Microscopia confocal e força atômica (Conpokal) em células vivas

Summary

Apresentado aqui é o protocolo da técnica Conpokal, que combina microscopia de força confocal e atômica em uma única plataforma de instrumentos. Conpokal fornece a mesma célula, mesma região, imagens confocal simultâneas e caracterização mecânica de amostras biológicas vivas.

Abstract

Técnicas disponíveis para caracterização mecânica em micro e nanoes em escala explodiram nas últimas décadas. Desde o desenvolvimento do microscópio eletrônico de varredura e transmissão, até a invenção da microscopia da força atômica, e os avanços na imagem fluorescente, houve ganhos substanciais em tecnologias que permitem o estudo de pequenos materiais. Conpokal é um portmanteau que combina microscopia confocal com microscopia de força atômica (AFM), onde uma sonda "cutuca" a superfície. Embora cada técnica seja extremamente eficaz para a coleta de imagens qualitativas e/ou quantitativas por conta própria, a Conpokal fornece a capacidade de testar com imagens de fluorescência combinada e caracterização mecânica. Projetado para imagens confocal quase simultâneas e sondagem de força atômica, o Conpokal facilita a experimentação em amostras microbiológicas vivas. A visão adicional da instrumentação emparelhada fornece a co-localização de propriedades mecânicas medidas (por exemplo,módulo elástico, adesão, rugosidade superficial) pela AFM com componentes subcelulares ou atividade observável através de microscopia confocal. Este trabalho fornece um protocolo passo a passo para o funcionamento da microscopia de varredura a laser e força atômica, simultaneamente, para alcançar a mesma célula, mesma região, imagem confocal e caracterização mecânica.

Introduction

Ferramentas de avaliação mecânica de micro ou nanoescamas são frequentemente empregadas para descobrir as características de deformação no nível de célula única ou microrganismo, enquanto ferramentas separadas de microscopia de alta resolução são empregadas para visualizar processos subcelulares e características estruturais. Conpokal é a combinação de microscopia confocal de varredura a laser e microscopia de força atômica (AFM) em uma única plataforma instrumental. A técnica Conpokal foi implementada pela primeira vez em um sistema de polímero não biológico, onde o objetivo era determinar a adesão, elasticidade e tensão superficial de superfícies duras em contato com superfícies macias. As imagens confocal forneceram uma renderização visual de como o polímero se deforma, adere e libera da sonda dura^1,2. De polímeros a amostras biológicas, essa técnica oferece a oportunidade de imagens confocal de células vivas ou microrganismos quase simultâneas e AFM.

Mudanças na elasticidade celular foram implicadas na patogênese de muitas doenças humanas³ incluindo distúrbios vasculares⁴Malária^5,6, anemia falciforme⁷Artrite⁸Asma⁹e câncer^{6,10,11,12,13,14,15}. Técnicas comuns para medir a mecânica das células incluem o uso de contas magnéticas^16,17, pinça óptica^18,19, aspiração de micropipette^8,20,21,22, e AFM^{11,23,24,25,26}. Desde a aplicação da AFM às células vivas, ela foi prontamente adaptada para caracterizar a topografia celular^27,28 bem como propriedades mecânicas^{11,24,29,30,31} com precisão nanoescala. AFM foi ainda mais adaptado para microrrehetologia^32,33, modulação de frequência^34,35, e rastejar^25,36,37 experimentos para estudar as propriedades viscoelásticas de várias linhas celulares. O uso de um modelo de nanocontato adequado é fundamental para a extração de valores de elasticidade quantitativa a partir de medições de recuo de força produzidas pela AFM^1,2. Estudos da AFM que investigam a influência de drogas citoesquelletal na elasticidade celular mostraram que o módulo elástico é altamente afetado³⁸. Com base nas medidas de módulo elástico, muitos pesquisadores têm mostrado que as células cancerosas são mais macias do que suas contrapartes não transformadas^11,38,39. O aumento da deformabilidade provavelmente desempenha um papel proeminente na capacidade das células cancerosas de metástase e infiltrar tecidos⁴⁰. Tal comportamento é regulado por modificações na organização citoesquelletal das células^38,41,42. Além do câncer, outra classe de doenças mecânicas dependentes são doenças respiratórias. Por exemplo, a síndrome do estresse respiratório agudo afeta cada vez mais humanos a cada ano. Tem sido demonstrado que quando os pacientes são colocados em ventilação mecânica, com altas concentrações de oxigênio, sua condição pode piorar⁴³. Em uma série de estudos observando macrófagos epiteliais alveolares com AFM, os cientistas descobriram que a adição de um ambiente rico em oxigênio aumentou a rigidez das células devido à formação de actina; um exemplo primordial do impacto que a AFM tem em nossa compreensão detalhada da influência ambiental atmosférica sobre a função respiratória a nível celular e, em última instância, a cura e a saúde humanas^44,45,46. A rigidez das células epiteliais durante a migração para uma ferida também pode ser avaliada via AFM e que uma variação no módulo elástico ocorre para sinalizar a expansão futura da célula^47,48. Portanto, há uma necessidade prática de medir quantitativamente a mecânica celular para entender como as células doentes diferem e interagem com as saudáveis.

A AFM também é usada para estudar propriedades adesivas e estrutura de superfície. Um microscópio de força atômica tem uma variedade de modos para coletar informações sobre uma amostra usando mecânica de contato. Para amostras biológicas vivas, dois dos objetivos principais são obter valores quantitativos de propriedade mecânica (por exemplo,moduli elástico, forças adesivas) bem como altura da superfície do mapa. Esses modos incluem o modo de toque (também conhecido como contato intermitente), que mantém uma amplitude cantilever constante entrando em contato intermitente com a superfície da amostra e o modo de contato, que eleva ou abaixa o cantilever para manter uma deflexão constante⁴⁹. Mapas de adesão podem ser coletados usando mapeamento de força no sistema AFM. O cantilever recua a amostra para uma certa força e é então retraído. A força que resiste à retração é medida pelo detector para gerar um gráfico de deslocamento de força. A força de adesão é a força máxima medida durante a retração. A morfologia superficial fornece uma visão detalhada da amostra no nível micro ou nano. O cantilever completa uma varredura raster pela amostra com base no recuo e deflexão capturado pelo movimento do cantilever em cada pixel, revelando características micro e nano-tamanho. Com a AFM, o tamanho de pequenas características como a estrutura peptidoglycan^50,o alinhamento da cadeia do polímero^51,flagela^52,lamellipodia⁵³e filipodia⁵⁴ podem ser medidos. Enquanto o poder da AFM está em curvas de deslocamento de força e imagens topológicas não ópticas, a microscopia confocal oferece imagens detalhadas de amostras fluorescentes rotuladas.

