga a cada tubo também.
- Adicione 20 μL de amostra das frações que precisam ser executadas no gel a cada tubo de microcentrifuuagem.
- Vórtice os tubos contendo as amostras.
- Gire os tubos de amostra usando um microcentrifuuge de mesa para 3 s e certifique-se de que toda a amostra tenha retornado ao fundo dos tubos.
- Prepare a célula de eletroforese de gel, fixando um de gel de poliacrilamida de 12% no lugar e preenchendo as câmaras internas e externas da célula com Tampão Tris-acetato-EDTA (TAE)(Tabela 1).
- Coloque o marcador de peso molecular na primeira faixa do gel com o volume apropriado exigido por suas instruções.
- Carregue 28 μL da amostra de cada tubo misturado com DTT e tampão de carga.
- Coloque a tampa da célula de eletroforese em cima da caixa e conecte a tampa na fonte de alimentação.
- Ligue a fonte de alimentação e coloque-a em 100 V e deixe-a funcionar por 20 minutos.
- Depois de 20 minutos, aumente a corrente de alimentação para 140 V e continue a executá-la por mais 30-40 minutos ou até que a faixa de corante tampão de carga atinja a parte inferior do de gel.
- Após completar a mancha de eletroforese e desfoca o gel para visualizar as faixas proteicas contidas dentro do gel.
5. Purificação de proteínas usando DDM
NOTA: O objetivo de realizar este processo de purificação é servir como um controle para os experimentos que utilizam os polímeros ativos da membrana.
- Resuspend 6-10 g de pelota de membrana, a partir da etapa 2.6, em DDM Buffer A (Tabela 1) utilizando 5 mL/g de pelota de membrana.
- Homogeneize a amostra resuspended com um homogeneizador do Dounce de vidro a 4 °C ou se à temperatura ambiente certifique-se de colocar gelo imediatamente depois.
- Transfira a amostra para um tubo de polipropileno de 50 mL e adicione DDM e buffer DDM adicional A para levar a amostra a uma concentração final de 2% DDM.
- Agite a amostra por 2h a 4 °C.
- Carregue a amostra em tubos ultracentrífugas e centrífuga por 1h a 4 °C e 150.000 x g.
- Enquanto a amostra está sendo ultra-centrífugas começam a preparar os 5 mL da coluna Ni-NTA lavando com 25 mL de Buffer DDM A (Tabela 1).
- Depois que a ultracentrifugação estiver completa, colete o supernatante e carregue-o na coluna Ni-NTA de 5 mL a 4 °C com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min usando uma bomba de seringa.
- Lave as linhas FPLC com buffer DDM suficiente B + 0,05% DDM(Tabela 1) para lavar completamente o sistema e, em seguida, anexar a coluna à máquina FPLC.
- Lave a coluna com 30 mL de DDM Buffer B + DDM 0,05% DDM com uma vazão de 1 mL/min e colete o fluxo através.
- Lave a coluna com 30 mL de DDM Buffer C + 0,05% DDM(Tabela 1) com uma taxa de fluxo de 1 mL/min e colete o fluxo através.
- Elute a proteína com 20 mL de DDM Buffer D + 0,05% DDM(Tabela 1) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min e colete o fluxo através de um coletor de frações e as frações cada uma sendo definidas para 1,0 mL.
- Selecione as frações que contêm o pico de elução para agrupamento e concentração usando um concentrador centrífugo e centrifugação a 4.000 x g e 4 °C até atingir 500 μL.
- Usando um loop de 500 μL, carregue a amostra na máquina FPLC e, em seguida, na coluna de exclusão de tamanho de 25 mL a 4 °C. Elute utilizando 30 mL de Buffer DDM E + 0,05% DDM(Tabela 1) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min e coletar como frações com os tamanhos de fração definidos para ser 0,5 mL por fração.
- Pegue as frações e meça a concentração proteica usando absorvância de 280 nm para confirmar a curva UV-Vis do gráfico de eluição FPLC.