A microscopia de escaneamento a laser confocal (CLSM) é uma técnica dominante para imagens de células vivas, células fixas e tecidos^55,56,57. O CLSM é empregado para imagens biológicas desde 1955, ou seja,desde a sua criação^58,59. Embora o princípio de trabalho dos microscópios confocal (ou seja,a rejeição da luz fora de foco através de um buraco) tenha permanecido em grande parte o mesmo, a implementação técnica tornou-se muito diversificada^56,57,58,60. A imagem confocal pode ser implementada através de varredura de vários pontos, como em um sistema de disco giratório⁶¹, varredura de ponto de um único raio laser, como na linha de varredura⁶², ou imagem da função de spread de ponto com reatribuções subsequentes de pixels através de um detector de vários elementos⁵⁷. Os avanços recentes que expandem a utilidade da imagem confocal incluem capacidade de varredura a laser, varredura de ressonância de alta velocidade e detectores de alta sensibilidade^63,64,65. A vantagem que todos os sistemas confocal têm sobre microscópios widefield é a capacidade de realizar seção óptica no eixo z com maior detalhe, especialmente em amostras grossas. Microscópios widefield usando detecção baseada em câmera coletam luz que é emitida do plano focal e, simultaneamente, luz emitida de todos os lugares no caminho de iluminação. Ao fechar o orifício, ao custo de redução do sinal, tanto a resolução axial quanto lateral pode ser aumentada^{em 66}. No CLSM, as imagens são construídas pixel a pixel através da coleta de sinal de emissão à medida que um laser de excitação é escaneado através de um campo de visão x-y. A coleta de vários planos x-y ao longo do eixo z da amostra pode então ser usada para reconstruir a arquitetura tridimensional da amostra^57,67. A microscopia confocal, em conjunto com a introdução de proteínas fluorescentes, revolucionou nossa compreensão da biologia celular⁶⁸. Por exemplo, tornou-se uma ferramenta essencial na neurociência⁶⁹. O CLSM é usado regularmente para observar tecido limpo, e para obter imagens abrangentes do cérebro imune manchado e arquitetura da rede neuronal⁷⁰. Esta aplicação resultou em novas percepções sobre contatos sinápticos e comunicação entre neurônios e células gliais no cérebro⁷¹. Das células cerebrais às vesículas, os protocolos de coloração fluorescente suportam a inspeção e captura de funções celulares por meio de microscopia confocal para avanços nas técnicas terapêuticas^72,73.

Embora sejam ferramentas impressionantes e versáteis individualmente, a combinação de microscopia de força confocal e atômica (Conpokal) permite aos pesquisadores correlacionar exclusivamente propriedades celulares/tecidos topográficas e micromecânicas com a observação de várias organelas celulares e suas respectivas dinâmicas. A instrumentação emparelhada permite que os usuários, essencialmente, "vejam" o que estão sondando; uma enorme vantagem sobre uma técnica por conta própria. Com o Conpokal, o mapeamento de força através da AFM é sobreposto em imagens confocal para correlacionar rigidez celular, adesão ou morfologia à estrutura citoesquelélida dentro da amostra, por exemplo. O objetivo geral do método Conpokal é fornecer uma plataforma para os pesquisadores estudarem amostras vivas de forma concisa e eficaz, fornecendo dados de imagem e propriedade material em uma única plataforma. Neste trabalho, demonstramos o funcionamento do Conpokal incluindo seleção e preparação adequada de amostras, configuração do instrumento, calibração cantilever e fornecemos diretrizes para a solução de problemas bem-sucedida. Após o protocolo, fornecemos resultados representativos que incluem mapeamento de altura afm de bactérias e células bem sucedidas, mapeamento de módulos afm de bactérias e células e imagens confocal de células multi-rotuladas, através de confocal de mesma célula e AFM. Concluímos com uma discussão sobre as etapas críticas do procedimento Conpokal, recomendações de solução de problemas, limitações técnicas, significância e perspectivas futuras para o método.

Protocol

1. Preparação de instrumentos, meios de cultura, pratos

1. Ligue as fontes de energia tanto para o microscópio confocal quanto para o microscópio de força atômica, bem como quaisquer outros instrumentos ou dispositivos associados utilizados durante o Conpokal. Dê tempo suficiente para que os instrumentos se equilibrem e se estabilizem termicamente antes das medições inativas. Normalmente, 1h é suficiente.
2. Prepare uma placa de Petri limpa, aprovada pelo sistema, com fundo de vidro e encha metade cheia, mas não mais do que dois terços cheia, com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) ou líquido claro similar. Este prato (chamado de "prato de calibração") é separado dos pratos de amostra e será usado para localizar e calibrar o cantilever microscópio de força atômica (AFM).
   NOTA: É importante que o líquido esteja claro e tenha baixa autofluorescência para evitar qualquer interferência no espectro da fluorescência. A PBS é recomendada porque imita o ambiente biológico.
3. Prepare pratos experimentais de amostra, de modo que o líquido associado tenha preenchido o prato pelo menos meio cheio. Se a amostra for fluorescente, certifique-se de que está coberta ou em um lugar escuro até que seja necessário. Limpe o fundo de todos os pratos de vidro usando limpador de lentes e limpadores de lentes.
4. Crie pastas de armazenamento de dados para o confocal e AFM nos discos rígidos do computador.

2. Seleção de células ou microrganismos

1. Para criar uma solução de estoque de bactérias, inocular as bactérias Streptococcus mutans, usando um laço de inoculação, em 15 mL de Todd Hewitt Leveast (THY) durante a noite (para fase exponencial) em uma incubadora de CO₂ de 5%.
2. 1 h antes que a incubação noturna esteja completa, cubra pratos experimentais de amostra com 1 mL de solução de poli-l-lysina ou o suficiente para cobrir a porção de vidro do prato com fundo de vidro e deixe no armário de biossegurança por 1 h. Após a configuração, aspire a solução de poli-l-lysina e enxágue os pratos 3x com PBS.
3. Após 18 – 24h de incubação bacteriana, inocula thy com 1 mL de suspensão bacteriana até que uma densidade óptica de 0,6 – 0,7 seja alcançada (valores típicos para a inoculação são 3 mL de THY com 1 mL de suspensão bacteriana por prato). Adicione 1 mL de nova solução de bactérias a cada prato revestido de poli-l-lysina e incubar por 1h. Durante os últimos 10 min, adicione 1 mL de mancha de membrana fluorescente verde (concentração de 1 μM) a cada prato.
4. Enxágüe cada prato 3x com PBS. Fixar suavemente as bactérias com cerca de 1 mL de solução paraformaldeída de 4% por 15 minutos à temperatura ambiente dentro de um armário de biossegurança. Enxágüe cada prato 3x com PBS após a fixação.
5. Armazenar o Rim Embrionário Humano (HEK) 293 células em nitrogênio líquido. Realize o descongelamento rápido no banho de água de 37 °C antes de emplacamento.
6. Adicione 1 mL de solução de matriz de membrana de porão em mídia de cultura celular a cada prato de amostra de células e incubar (5% CO₂) a 37 °C por 1h. Aspire a solução e lave os pratos com mídia de cultura celular. Emplaque o número necessário de células HEK 293 (por exemplo,100.000 células por prato de 35 mm) e adicione 2 mL de mídia de cultura celular. Em seguida, incubar (5% DE CO₂) as células a 37 °C por 48 h.
7. Após 48 h, adicione 2 μL de um corante citoesqueleto de microtubula fluorescente (concentração de 1x) a cada prato de amostra de células e incubar por 30 minutos. Aspire a solução contendo o corante, lave as células 3x com PBS e adicione 2 mL de mídia de cultura celular.
8. Adicione 1 μL de corante de membrana plasmática (concentração de 10 μM) aos pratos da amostra e incubar por 30 minutos. Lave a solução contendo o corante 3x com PBS e adicione 2 mL de mídia de cultura celular.
9. Contratente o núcleo adicionando 1 μL de uma solução de corante ácido nucleico (concentração de 10 μM) aos pratos de amostra e incubar por 30 minutos. Lave a solução contendo o corante 3x com PBS e adicione 2 mL de mídia cultural.

3. Procedimento AFM

1. Abra o software operacional do microscópio de força atômica (AFM) clicando no ícone de software no computador.
2. Gire para ou insira um objetivo de ar de baixa ampliação (recomendado 10x ou 20x). Uma longa distância de trabalho de 5 mm ou mais é benéfica durante a redução e calibração da ponta.
3. Monte o estágio de amostra de célula escolhido se ainda não estiver instalado. Para amostras vivas, use um aquecedor de prato para manter a amostra na temperatura desejada.
4. Carregue a placa de Petri limpa e aprovada pelo sistema preenchida meio cheia de PBS (preparada na etapa 1.2) ou líquido claro similar (prato de calibração). Se o estágio amostral tiver fechos embutidos, use estes, caso contrário, use graxa de vácuo para estabilizar a amostra.
5. Selecione um afm apropriado para a coleta de dados desejada e instale-o seguindo as etapas abaixo.
   1. Usando luvas, monte o chip AFM no bloco de vidro usando o estágio de montagem do chip AFM, pinças e uma pequena chave de fenda. Coloque cuidadosamente o chip AFM sobre o bloco de vidro e oriente-o de tal forma que esteja centrado. O cantilever, mais uma porção muito pequena do chip AFM, deve estar na porção visível e não opaca do bloco de montagem.
   2. Fixar o chip com a chave de fenda apertando o parafuso até que o chip esteja confortável contra o bloco de vidro. Verifique se o cantilever AFM é orientado corretamente usando um microscópio estéreo ou um spyglass portátil. Ajuste conforme necessário. Uma vez devidamente orientado, coloque o bloco de vidro na cabeça AFM na orientação adequada e bloqueie-o no lugar.
      NOTA: A orientação do chip AFM dentro do bloco de vidro é importante para que os lasers do sistema apontem para a parte de trás do cantilever e reflitam corretamente sobre o fotodetector. Tenha cuidado para não apertar os parafusos durante a colocação, pois este procedimento pode fazer com que o chip AFM, cantilever ou ponta quebrem.
6. Usando a opção brightfield do microscópio confocal, localize a parte inferior da placa de calibração usando o botão de foco. Tome nota desta altura z como o valor onde a parte inferior do prato está localizada em relação ao objetivo do microscópio.
7. Usando o painel de controle motor do sistema AFM no computador que opera os motores z stepper, mova o cantilever AFM para longe da amostra para cima de 2000 μm.
8. Usando ambas as mãos, coloque suavemente a cabeça AFM com o chip AFM no estágio da amostra certificando-se de que cada um dos pontos verticais na cabeça AFM esteja firmemente definido em suas ranhuras designadas no estágio AFM. Uma vez que a cabeça AFM está no lugar, veja visualmente o quão perto o suporte cantilever está do prato. Se parecer muito perto, de tal forma que a cabeça AFM esteja em contato ou dentro de 1 mm da parte superior do prato de amostra, recue-a usando os motores z stepper antes de baixar a ponta AFM em direção à amostra.
9. Usando iluminação brightfield, abaixe lentamente o chip AFM para a parte inferior da placa de vidro usando o painel de controle do motor z stepper no software AFM. Localize os micrômetros manuais que controlam o movimento x-y ou no plano da cabeça AFM na plataforma de instrumentos. Ajuste a posição do cantilever AFM dentro do campo de visão corrigindo a cabeça AFM à medida que o cantilever entra em vista.
   1. Uma vez que o local em relação ao fundo da placa é desconhecido neste momento, menor com passos de 100 a 200 μm para evitar bater a ponta AFM na placa de Petri. Normalmente, a ponta precisa ser baixada de 800 a 2000 μm. À medida que a ponta é baixada, observe para que uma sombra apareça na visualização do software do microscópio, o que indica que a ponta AFM está se aproximando da parte inferior do prato.
   2. Diminuir os incrementos para 20 - 50 μm. Certifique-se de ajustar as tabelas de aparência para cima (LUTs) da imagem da câmera à medida que a ponta abaixa para o prato usando o painel LUTs no software confocal. Continue a baixar a ponta AFM usando pequenos passos até que esteja em foco.
   3. Certifique-se de que a ponta é escura o suficiente para que a forma geral dela possa ser vista e centrada no campo de visão. Certifique-se também de que a ponta parece embaçada, o que confirma que ainda não encontrou o fundo do prato.
10. Ajuste o foco do microscópio de modo que a ponta esteja agora em foco, tendo em mente a distância de trabalho do objetivo. Antes de passar para um objetivo de ampliação mais elevado, use a ferramenta de medição do microscópio para coletar a largura e o comprimento do cantilever AFM acessando o painel de ferramentas de medição no software confocal. Tome nota dessas medidas.
    NOTA: É importante não bater o objetivo na parte inferior do prato de amostra que também pode fazer com que o prato de amostra entre em contato com a ponta AFM, potencialmente danificando-o.
11. Se estiver presente, remova o filtro de luz laser e garanta que o laser AFM esteja aceso, para que a luz laser se torne visível na óptica.
    1. Usando os mostradores de alinhamento a laser, mova o laser para o campo de visão e perto da ponta AFM. Uma vez que o laser esteja neste local, substitua o filtro de luz laser.
    2. Usando os mostradores de alinhamento a laser, coloque o laser na parte traseira de onde a ponta AFM está localizada no cantilever. Neste ponto, o painel de alinhamento a laser deve estar lendo um sinal de soma superior a 0,0 V. Se nenhum sinal de soma for obtido, ajuste o espelho usando o botão do espelho controlado manualmente até que um sinal de soma superior a 0,0 V seja lido na tela.
    3. Mova o laser em pequenas quantidades em todas as direções no cantilever AFM até que o sinal máximo de soma seja alcançado, mas a posição está na ponta AFM. Uma vez definida a posição do laser, zero a deflexão vertical e lateral usando os mostradores de deflexão controlados manualmente.
    4. Observe o painel de alinhamento a laser no software AFM e usando os botões de deflexão vertical e lateral na cabeça AFM, alinhe o detector para que o alvo esteja centrado (ponto vermelho no centro da mira) e não haja deflexão vertical ou lateral.
12. Abra a janela de calibração no software AFM. Insira todas as informações específicas do experimento. Antes de calibrar, desligue a fonte de luz do microscópio confocal e feche o gabinete AFM, se aplicável, para amortecer qualquer ruído potencial proveniente da luz da sala ou vibrações da sala. Em seguida, pressione o botão de calibração para permitir automaticamente que o sistema calibrar a ponta. Após a calibração ser concluída, a rigidez do cantilever (N/m) e sua sensibilidade (nm/V) serão fornecidas dentro do painel de calibração. Note estes para análise posterior.
13. Retraia o cantilever AFM pelo menos 2000 μm com os motores do estepe. Retire a cabeça AFM do palco e remova o prato de calibração. Gire para ou insira o objetivo desejado. Retraia o objetivo de 10% da distância de trabalho se o sistema for programado para manter o mesmo plano focal entre os objetivos. Se este for um objetivo do óleo, coloque uma gota de óleo de imersão no olho do objetivo.
    NOTA: A retração do objetivo reduz a probabilidade do objetivo entrar em contato com o prato amostral durante a colocação.
14. Para segurar com segurança o prato de amostra no lugar, use um cotonete para aplicar pequenas pontas de graxa de vácuo ao redor da borda do anel de amostra dentro do estágio amostral, ou empregue clipes de amostra. Carregue cuidadosamente o prato de amostra no estágio da amostra.
15. Uma vez que a amostra é colocada, gire-a algumas vezes para garantir uma boa vedação do prato para o suporte da amostra através da graxa. Levante o objetivo para o fundo do prato até que o óleo apenas pavifique sobre o olho do objetivo.
16. Usando o microscópio, sem a cabeça AFM no palco, concentre o sistema de imagem para que a amostra esteja em foco. Observe esta altura z para referência.
17. Substitua cuidadosamente a cabeça AFM na plataforma.
18. Usando os motores z stepper, abaixe a ponta em direção à amostra. À medida que a ponta AFM é baixada, ajuste as tabelas de olhar para cima (LUTs) na imagem de campo brilhante conforme necessário. Abaixe a ponta até ficar quase afiada. Usando os micrometros de posição de ponta AFM operados manualmente, mova a cabeça AFM para que a ponta AFM esteja no centro ou à esquerda centrada no campo de visão.
    NOTA: Uma vez que a altura z do AFM foi notada antes na etapa 3.6, passos maiores podem ser dados para baixar a ponta AFM, no entanto, a graxa foi adicionada ao fundo do prato e potencialmente óleo ao objetivo, de modo que este valor é apenas para referência. Recomenda-se dar passos de 50 a 100 μm e ajustar menores à medida que a ponta entra em foco
19. Reajuste a posição do laser usando os micrômetros manuais na cabeça AFM. Se necessário, zero as deflexões verticais e laterais ajustando os respectivos botões e recalibrar o cantilever AFM no prato de amostra.
    NOTA: Se o cantilever foi calibrado em um meio diferente da amostra, ele deve ser recalibrado no meio de digitalização para responder por uma possível mudança no índice de refração. Além disso, o laser pode derivar da parte traseira do cantilever devido a mudanças de ruído ou temperatura. Apenas reajuste o laser e recalibrar se necessário e no prato de amostra acima do substrato de vidro se usar calibração sem contato. Se usar calibração de contato, recalibrar dentro da antena de calibração usando o meio de amostra.
20. Para obter imagens de microscópio confocal de alta qualidade, substitua o filtro de luz atenuante atual pelo filtro que bloqueia toda a luz laser AFM. Este filtro de luz não garante interferência da luz brilhante do laser AFM.
21. Usando o botão de comando de aproximação automatizado, tipicamente denotado por uma seta virada para baixo, abaixe a ponta para a parte inferior do prato de amostra. Defina o tamanho/área da varredura, a resolução, o setpoint, o comprimento z e o tempo do pixel (ou use os valores calibrados/propagados) no painel de controle de imagem e comece a digitalizar.
22. Depois que uma varredura estiver completa, levante o chip AFM de 50 a 100 μm antes de navegar para uma nova posição de medição no prato de amostra. Uma vez que um novo local seja encontrado, aproxime-se do vidro e comece a digitalizar novamente seguindo as etapas 3.21 e 3.22.
23. Selecione a opção Salvar automaticamente ou salve manualmente cada arquivo gerado de cada varredura individual clicando em Salvar.