- Colete 20 μL de cada fração amostral que corresponda aos picos observados no gráfico de eluição fplc e foi confirmado ser preciso com o teste de absortância.
- Congele o restante dessas frações amostrais usando nitrogênio líquido ou gelo seco em alíquotas desejadas e armazene amostras de proteínas a -80 °C.
- Execute um ensaio de eletroforese de gel SDS-PAGE como descrito anteriormente para verificar as amostras que correspondem aos picos observados no gráfico de eluição FPLC.
6. Preparação negativa da grade de manchas
- Coloque as grades que serão usadas para a preparação da amostra em um slide de vidro envolto em papel filtro com o lado carbono voltado para cima.
- Coloque o deslizamento de vidro com as redes de microscópio eletrônico na câmara de um descarregador de brilho entre os dois eletrodos e substitua a tampa de vidro certificando-se de que está centrada e bem selada.
- Execute a máquina de descarregamento de brilho e certifique-se de que a luz roxa gerada pelo plasma esteja visível.
- Quando a máquina terminar de funcionar, espere até que a câmara tenha atingido a pressão atmosférica para remover a tampa de vidro e, em seguida, retornar o slide com as grades para o banco onde as amostras serão carregadas sobre eles.
- Ajuste a concentração das amostras de proteínas purificadas para cerca de 0,1 mg/mL diluindo a amostra com o buffer apropriado ou concentrando-se usando um concentrador centrífuga.
- Carregue 3,5 μL de amostra de proteína na rede de carbono de 10 nm de espessura e espere por 1 min.
- Remova o líquido da superfície da rede EM com um papel filtro.
- Lave a superfície da rede 3x pegando gotículas de 3 μL de água com a rede e removendo a água da rede com papel filtro entre a coleta de cada gota.
- Lave a superfície da rede 2x pegando gotículas de 3 μL de acetato de urânio fresco e filtrado de 2% e remova as soluções de lavagem na rede com papel filtro entre a captação de cada gota.
- Manche a rede com uma gota de 3 μL de acetato de urânio fresco e filtrado de 2% por 1 min.
- Remova a solução de acetato de urânio na superfície da rede EM com papel filtro e o ar seque a rede por pelo menos 1 min.
- Armazene a grade em uma caixa de grade para uso posterior.
7. Imagem EM
- Coloque a grade preparada no suporte da grade em uma bancada segura.
- Prepare o microscópio colocando os microscópios deguerr em uma caixa de poliestireno e encher o dewar 3/4 cheio de nitrogênio líquido.
- Confirme que a tampa de borracha da janela do microscópio está cobrindo-a e, em seguida, carregue o deguerr o microscópio colocando os fios de cobre na dewar até que ele se encaixe na plataforma.
- Encha o resto da de guerra com nitrogênio líquido e coloque uma tampa em cima da de guerra para cobri-la.
- Ligue a alta tensão, condiciona o microscópio e espere que o microscópio aqueça e estabeleça um nível de vácuo seguro para uso.
- Uma vez que o microscópio esteja pronto abra a válvula da coluna e confirme que o feixe está presente removendo a tampa de borracha na janela do microscópio.
- Verifique a estigma da viga espalhando-se para dentro e para fora ajustando a intensidade do feixe. Se o astigmatismo estiver presente, o feixe terá uma forma elíptica à medida que se afasta do cruzamento e o feixe deve ser a mesma forma oval em ambos os lados.
- Ajuste os binóculos do microscópio para ser a altura e distância certas de acordo com os olhos do observador.
- Verifique o posicionamento do feixe para os modos De Pesquisa, Focoe Exposição pedalando pelos três modos até que o feixe esteja central em cada um.
- Feche a válvula da coluna e prossiga para carregar o suporte da grade no microscópio eletrônico.
- Ajuste o microscópio à altura eucêntrica usando o recurso oscilador dos microscópios e ajustando o movimento do estágio usando o eixo Z até que não haja movimento lado a lado da amostra no centro.