4. Procedimento confocal

1. Abra o software operacional confocal. Certifique-se de que todos os periféricos associados, fontes de luz e controladores estejam ligados e funcionando normalmente.
2. Gire ou insira um objetivo de baixa ampliação (10x ou 20x) para visualizar a amostra. Certifique-se de que o objetivo está a uma distância de trabalho segura de onde o prato amostral estará e, se necessário, recue o objetivo de evitar qualquer colisão potencial do objetivo com a amostra. Usando um cotonete, unxa de vácuo dab ao redor da borda do anel de prato de amostra. Se usar um objetivo de óleo, coloque uma única gota de óleo de imersão na lente frontal do objetivo
3. Coloque a amostra desejada no estágio amostral. Gire a amostra algumas vezes para garantir que a graxa de vácuo tenha gerado uma ligação apertada com a inserção do estágio da amostra ou empregue clipes de amostra. Se usar um objetivo de óleo, levante o objetivo para o fundo do prato para que o óleo apenas pavifique sobre o fundo do vidro. Para evitar branqueamento excessivo, minimize a iluminação ambiente.
4. Usando modos de campo brilhante ou epifluorescência através da câmera ou das oculares, localize a amostra e usando o botão de foco, concentre-se em uma área de interesse contendo múltiplas células ou uma única célula. Muitas vezes, o campo de visão dentro do microscópio óptico será maior do que a janela de varredura x-y no sistema AFM (100 x 100 μm). Faça ajustes da posição AFM dentro do campo de visão confocal usando o painel de controle do motor no software AFM para que a varredura AFM e a óptica confocal estejam examinando as mesmas características.
   NOTA: Dentro do campo de visão, normalmente há apenas algumas células, por isso é mais fácil determinar qual célula é desejada para sondar. À medida que o AFM é conduzido, a célula se torna visível no software AFM e, a partir daí, o usuário pode identificar regiões específicas de interesse para sondar.
5. Se desejar, capture imagens em campo brilhante ou epifluorescência usando uma câmera ou modos CLSM com base no rótulo da amostra, concentre os botões e capture botões no software do microscópio.
6. Usando o software do microscópio, selecione a opção ou abra o painel para habilitar recursos confocal (por exemplo,lasers e parâmetros subsequentes). Esta opção é tipicamente notada pelos valores de comprimento de onda da linha laser.
7. Selecione as linhas de laser apropriadas para os corantes que são usados para colorir as amostras. Ligue uma ou várias linhas de laser para excitar e imaginar essas características na amostra.
8. Defina o ganho a um valor que otimize a fluorescência das amostras, mas limita a quantidade de ruído. Um valor inicial típico é um ganho de 70.
9. Ajuste a potência do laser para evitar pixels saturados, mas maximize o alcance dinâmico. Um intervalo de partida típico para a potência laser é de 1 a 3 %.
10. Ajuste o tamanho do orifício para 1 Unidade arejada para maximizar a resolução para a seção óptica. Se a amostra estiver fraca e a potência laser já estiver alta, abra o pinhole para aumentar o sinal ao custo de diminuir a resolução do eixo z.
11. Defina o tempo de moradia dos pixels(ou seja,a velocidade de varredura). Comece com um tempo de moradia de 2 μs e, se necessário, ajuste para refletir o brilho da amostra. Escolha o tamanho do pixel/tamanho de varredura para o objetivo selecionado, permitindo que o instrumento calculá-lo através do botão de opção Nyquist e o número escolhido de pixels na imagem.
    NOTA: Tempos de moradia mais longos em amostras mais grossas podem levar a branqueamento excessivo quando as pilhas z são coletadas.
12. Selecione a opção Digitalizar no software do instrumento e inicie a coleta de dados.
    NOTA: Se o instrumento tiver vários lasers, cada um pode ser otimizado independentemente e, em seguida, executado simultaneamente para imagens multi-fluorescentes.
13. Use o botão de foco para ampliar e sair e localizar o campo de visão ideal na amostra.
14. Capture imagens usando o botão Capture do sistema e salve todos os formatos de arquivo necessários da amostra para um local/pasta desejado no disco rígido do computador ou disco rígido externo local.
15. Continue a ajustar o ganho, a potência do laser, o tamanho do pinhole, a taxa de amostragem e outros valores de acordo para otimizar a imagem. O índice de saturação de pixels pode ser ativado para verificar se os pixels estão supersaturados. Se essa supersaturação estiver presente, o ganho e a energia do laser podem ser reajustados para eliminar pixels saturados. Use os LUTs como guia para fazer ajustes específicos.
16. Se possível, use a taxa de amostragem nyquist do sistema, que é exibida no software como um painel ou botão, para garantir que as imagens sejam coletadas na resolução máxima obtida.
17. Ative a ferramenta de coleta de z do sistema confocal ou de volume de imagem. Usando uma opção de baixo para cima, com apenas uma linha laser, especificamente a linha laser que ilumina uma característica na amostra mais clara, defina os planos de partida e acabamento para que o volume seja medido.
18. Use o espaçamento sugerido entre os planos na pilha z, que é calculado para cumprir os critérios de amostragem de Nyquist para a melhor resolução axial obtida fornecida pelo instrumento e linha laser usada.
19. Quando várias linhas laser forem usadas, use o comprimento de onda mais curto para o cálculo do espaçamento. Quando a aquisição terminar, salve o arquivo na pasta apropriada.
20. Alternativamente, se o conhecimento a priori da espessura da amostra existir, defina o volume selecionando o plano médio, aquele que aparece mais brilhante e mais nítido. Nesta situação, coloque a espessura superior a metade da amostra acima do plano médio e a parte inferior para metade da espessura abaixo do plano médio.
21. Após a coleta de amostras neste campo de visão estiver completa, ou a amostra tenha branqueado, use o estágio motorizado ou controlado manualmente para encontrar outro local de interesse na amostra e repetir os passos para a coleta de imagens.