- Usando o modo de pesquisa de baixa dose no microscópio procure na grade uma área desejável de contraste razoável com moléculas de amostra presentes para se concentrar na amostra.
- Concentre-se na amostra no modo Focus usando um tamanho de passo alto até que a amostra seja vista e, em seguida, diminua as etapas para encontrar o nível de foco correto.
- Zero e branco o feixe e, em seguida, certifique-se de que a almofada de borracha está cobrindo a janela do microscópio.
- Usando o modo Exposição, pegue a imagem da área de grade desejada para uma exposição de 1 s a uma ampliação de 62.000x e verifique a imagem obtida.
- Quando feito a imagem de uma grade feche as válvulas da coluna e remova o suporte da grade da coluna.
- Quando terminou a imagem todas as grades de juros desligam o microscópio desligando a energia do filamento e removendo o de guerra de nitrogênio líquido do microscópio.
- Coloque algo para absorver umidade no suporte onde o dewar sentou-se para pegar condensação das bobinas de cobre do microscópio.
- Ative o modo Ciclo Cryo e certifique-se de que a bomba turbo está desligada.
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Representative Results
Utilizando os procedimentos aqui apresentados, foram purificadas amostras do tipo selvagem E. coli AcrB e E. coli mutante AcrB-P223G. As amostras foram então adsorvidas a redes de microscopia eletrônica de manchas negativas de carbono e manchadas usando acetato de urano com o método de mancha lateral22. Imagens de manchas negativas foram coletadas por meio de microscopia eletrônica de transmissão. A imagem de mancha negativa para a amostra do tipo selvagem AcrB purificada com DDM revela uma solução homogênea de partículas monodispersadas com a proteína exibindo uma estrutura quartenária trimerica bem definida(Figura 1A). Estas estruturas trimericas correspondem ao cromatograma de exclusão de tamanho observado quando purificada(Figura Suplementar 1). Em comparação, ao olhar para a imagem da mancha negativa para o mutante AcrB-P223G, também purificado com DDM, pode-se observar uma solução heterogênea de nanopartículas polidisperadas com propensão à agregação, mas sem aparadores nativos observáveis(Figura 1B). Esses resultados também são apoiados pelo perfil de eluição observado na realização da cromatografia de exclusão de tamanho (Figura Suplementar 1). Para determinar se a falta de proteínas de estado trimérico para o mutante foi devido ao tratamento com detergente ou apenas causado pela mutação desestabilizadora do P223G, as proteínas também foram purificadas usando NCMNP1-1, um dos polímeros ativos da membrana dentro da biblioteca NCMNs. A imagem de mancha negativa para a amostra do tipo selvagem AcrB purificada com NCMNP1-1, novamente, revela uma solução homogênea de partículas monodispersadas com a proteína exibindo uma estrutura quartenária trimerica bem definida(Figura 1C). E assim como com a purificação do DDM, quando o mutante AcrB-P223G é purificado com NCMNP1-1 a imagem da mancha negativa mostra uma solução heterogênea de nanopartículas polidisperadas com propensão à agregação, mas sem aparadores nativos observáveis(Figura 1D). Para confirmar ainda mais que a mutação P223G interrompe o aparador AcrB na membrana celular, um polímero diferente (NCMNP5-2) foi selecionado da biblioteca de polímeros ativos de membrana NCMNs proprietária. NCMNP5-2 pode formar nanopartículas de membrana celular nativa em tamanhos muito maiores, permitindo assim que vários aparadores AcrB sejam imagens em uma única partícula de membrana celular nativa. Como resultado, observou-se que vários aparadores AcrB tipo selvagem estavam contidos em partículas únicas(Figura 1E); no entanto, não foram observadas partículas de acrB-P223G como as formadas por AcrB tipo selvagem, mesmo quando se observava as grandes manchas bicamadas de membrana celular nativa(Figura 1F). Isso sugere que o AcrB-P223G não existe como um aparador na membrana celular como sugerido anteriormente21 e oferece uma explicação lógica sobre por que a AcrB-P223G mostra um declínio dramático na atividade quando avaliado16. Para confirmar a pureza das amostras e a presença da proteína correta, os géis de eletroforese foram executados para todas as amostras de proteína purificadas. As manchas resultantes confirmaram a presença de AcrB em todas as amostras com pureza >95% e a localização da mancha correspondeu ao peso molecular previsto da AcrB (Figura 1G). Os resultados do nosso estudo são inconsistentes com o ensaio fret previamente descrito no que diz respeito à determinação do estado oligomerico da proteína da membrana AcrB-P223G16. Utilizando polímeros ativos de membrana e microscopia eletrônica como descrito no protocolo, o estado oligomerico nativo da proteína era diretamente observável. Uma determinação mais precisa de como os monômeros da proteína interagem entre si exigirá a determinação de estruturas crio-EM de alta resolução.