5. Limpar o procedimento

1. Certifique-se de que todos os arquivos de dados, tanto do CLSM quanto do AFM, sejam salvos nos locais apropriados.
2. Retraia o chip AFM usando os motores z stepper pelo menos 2000 μm ou a distância que foi percorrida para chegar à superfície da amostra. Retire a cabeça AFM do palco e coloque-a cuidadosamente em seu local de descanso.
3. Retraia o objetivo do microscópio para que ele fique longe da amostra. Se for utilizado um objetivo de óleo, o objetivo deve ser retraído o suficiente para que não haja mais contato entre o objetivo e o substrato amostral.
4. Usando luvas, retire a amostra e limpe a graxa e o óleo, se aplicável, do fundo do prato de amostra. Adquira uma nova placa de Petri limpa e vazia e encha-a com 70% de solução de etanol de meio a três quartos cheia. Coloque-o no suporte da amostra e substitua a cabeça AFM para permitir que o chip AFM mergulhe na solução de etanol por 5 minutos.
5. Embora o chip AFM esteja encharcado, recomenda-se começar a copiar os dados do experimento em um disco rígido externo. Após a imersão do chip AFM na solução de etanol por pelo menos 5 minutos, remova a cabeça AFM e coloque-a em seu local de descanso.
6. Usando luvas, remova o suporte do chip AFM e coloque-o na estação de montagem. Remova cuidadosamente o chip AFM usando pinças com apertos de borracha. Coloque a ponta usada de volta na localização da caixa que veio do eixo orientado para denotar que ela foi usada. Para referência futura, note qual dica foi usada no experimento.
7. Tire a placa de Petri cheia com a solução de etanol do sistema e descarte o líquido e o prato. Usando luvas, limpador de lentes e limpadores de lentes, limpe suavemente o óleo do objetivo do microscópio seguindo os protocolos padrão. Limpe o suporte da amostra removendo qualquer graxa. Descarte todos os materiais residuais de acordo com protocolos de biossegurança e devolva ferramentas para seus locais conhecidos.
8. Termine a coleta de dados do computador e desligue-os. Desligo todos os instrumentos, acessórios, periféricos ou outros dispositivos utilizados para o experimento.

Results

A técnica Conpokal é representada esquematicamente na Figura 1A e uma imagem da configuração é mostrada na Figura 1B. A fim de co-localizar com precisão estruturas biológicas através de microscopia confocal com as mesmas estruturas na AFM, o alinhamento dos dois sistemas durante a instalação é crítico. Selecione os fabricantes confocal e AFM respeitáveis que estejam familiarizados com os requisitos espaciais uns dos outros. Além disso, a implementação bem sucedida da técnica conta com bons procedimentos de coloração, imobilização da estrutura biológica e a escolha adequada da ponta AFM. A altura das células vivas muitas vezes representa um desafio para a imagem AFM. Uma varredura AFM sobre uma célula HEK viva é mostrada na Figura 2A. A altura desta célula HEK em particular foi de cerca de 10 μm, demonstrada pela varredura de linha em verde(Figura 2B). Uma ponta AFM com deslocamento zero (ponta está na extremidade do cantilever) ou a altura da ponta maior que a altura da célula(por exemplo,altura da ponta ≥ 10 μm) produzirá uma imagem altamente resolvida de células individuais. Um exemplo de uma varredura ruim devido à escolha inadequada da dica AFM está incluído na Figura 2C. Nesta imagem, pixels pretos apareceram no ápice da célula indicando que o AFM piezo está fora de alcance devido a uma grande altura celular. A extremidade do cantilever AFM apareceu na imagem (um quadrado arredondado) por causa do deslocamento da ponta combinado com altura de ponta insuficiente em comparação com a altura da célula. Estes artefatos na imagem AFM indicam que uma dica AFM diferente deve ser escolhida para a imagem da célula.

Uma rotulagem eficiente na coloração da fluorescência, juntamente com a sonda correta para imagens de células vivas, são necessárias para este método. Realizamos uma imagem confocal tricolor mostrada na Figura 3A com uma mancha nuclear (azul fluorescente), uma mancha de microtúbulo (verde fluorescente) e uma mancha de membrana lipofílica (vermelho fluorescente). Estas sondas de célula viva foram escolhidas devido à sua sobreposição espectral limitada e sua compatibilidade com cubos de filtro padrão. Também incluímos a imagem óptica brightfield na Figura 3B.

A partir da AFM, a análise das recuos de ponta juntamente com um modelo nanomecânico, produz um mapa de módulo da superfície. Um exemplo de um mapa de módulo construído usando um ajuste modelo Hertz e um perfil parabólico (raio de 8 nm) para a forma da ponta é mostrado sobreposto à reconstrução 3D da forma celular na Figura 4A (que são as mesmas duas células mostradas na Figura 3). A projeção 3D correspondente da pilha z confocal a laser é mostrada na Figura 4B.

O método também é apropriado para estruturas biológicas menores, incluindo bactérias únicas cujas características micro e nanoscópicas são difíceis de resolver usando microscopia leve. Um estudo em andamento utiliza a técnica Conpokal para explorar mecanismos mecânicos dentro da parede celular que influenciam a resistência a antibióticos em Streptococcus mutans.⁷⁴ A manipulação dos componentes da parede celular resultou em mudanças na morfologia e resistência a antibióticos. O conpokal facilita a coleta de dados ao vivo, em solução (por exemplo,morfologia superficial, módulo elástico, força de adesão e rugosidade superficial) em amostras da mesma célula para acoplar propriedades mecânicas com a presença ou ausência de componentes da parede celular. Figura 5A,B incluem uma varredura AFM e mapa de módulo medido de uma bactéria Streptococcus mutans. Uma melhor resolução foi alcançada nesta escala com a AFM do que com a tradicional microscopia confocal.

A Figura 6 contém uma imagem confocal de uma colônia de Enterococcus faecalis manchada com uma mancha de estrutura celular fluorescente verde, que se prende à parede celular. As figuras 5 e a Figura 6 demonstram a aplicabilidade da técnica Conpokal aos micróbios, além das células eucarióticas.