Figura 1: Imagens negativas de gel de manchas e eletroforese de construções purificadas de AcrB. (A) Imagem de mancha negativa tirada para acrB tipo selvagem purificada com DDM. (B) Imagem de mancha negativa tirada para o construto de proteína AcrB-P223G purificado com DDM. (C) Imagem de mancha negativa tirada para tipo selvagem AcrB purificada com NCMNP1-1. (D) Imagem de mancha negativa tirada para o construto AcrB-P223G purificado com NCMNP1-1. (E) Imagem de mancha negativa tirada para a AcrB tipo selvagem purificada com NCMNP5-2 (a caixa vermelha destaca algumas das nanopartículas do aparador observadas na imagem). (F) Imagem de mancha negativa tirada para AcrB-P223G purificada com NCMNP5-2 (a caixa verde destaca uma parte das manchas lipídicas capturadas por NCMNP5-2 observada na imagem). (G) O gel SDS-PAGE executa utilizando os produtos finais das purificações de AcrB-P223G com DDM (Lane 1), NCMNP1-1 (lane2), (H) SDS-PAGE gel executado utilizando os produtos finais das purificações de AcrB-P223G com NCMNP5-2. (I) Zoom das características destacadas da Figura 1E. (J) Zoom nas características destacadas de F. Todas as imagens de manchas negativas na Figura 1 têm a mesma barra de escala de 50 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Buffers de purificação DDM | Buffers de purificação de polímeros | Tampões de eletroforese de gel | |||
| Tampão A | 50 mM HEPES, pH 7.8 | NCMN Buffer A | 50 mM HEPES, pH 8.4 | Tampão TAE | Base Tris de 40 mM |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 1 mM EDTA | |||
| 5% de Glicerol | 5% de Glicerol | Ácido acético de 20 mM | |||
| 20 mM Imidazol | 20 mM Imidazol | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | ||||
| 0,1 mM TCEP | |||||
| Tampão B | 50 mM HEPES, pH 7.8 | Tampão NCMN B | 25 mM HEPES, pH 7.8 | Tampão de desestabilização | 40% metanol |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | Ácido acético de 10% | |||
| 5% de Glicerol | 5% de Glicerol | ||||
| 40 mM Imidazol | 40 mM Imidazol | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | ||||
| 0,1 mM TCEP | |||||
| Tampão C | 50 mM HEPES, pH 7.8 | Tampão NCMN C | 25 mM HEPES, pH 7.8 | Empilhamento de Gel | 1,5 M Tris pH 8.8 (0.63 ml) |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 30% Acrilamida/Bis (0,43 ml) | |||
| 5% de Glicerol | 5% de Glicerol | 10% SDS (0,025 ml) | |||
| 75 mM Imidazol | 75 mM Imidazol | 10% APS (0,025 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | TEMED (4 μl) | |||
| 0,1 mM TCEP | H2O (1,39 ml) | ||||
| Buffer D | 50 mM HEPES, pH 7.8 | NCMN Buffer D | 25 mM HEPES, pH 7.8 | 12% separando gel | 1,5 M Tris pH 8.8 (1.3 ml) |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 30% Acrilamida/Bis (2 ml) | |||
| 5% de Glicerol | 5% de Glicerol | 10% SDS (0,05 ml) | |||
| 300 mM Imidazol | 300 mM Imidazol | 10% APS (0,05 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | TEMED (5 μl) | |||
| 0,1 mM TCEP | H2O (1,6 ml) | ||||
| Buffer E | 40 mM HEPES, pH 7.8 | NCMN Buffer E | 40 mM HEPES, pH 7.8 | ||
| 200 mM NaCl | 200 mM NaCl | ||||
| 0,1 mM TCEP | 0,1 mM TCEP | ||||
Tabela 1: Lista de tampões de purificação utilizados para cromatografia de coluna e eletroforese de gel.