Figura 1: A configuração Conpokal.
(A) Esquema da técnica Conpokal. (B) Imagem da configuração do instrumento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Microscopia de força atômica de células vivas.
(A) Imagem AFM de duas células HEK. (B) Perfil de altura (linha verde em A) de uma célula HEK indicando que a altura da célula é bastante grande a 10 μm. (C) Pobre imagem AFM de uma célula de astrócito onde o AFM piezo está fora do alcance no ápice da célula e há evidências de imagens reversas do final cantilever. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Microscopia confocal e brightfield de células vivas.
(A) Microscopia confocícal de varredura a laser de células HEK vivas manchadas com uma mancha nuclear (azul fluorescente), uma mancha de microtúbulo (verde fluorescente) e uma mancha de membrana lipofílica (vermelho fluorescente). (B) Imagem óptica de campo brilhante correspondente. As barras de escala são de 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Comparação das renderizações 3D de AFM e microscopia confocal de células HEK vivas.
(A) Mapa de módulo construído usando um ajuste modelo Hertz e um perfil parabólico (raio de 8 nm) para a forma de ponta sobreposta à reconstrução 3D da célula da AFM. (B) A projeção 3D correspondente da pilha z confocal a laser com uma mancha nuclear (azul fluorescente), uma mancha de microtúbulo (verde fluorescente) e uma mancha de membrana lipofílica (vermelho fluorescente). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: AFM da amostra de bactérias.
(A) Varredura AFM e (B) mapa de módulo medido de uma bactéria Streptococcus mutans. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Microscopia confocal da amostra de bactérias.
Imagem confocal de uma colônia de Enterooccus faecalis com mancha de membrana fluorescente verde. A barra de escala é de 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Conpokal é uma técnica avançada e eficaz para coletar imagens de alta qualidade e propriedades mecânicas in situ de biomateriais vivos em um ambiente líquido. A capacidade de coletar imagens excepcionais de morfologia e topografia combinadas com propriedades mecânicas de amostra viva se estende além das técnicas típicas de microscopia eletrônica e leve. Separadamente, um microscópio confocal fornece recursos confocal de varredura de campo brilhante, epifluorescência e varredura a laser para alcançar imagens fluorescentes detalhadas e de alta qualidade das amostras. Um AFM fornece caracterização mecânica, mas sem óptica auxiliar torna-se difícil navegar pela amostra. Com os dois sistemas combinados, o usuário pode coletar imagens e propriedades mecânicas da mesma célula durante o experimento, o que é uma grande vantagem sobre dois instrumentos separados. O objetivo deste manuscrito é informar e orientar os usuários sobre as extensas capacidades do sistema Conpokal combinado para o futuro da biologia, engenharia e saúde. O protocolo envolve elaboração de instrumentos, meios de cultura, pratos, seleção de microrganismos, procedimento AFM, procedimento confocal e limpeza. Os passos mais críticos para uma sessão conpokal ao vivo e bem sucedida são imobilização de amostras, seleção criteriosa de ponta e execução de manchas ao vivo. A seção de discussão deste manuscrito elaborará sobre recomendações culturais, dicas de solução de problemas e diretrizes operacionais, e futuros trabalhos para a técnica Conpokal. As recomendações culturais abrangerão orientações sobre cultura amostral, imobilização e coloração. As dicas e diretrizes da AFM, confocal e Conpokal discutirão seleção e calibração de pontas, resolução, limitações e operação quase simultânea. O trabalho futuro inclui as perspectivas e o potencial para possíveis caminhos de pesquisa.

O protocolo abrange cultura, sondagem e imagens de amostras de células vivas e de bactérias fixas. Um desafio presente na condução do AFM em líquido decorre da obstrução do movimento cantilever devido ao empecilho amostral e arrasto hidrodinâmico. Se a amostra não estiver bem aderida ao substrato, há potencial para a incrusção do cantilever por seções da amostra flutuando no líquido. Nesse caso, as medidas são comprometidas por serem uma suposição de adesão elástica e propriedades micromecânicas da amostra. As células HEK não foram tratadas com fixação, no entanto, S. mutans e E. faecalis requerem imobilização adicional, semelhante a outras células procarióticas. As bactérias escolhidas apresentaram movimento ativo que dificultava a sondagem celular e a imagem, portanto, as amostras eram suavemente, quimicamente fixadas para promover a imobilização. Existem alternativas à fixação química, como membranas de filtro que prendem fisicamente células individuais nos poros⁷⁵.

A seleção de pontas também é um componente crítico para a configuração e operação do AFM. Quando são procuradas propriedades mecânicas baseadas na deformação do biomamaterial, deve-se considerar a rigidez cantilever e a compatibilidade de rigidez do material, que é uma tarefa não trivial. O objetivo principal é melhor combinar a rigidez do material com a rigidez do cantilever selecionado. Se o cantilever for muito mais macio que a amostra, estará sujeito a muita deflexão. Se o cantilever for mais rígido que a amostra, então o detector AFM pode ser incapaz de capturar tais pequenas deflexões. Recomenda-se que, ao selecionar um cantilever AFM adequado, escolha com base em aplicação experimental. Para coletar imagens detalhadas no modo de contato intermitente, as dicas de AFM dentro de uma faixa de 0,1 - 0,3 N/m para rigidez e raio de ponta dentro de 5 nm - 100 nm são eficazes para imagens de células vivas. Pequenas dicas cônicas são recomendadas. As dicas afiadas fornecem uma pequena área de contato e capacidade de indent auxiliando ainda mais na coleta de pequenos detalhes e recursos na morfologia da amostra⁷⁶. No entanto, pontas afiadas também podem ser problemáticas, pois são propensas a perfurar amostras quando as configurações (por exemplo,set point, pixel time, velocidade de aproximação) requerem muito recuo ou o recuo é muito rápido. Para evitar efeitos de alta taxa de tensão, o endurecimento da tensão local perto de uma ponta afiada, ou simplesmente para controlar a área de contato e a velocidade de aproximação, muitos optam por usar espectroscopia de força com uma ponta coloidal para medir um módulo elástico.

As pontas AFM dentro de uma faixa de 0,01 - 1,0 N/m para rigidez e raio de ponta dentro de 1 - 5 μm são recomendadas para medir o moduli elástico das células vivas. Grandes tamanhos de ponta, tipicamente coloides de vidro, fornecem uma área de contato conhecida e são improváveis de perfurar a célula durante o contato. Cantilevers retangulares são preferidos em vez de triangulares porque durante a calibração, o método sem contato pode ser usado para geometria retangular em comparação com a calibração baseada em contato para geometrias triangulares. Além disso, devido à natureza delicada das pontas AFM, recomenda-se que o operador implemente pinças com pontas de borracha para reduzir o potencial de danificar o delicado chip AFM ou bloco de montagem. Outros parâmetros a serem observados incluem a velocidade de aproximação da ponta AFM e a quantidade de recuo na amostra. Uma boa orientação é manter o recuo em cerca de 10% da espessura (ou altura) da amostra e escolher uma velocidade que impeça a resistência hidrodinâmica potencial experimentada pelo cantilever³⁸.

Instrumentos experimentais intrincados normalmente vêm com bloqueios que requerem solução de problemas no instrumento configurado, calibração e operação. Travar a ponta AFM ou cantilever na amostra ou substrato amostral é um erro comum para novos usuários. Para evitar esse problema, o protocolo sugere apoiar o cantilever fora 2000 μm. Esta etapa garante que a ponta não entrará em contato com a parte inferior do prato se o usuário anterior esqueceu de recuar a ponta ao limpar após a experimentação. No entanto, a distância de 2000 μm foi escolhida para o porta-pratos selecionado utilizado neste protocolo. Uma gama diferente, maior ou menor, pode precisar ser selecionada dependendo do estilo do porta-prato que está sendo usado. Durante o alinhamento do laser e do detector, o protocolo menciona o ajuste de um botão do espelho para maximizar o sinal de soma. Um botão de ajuste do espelho pode não estar presente em todos os AFMs. Se estiver presente, porém, uma forma de manipular o instrumento para solucionar problemas um sinal de baixa soma é ajustar o botão do espelho, usado para explicar o meio em que a digitalização ocorrerá; líquido (por exemplo,água, mídia, PBS) ou ar. Devido à diferença no índice de refração para a luz através do ar e através do líquido, o botão do espelho pode precisar ser ajustado. A sensibilidade máxima de dobra do cantilever AFM estará no local da ponta AFM, portanto, a luz laser, que retorna a posição de dobra através de sua colocação em um fotodiodo, deve estar localizada no local da ponta AFM. Dependendo da ponta AFM escolhida, o valor do sinal de soma pode variar de 0,3 a 3,0 V. Um revestimento traseiro no cantilever AFM como Cr-Au ou Al aumentará o sinal de soma e a sensibilidade da medição.

A geometria da ponta é pertinente ao completar a calibração da ponta durante a operação AFM. Observou-se boa concordância entre a calibração de não contato e contato. Se o cantilever AFM escolhido não for retangular, a calibração de contato precisará ser realizada. Tenha em mente que o meio em que a ponta está calibrada deve ser o mesmo que o meio amostral. Se esses fluidos diferem, o usuário deve recalibrar. Ao utilizar as pontas AFM em líquido, a frequência medida pelo sistema deve ser de um quarto a um terço da frequência de ressonância natural denotada pelo fabricante. Uma boa maneira de verificar se o sistema calibrado a ponta corretamente é verificar valores dentro do arquivo de ruído térmico gerado. Certifique-se de que este arquivo salva na pasta apropriada. Se o sistema tiver problemas para calibrar ou valores não prováveis sair, recalibrar ou ajustar ligeiramente a posição do laser, então recalibrar.

Outra causa de sinal de soma ruim pode ser devido ao alinhamento cantilever AFM. Quando o chip AFM é montado no bloco de vidro, é essencial que a ponta do cantilever permaneça dentro da pequena janela laser (área de vidro liso). Se o chip estiver muito para a frente, o ângulo em que o cantilever naturalmente descansa pode causar um problema com o reflexo fora do cantilever, faltando o fotodetetor e resultando em sinal de soma ruim. Se o chip estiver muito atrás, o laser será incapaz de refletir na parte de trás do cantilever, causando um sinal de soma ruim. Por essas razões, o chip AFM montado pode precisar ser ajustado. Além disso, outra questão que pode ser encontrada ocorre com a altura da amostra. O instrumento AFM utilizado neste protocolo tem uma faixa máxima de piezo z (altura) de 15 μm. Se um usuário descobrir que o software é incapaz de coletar os dados de altura e forçar mapas em um determinado pixel, uma caixa preta aparecerá indicando que o sistema está fora de alcance(Figura 2C). Uma maneira de resolver esse problema é definir a altura piezo a um valor mais baixo, como 2 ou 3 μm para que a maior parte da faixa de 15 μm esteja comprometida em mapear a altura prevista da célula. Esta técnica deve, na maioria dos experimentos relacionados com células ou bactérias, corrigir o problema associado à faixa z.

Experimentalistas que requerem uma faixa z estendida para amostras altas com alturas superiores a 10 – 15 μm podem precisar buscar um módulo adicional no AFM. Os fabricantes da AFM têm essa opção disponível a custos adicionais para a maioria dos sistemas. Ao estender a faixa z, o experimentalista tem a disponibilidade para digitalizar amostras que são consideradas altas na microes escala com pequenos problemas para valores fora do alcance ou modificação do motor AFM piezo. Embora esses módulos custem extra, alguns, dependendo do fabricante, podem oferecer altura adicional, até 100 μm na direção z. A confocal ainda é possível com amostras mais altas se o usuário tiver uma longa distância de trabalho, objetivo de alta ampliação ou estiver disposto a usar um objetivo de ar, talvez um 20x ou 40x. Ao diminuir a ampliação objetiva do microscópio, a distância de trabalho aumenta, ganhando distância para ver o ápice de uma amostra mais alta. Esta modificação a um objetivo de ampliação mais baixa sacrificará a resolução. Na configuração Conpokal referida neste manuscrito, o objetivo de 60x TIRF (fluorescência de reflexão interna total) tem uma distância de trabalho de quase 100 μm após o deslizamento de cobertura do prato de amostra com fundo de vidro.

Em relação ao microscópio confocal referido neste manuscrito, algumas estipulações importantes são discutidas. O sistema confocal utilizado para a produção dos números deste manuscrito implementou um objetivo de óleo TIRF 60x com uma abertura numérica de 1,49. Linhas laser a 405 nm, 488 nm e 561 nm comprimentos de onda de excitação foram usados para imagens de amostras de células vivas, mostradas na Figura 3 e Figura 4. O limite de difração do microscópio confocal pode ser determinado usando a equação da Resolução Abbe, Resolução de Abbe(x,y) = λ/2NA, onde λ é o comprimento de onda de excitação para Alexa 488, a 488 nm, e NA é a abertura numérica para o condensador confocal, que é 0,3. Portanto, é determinada uma resolução axial de 272 nm. Para a imagem de epifluorescência, dois casos são considerados para determinar a resolução onde o orifício está definido para uma unidade arejada (UA) e 0,5 UA. Neste último caso, o orifício é fechado de tal forma que ocorre perda significativa de luz, mas a resolução aumenta. O software confocal calcula resoluções nativas nativas laterais e axiais em 170 nm e 290 nm para o pinhole a 0,5 UA, e 200 nm e 370 nm para o pinhole a 1 AU, respectivamente. Aberrações esféricas introduzidas no sistema podem ser contabilizadas através de um processo de desconvolução para aumentar o contraste e a resolução em imagens de microscópio. Devido às limitações de difração inerentes aos microscópios confocal, a imagem confocal da colônia bacteriana na Figura 6 carece da resolução correspondente para os detalhes vistos na varredura AFM de bactérias na Figura 5. A AFM fornece acesso a recursos nanoescalas e detalhes difíceis de capturar com um microscópio confocal. No entanto, dependendo da resolução de fluorescência necessária, a Figura 5 e a Figura 6 demonstram a aplicabilidade da técnica Conpokal aos micróbios, além das células eucarióticas.

Uma vantagem do uso de um microscópio confocal permite ao operador coletar imagens 3D de regiões específicas em uma amostra com detalhes aguçados. Essas imagens se correlacionam com o AFM visualizando a superfície que foi sondada através da imagem AFM e uma varredura confocal da mesma região. Uma vez que o microscópio é invertido, uma imagem de epifluorescência coleta informações de luz do lado oposto da amostra que foi sondada. O orifício dentro do sistema confocal ajuda a limitar a um único plano a uma certa distância enquanto filtra a luz que vem do resto da amostra ou até mesmo da sala. Essencialmente, o orifício ajuda a isolar a luz que volta do plano único de interesse na amostra. Normalmente, este plano de interesse deve conter fortes marcadores fluoróforos porque, para sistemas confocal invertidos, a detecção de moléculas únicas seria limitada a microscópios confocal de maior resolução. A iluminação da epifluorescência é menos desejável devido ao fato de que, no modo de imagem de epifluorescência, qualquer luz da amostra que se reflete no objetivo é coletada e usada para gerar a imagem, portanto, impossível de isolar um único plano. As técnicas confocal fornecem uma imagem de plano único mais isolada do recurso amostral em questão por causa do pinhole⁷⁷. Se, por exemplo, o ápice de uma célula eucariótica for sondado pela AFM, essa mesma superfície pode ser isolada com as capacidades confocal de varredura a laser do microscópio, em vez de com o modo de imagem de epifluorescência. Recomenda-se monitorar a saúde/forma das células durante a aquisição de dados via imagem simultaneamente no modo de contraste de interferência diferencial com o auxílio do detector de luz transmitido e da linha laser de 488 nm. Ao capturar uma pilha z da amostra, para o procedimento detalhado acima, apenas o ganho do detector é ajustado. Qualquer alteração morfológica nas células durante a medição, que não é necessariamente visível nos canais fluorescentes, indica que artefatos são introduzidos na medição.