Figura suplementar 1: Perfis de elução de cromatografia de exclusão de tamanho. (A) Gráfico de sobreposição dos dois perfis de elução observados para os experimentos de cromatografia de exclusão de tamanho realizados ao purificar com DDM e tipo selvagem AcrB (laranja) e com DDM e o mutante AcrB-P223G (azul). (B) Perfil de calibração da coluna para a coluna de exclusão de tamanho utilizada para experimentos DDM.
1: Tiroroglobulina (Sr. 669 000), 2: Ferritin (Sr. 440 000), 3: Aldolase (Sr. 158 000), 4: Conalbumina (Sr. 75 000), 5: Ovalbumin (Sr. 44 000), 6: Anidrato carbônico (Sr. 29 000), 7: Ribonuclease A (Sr. 13 700). Clique aqui para baixar este número.
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Discussion
As interações proteína-proteína são importantes para a integridade da estrutura e função das proteínas da membrana. Muitas abordagens foram desenvolvidas para investigar interações proteína-proteína. Quando comparadas com proteínas solúveis, as proteínas de membrana e seus PPIs são mais difíceis de estudar devido às propriedades intrínsecas únicas das proteínas da membrana. Essa dificuldade vem principalmente da exigência de proteínas de membrana para serem incorporadas em um ambiente nativo de bicamadas lipídicas para estabilidade estrutural e funcionalidade. Isso se torna problemático porque, para determinar estruturas de alta resolução das proteínas, elas devem ser extraídas da membrana celular. O FRET tem sido uma tecnologia popular para investigar interações proteína-proteína na membrana celular, no entanto, a resolução é baixa e frequentemente produz falsos positivos17,18,19,20. Aqui é demonstrado, pela primeira vez, que os NCMNs podem ser usados para estudar interações proteína-proteína de membrana analisando estruturalmente o aparador AcrB tipo selvagem e o monômero AcrB-P223G na membrana celular nativa e comparando resultados com a análise anterior utilizando FRET. Comparando-se as imagens de partículas únicas de microscopia eletrônica do tipo selvagem AcrB e AcrB-P223G, sugere-se que a maioria dos AcrB-P223G não forma aparadores na membrana celular E.coli como a proteína AcrB tipo selvagem quando purificada usando polímeros ativos de membrana, como NCMNP1-1 e NCMNP5-2. Propomos aqui que os resultados da análise do FRET possam ser um falso positivo resultante da limitação de resolução da abordagem FRET. A ligação de dissulfeto artificial que estabilizou o aparador AcrB-P223G também pode ser um artefato que ocorreu na solução21. As imagens da mancha negativa sugerem que a mutação P223G impediu a formação do acrer AcrB e que a forma monomérica de AcrB não poderia permanecer na mesma conformação observada quando em sua forma trimerica. O loop que contém essa mutação mostrou-se anteriormente absolutamente crítico para a formação do aparador através da análise mutagênica e estrutural, que mostrou sua significância estrutural devido às interações que cada loop forma, enterrando no monômero AcrB vizinho23.