O espaçamento ideal entre os planos pode ser obtido seguindo a recomendação do software para o menor comprimento de onda usado na técnica de imagem. A resolução nativa e a relação sinal/ruído nos volumes de imagem podem ser efetivamente melhoradas empregando algoritmos de desconvolução disponíveis no módulo de processamento de imagens do software de aquisição. No entanto, realizando microscopia fluorescente, a seleção de manchas e corantes específicos é vital para evitar branqueamento precoce no set ou crosstalk de espectros de excitação/emissão sobrepostos. Na ocasião, um usuário pode sofrer um mau funcionamento na geração de luz confocal. Se um usuário experimenta uma falta de emissão de luz ou linhas laser com defeito, uma maneira de solucionar problemas é redefinir o sistema, normalmente feito pela reinicialização do software operacional. Se o problema persistir, o detector de luz transmitido pode ter falhado em entrar ou sair do lugar dentro do caminho óptico do microscópio de luz. Redefinir a posição do detector de transmissores pode ajudar a aliviar problemas de coleta de luz ou imagens a laser.

O foco do instrumento Conpokal é fornecer aos usuários a capacidade de coletar informações ópticas e baseadas em força em biomateriais vivos em um ambiente líquido, simultaneamente e no mesmo celular ou recurso. Este trabalho descreve explicitamente como realizar esses experimentos em líquido, um lar natural para muitos biomateriais, embora, experimentos secos ainda possam ser realizados usando a instrumentação. Com amostras preparadas em pratos de Petri, a altura da placa é uma limitação. Devido à configuração do bloco de vidro que contém o cantilever AFM, as paredes laterais dos pratos devem estar abaixo de 10 mm de altura; se o prato for muito alto, o instrumento não será capaz de baixar a ponta AFM para a superfície da amostra ou do substrato.

Embora exista uma limitação para o tamanho da amostra, não há limitação com os recursos do instrumento ou software no que diz respeito a um atraso de tempo. Confocal simultâneo e AFM é possível com os fatores certos no lugar. A limitação que contribui para sua capacidade quase simultânea refere-se ao ruído gerado ao executar certas funções de microscopia confocal e funções de microscopia de força atômica simultaneamente. As vibrações dos motores que movem o objetivo do microscópio durante a coleta de uma pilha z serão adicionadas ao sinal da ponta da sonda AFM durante seu movimento. O ruído será reforçado por um objetivo de óleo, à medida que os motores se movem para cima e para baixo na direção z para iluminar os planos sequenciais na amostra. Portanto, o protocolo recomendado inclui coleta sequencial de varreduras AFM e imagens de pilha z confocal. ClSM e AFM simultâneos exigiriam imagens estacionárias com o confocal, no entanto, com a técnica atual, o tempo de atraso para os dois instrumentos poderia ser tão curto quanto dezenas de segundos. O tempo real para mudar da operação AFM para a imagem confocal foi em torno de 2 – 4 minutos para as imagens coletadas na Figura 2A e Figura 4B. Esse valor foi determinado subtraindo os dois períodos de tempo de coleta de imagens a partir do tempo total de 33 minutos, o que inclui o tempo para iniciar e completar a varredura AFM, alternar os modos de instrumento para ativar a imagem confocal e iniciar e completar a pilha z de imagem confocal.

O futuro da Conpokal visa explorar novas relações estrutura-função, além de uma visão aguçada dos processos de célula única. Por exemplo, a experimentação de tratamentos medicamentosos in situ em amostras celulares ou bacterianas para determinar os efeitos da elasticidade celular seria um avanço para os campos de biomateriais, biologia e biomecânica. A terapia de tratamento no prato amostral enquanto a imagem e a sondagem forneceriam conhecimento de como a amostra responde à terapêutica em um ambiente vivo e cuidadosamente controlado, ao longo do tempo. Incorporar uma nova droga ou desafio ambiental ampliaria a compreensão de como a localização do citoesqueleto ou organela afeta a locomoção, topologia, rigidez, etc. Outro potencial avanço da Conpokal é a capacidade de ter controle ambiental completo do sistema. O Conpokal atual mencionado neste protocolo está alojado dentro de um gabinete acústico projetado para reduzir o ruído de dentro do laboratório. O avanço desta habitação forneceria a capacidade de testar dentro, talvez, de uma ou uma combinação de fatores, não se limitando àqueles como um ambiente estéril, controlado pela temperatura ou mesmo gravidade variável. Do jeito que está, o método Conpokal fornece uma abordagem eficaz e útil para caracterizar biomateriais vivos e líquidos, mas o futuro da técnica só avançará ainda mais nessas capacidades.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Invólucro Acústico	JPK-Bruker	Invólucro Acústico	usado para mitigar o ruído
BioTracker 488 Corante de citoesqueleto de microtúbulos verdes	Millipore Sigma	SCT142	Usado para rotular microtúbulos em células de mamíferos
CP-qp-CONT-BSG AFM dicas	NanoAndMore	CP-qp-CONT-BSG-B	Pontas colódicas AFM boas para medições de módulo em amostras
biológicasPerclorato de Dil Stain (1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina («DiI»; DiIC18(3)))	ThermoFischer Scientific	D282	Usado para marcar a membrana plasmática de células de mamíferos
Meio de Águia Modificado de Dulbecco	VWR	VWRL0100-0500	Componente de meios de cultura de células
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco	ThermoFisher Scientific	A1285601	Usado para simular ambiente biológico
Soro Fetal Bovino	Fischer Scientific	45000-736	Componente dos meios de cultura celular
Fisher BioReagents Microbiologia Meios Aditivos: Extrato de levedura	Fischer Scientific	BP1422-500	Componente do meio de cultura bacteriana
Prato de cultura de células FluoroDish World	Precision Instruments (WPI)	FD35-100	Pratos com fundo de vidro cujas paredes laterais são inferiores a 10 mm, necessários para o pleno funcionamento do ácido nucleico Nanowizard 4a AFM
Hoechst 33342 mancha	ThermoFischer Scientific	62249	Usado para marcar o núcleo de células de mamíferos, um bom marcador nuclear para células vivas
Rim embrionário humano 293 células	ATCC Global Bioresource Center	CRL-1573	Células de mamíferos usadas no protocolo
Matrigel	VWR	47743-716	Revestimento em placa de cultura de células
Modelo: PFQNM-LC-A-CAL Pontas	AFM Bruker	PFQNM-LC-A-CAL	Pontas do AFM que trabalham bem para as amostras que têm grandes alturas (tais como pilhas eucarióticas)
NanoWizard 4a	JPK-Bruker	NanoWizard 4a
AFM Nikon A1 Microscópio Confocal da exploração do laser	Nikon	A1 Microscópio de Nikon A1 HD25	usado para o campo claro, a epi-fluorescência, e a imagem latente confocal
PENICILINA/STREPTOMYCIN	VWR	16777-164	Componente dos meios
de cultura de pilhaPetriDishHeater	JPK-Bruker	PetriDishHeater	Mantém a temperatura desejada da amostra da placa de Petri
qp-BioAC-Cl AFM dicas	Nanosensors	qp-BioAC-Cl-10	Três cantilevers diferentes do AFM da rigidez de variação
Pinças substituíveis da ponta da fibra do carbono	Ted Pella Inc.	5051	usado para colocar e remover cuidadosamente delicadas pontas AFM no bloco de montagem de vidro
Todd Hewitt caldo bacto	BD DIFCO Bacterius Ltd	Bacto-249240	Componente do meio de cultura bacteriana
Vancomicina, BODIPY FL conjugado	Thermo Fisher Scientific	V34850	Usado para marcar fluorescentemente a parede celular bacteriana