Utilizando o sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para detecção e análise de interação proteína-proteína, pode-se detectar diretamente o estado oligomerico de uma proteína mantendo a proteína da membrana em um ambiente de membrana celular verdadeiramente nativa, que pode ser usada para obter informações estruturais de alta resolução no nível atômico através da análise crio-EM de partículas únicas da amostra. O sistema NCMN ajuda a evitar os frequentes falsos positivos e falsos negativos observados na detecção de PPI causada pelo tratamento de amostras com detergentes24. Esses resultados falsos normalmente surgem, devido à agregação, desnaturação da amostra de proteína, dissociação de interações não covalentes e formação de estados oligomericos artificiais causados pelos efeitos de delipidação dos detergentes. Além disso, o uso da análise estrutural em conjunto com as NCMNs fornece informações estruturais adicionais e permite a observação direta das interações moleculares, que são críticas para a compreensão dos PPIs e tipicamente perdidas ao utilizar métodos previamente estabelecidos de detecção de PPI. Este método tem sido usado com sucesso para estudos estruturais do tipo selvagem AcrB e poderia ter ampla aplicabilidade a outras formas de análise estrutural, como cristalografia de raios-X e NMR de estado sólido, e muitas proteínas diferentes sendo usadas em outras pesquisas que buscam determinar as interações exibidas por novos alvos proteicos.
Para obter resultados reprodutíveis com rendimentos proteicos razoáveis de alta pureza, existem várias etapas críticas no processo de purificação com polímeros ativos de membrana que devem ser seguidos. O primeiro passo crítico é o processo de isolamento da membrana, por isso é fundamental centrifugar o lise celular a 15.000 x g e seguir esta etapa com ultracentrifugação a 215.000 x g, a fim de realmente isolar a membrana celular do resto do lysato celular. O próximo passo crítico é solubilizar a fração de membrana com polímeros ativos de membrana a uma concentração de 2,5% à temperatura ambiente por duas horas. Experimentos de otimização da purificação foram realizados e utilizando esses parâmetros nesta etapa foi demonstrado para garantir que a quantidade ideal de AcrB seja extraída da membrana e a formação adequada das nanopartículas de membrana celular nativa ocorra. A etapa crítica final do processo de purificação é carregar a amostra na coluna Ni-NTA à temperatura ambiente. Isso é necessário, pois os polímeros ativos da membrana são mais solúveis à temperatura ambiente do que a 4 °C, assim o carregamento à temperatura ambiente aumentará a quantidade de proteína que liga a coluna de afinidade e evitará alta pressão causada pelo acúmulo de polímeros insolúveis que poderia potencialmente danificar a coluna. Quase igualmente importante para a obtenção de informações estruturais precisas são as etapas contidas no procedimento de coloração negativa mencionado acima. Os aspectos mais críticos deste procedimento incluem o uso de redes de carbono furados de 10 nm de espessura, volumes de água e acetato deuranyl, e os comprimentos de tempo para adsorção e coloração de amostras. A utilização desses parâmetros-chave durante a preparação da amostra garantirá dados estruturais de qualidade que podem ser usados para uma avaliação precisa dos estados oligomericos da amostra que está sendo imageda. Modificações no protocolo de purificação podem ser necessárias ao usar diferentes proteínas para solucionar problemas que podem surgir devido às características únicas de vários polipeptídeos. Os principais fatores a considerar a modificação ao obter uma quantidade adequada de amostra de proteína devem ser os parâmetros utilizados durante a etapa de indução, a quantidade de fração de membrana utilizada na etapa de solubilização e o tempo e a temperatura para o processo de solubilização. Se houver um problema com a pureza, pode ser necessário utilizar colunas alternativas de afinidade, como uma coluna de afinidade de biotina, em vez de usar a coluna Ni-NTA para purificação. Da mesma forma, se for necessária a manutenção de interações proteína-proteína fraca/transitória, a troca da coluna Ni-NTA por uma coluna de afinidade TAP-tag é benéfica para os melhores resultados. Finalmente, ao estudar proteínas de mamíferos, os sistemas de expressão de mamíferos devem ser usados para manter verdadeiras composições lipídicas de membrana celular nativa necessárias para a determinação precisa do estado oligomérico natural da proteína. Isso exigirá a revisão completa das etapas de expressão proteica e lise celular deste protocolo. Nesses casos, devem ser seguidos protocolos previamente estabelecidos para expressão proteica e lise celular que correspondam ao sistema de expressão necessário para a proteína alvo de interesse.
O uso dos NCMNs com microscopia eletrônica apresenta grandes vantagens quando comparado ao FRET para uso na detecção de PPIs. Como mostram os resultados deste estudo, os experimentos fret realizados anteriormente foram inconsistentes com a análise estrutural da estrutura oligomerica da proteína mutante AcrB21. Isso foi claramente mostrado e confirmado diretamente pelas imagens tiradas com microscopia eletrônica de manchas negativas, que são consistentes com a perda de atividade descrita anteriormente para o mutante AcrB-P223G16. Se a AcrB-P223G formasse aparadores in vivo, o polímero NCMNP5-2 os teria capturado nas grandes manchas de membrana celular nativa que extrai. É possível que a análise fret da AcrB mutante resultou em um falso positivo devido a qualquer uma das diversas limitações intrínsecas aos processos físicos em que a técnica se baseia e à tecnologia utilizada para medir as transferências de energia de ressonância fluorescente. Uma das principais limitações da FRET são os limites de resolução da microscopia confocal e isso leva a sérias limitações nas distâncias intermoleculares capazes de serem resolvidas com ensaios FRET19. Em comparação, a utilização de NCMNs em conjunto com a microscopia eletrônica não está sujeita à limitação acima mencionada do FRET, com limites de resolução significativamente maiores quando comparados com os da microscopia confocal. Com base nessas limitações que têm efeitos potenciais sobre os ensaios fret descritos anteriormente, afirmamos que a detecção incorreta de um aparador AcrB-P223G in vivo resultou da baixa limitação de resolução do FRET21. Além das vantagens sobre apenas o FRET apontado diretamente por este artigo, o uso de NCMNs em conjunto com microscopia eletrônica tem a vantagem sobre todas as técnicas atuais de interação proteína-proteína, como o sistema Y2H e TAP-MS, na medida em que pode ser usado para observar interações proteína-proteína em ambientes de membrana celular nativa diretamente em alta resolução e tem o potencial de ser usado para determinar as estruturas proteicas no nível atômico.
Polímeros ativos de membrana e microscopia eletrônica não são sem limitações também. Atualmente, a principal questão da purificação do NCMN é sua menor eficiência de extração quando comparada com métodos à base de detergente (os polímeros na vitrine NCMN exibem ~70% da eficiência de extração do DDM). Também tem problemas de compatibilidade com algumas colunas de afinidade, como colunas de ligação maltosa. Além disso, a purificação do NCMN ainda não é muito bem sucedida com proteínas ou complexos de membrana altamente dinâmicos (dados inéditos). Utilizar polímeros ativos de membrana e microscopia eletrônica para experimentos de determinação de estado oligomerico requer a remoção das proteínas do ambiente celular nativo, enquanto o FRET é realizado in vivo. No entanto, as nanopartículas formadas por polímeros ativos de membrana permitem o ambiente mais nativo possível ao extrair as proteínas das células, reduzir as potenciais imprecisões derivadas experimentalmente conhecidas por serem causadas pela extração de proteínas e purificação. Além disso, embora a questão da resolução e do tamanho das partículas como limitação da microscopia eletrônica de transmissão tenha diminuído significativamente na última década, os microscópios que ainda estão sendo usados para análise de manchas negativas ainda serão relativamente limitados a moléculas maiores ou complexos moleculares (>200 kDa), pois geralmente têm um limite de informação de cerca de 0,1-0,3 nm25. O SMALP também mostrou-se altamente flexível em termos de aplicações, mas exibe limitações ainda maiores do que as NCMNs. Os nanodiscos formados pela SMA têm um diâmetro máximo de aproximadamente 15 nm e, portanto, são comumente ineficazes para a extração de proteínas e complexos proteicos que tenham mais de 400 kDa26. Além dessa limitação, a SMA também é incapaz de trabalhar com proteínas que existem em ambientes de pH baixos ou utilizar íons divalentos para fins estruturais e funcionais. Devido ao mecanismo de ação SMALPs ser dependente de pH, não pode ser usado com baixas condições de pH e íons divalentos de quimio. Embora os métodos SMILP e DIBMA tenham oferecido promessas em relação à superação dessas limitações, sua aplicabilidade a proteínas de conjuntos diversos permaneceu invisível27,28. Os NCMNs buscam superar essas limitações usando a análise de relacionamento estrutura-atividade (SAR) para criar polímeros alternativos que possam formar nanopartículas maiores, funcionando em baixas condições de pH e evitar íons divalentos quelantes. Um exemplo desses polímeros que foram desenvolvidos para NCMNs é o polímero NCMNP5-2 que exibe a capacidade de criar nanopartículas maiores como demonstrado na Figura 1E,F.
Além dos avanços descritos anteriormente na tecnologia de nanopartículas, a direção futura das NCMNs está no desenvolvimento de polímeros ativos de membrana que darão à biblioteca de polímeros NCMNs maior eficiência de extração e a capacidade de trabalhar com proteínas de todos os diferentes tamanhos da região transmembrana, que funcionam em níveis de pH muito mais amplos, ou dependem de qualquer tipo de íon para manutenção de sua estrutura e função. Isso permitirá que todos os pesquisadores de proteínas de membrana utilizem essa tecnologia em seus experimentos e tenham acesso a resultados mais precisos e biologicamente relevantes. Ao trazer as vantagens das nanopartículas de polímero para uma variedade mais ampla de proteínas, a esperança é que isso leve à resolução de estruturas de alta resolução de complexos proteicos de membrana nativa no nível atômico e, assim, determinar as interações atômicas intramoleculares que vão para a manutenção desses complexos. Tais avanços também permitiriam muitas novas possibilidades em termos de descoberta e desenvolvimento de medicamentos de proteína de membrana através de esforços de design de medicamentos baseados em estruturas. A utilização de técnicas de design de medicamentos baseadas em estrutura para proteínas de membrana seria um grande benefício para a indústria médica, pois isso aumentaria a especificidade e eficácia da ligação medicamentosa, a fim de reduzir os efeitos colaterais indesejados e a quantidade de composto necessário para obter efeitos terapêuticos desejados, tornando assim drogas que visam proteínas de membrana significativamente mais seguras e eficazes. O sistema de nanopartículas de membrana celular nativa ainda está em estágio de desenvolvimento, mas já provou ser incrivelmente poderoso ao permitir pela primeira vez o estudo de proteínas de membrana em seus estados verdadeiramente nativos e elucidando as interações proteína-proteína nativas que ocorrem na membrana celular.
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Disclosures
Y.G é listado como inventor do polímero ativo de membrana NCMNP5-2 e sistema NCMN.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo fundo de startups VCU (para Y.G.) e pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número R01GM132329 (para Y.G.) O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. Agradecemos a Montserrat Samso e Kevin McRoberts pelo generoso apoio à gravação de vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Chloramphenicol | Goldbio | C-105-5 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder | Bio-Rad | 161-0400 | |
| DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free | Goldbio | DTT10 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
| IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
| Kanamycin | Goldbio | K-120-25 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
| N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
| NCMNS-P5-2 | Not commercially available yet | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| SMA2000 | Cray Valley | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
| TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
| Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
| Uranyl Acetate | Ambinter | Amb22348393 | |
| Equipment | |||
| Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
| Con-Torque Tissue Homogenizer | Eberbach | E7265 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
| Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
| Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder | Wheaton | 358013 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump | Razel Scientific Instruments | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
| Tecnai F20 200kV | FEI | ||
| Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | ||
| General Materials | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
| AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
| BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
| HisTrap HP 5 ml Column | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
| pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |
References
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