Method Article

成人ヒト脳組織からのヒトミクログリアの取得

DOI:

10.3791/61438

⸱

August 30th, 2020

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1Department of Bioscience and Bioengineering, Indian Institute of Technology Jodhpur, 2Department of Neurosurgery, All India Institute of Medical Sciences Jodhpur

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、生きている、大人、人間の脳組織から原発ミクログリアを単離する効率的で費用対効果が高く、堅牢な方法です。孤立した原発性ヒトミクログリアは、恒常性および疾患における細胞プロセスを研究するためのツールとして役立つ。

Abstract

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ミクログリアは中枢神経系の自然免疫細胞(CNS)に居住している。ミクログリアは、発達中、恒常性維持、感染または傷害の間に重要な役割を果たす。いくつかの独立した研究グループは、ミクログリアが自己免疫疾患、自己炎症性症候群および癌において果たす中心的な役割を強調している。いくつかの神経疾患におけるミクログリアの活性化は、病原性プロセスに直接関与する可能性があります。原発性ミクログリアは、脳内の免疫応答、細胞と細胞の相互作用、疾患における調節不全ミクログリア型を理解するための強力なツールです。一次ミクログリアは、不死化ミクログリア細胞株よりもビボミクログリア特性を模倣する。ヒト成人ミクログリアは、ヒト胎児およびげっ歯類ミクログリアと比較して、異なる特性を示す。このプロトコルは、成人の人間の脳から原発性ミクログリアを分離するための効率的な方法を提供する。これらのミクログリアを研究することは、オリゴデンドロサイト、ニューロンおよびアストロサイトを含むCNSにおけるミクログリアと他の居住細胞集団との間の細胞細胞相互作用に関する重要な洞察を提供することができる。さらに、異なる人間の脳からのミクログリアは、個別化された医療のためのユニークな免疫応答の特徴付けと無数の治療用途のために培養することができる。

Introduction

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中枢神経系(CNS)は、ニューロンとグリア細胞の複雑なネットワーク1で構成されている。グリア細胞の中でも、ミクログリアはCNS2,3,3の自然免疫細胞として機能する。ミクログリアは健康なCNS4で恒常性を維持する責任があります。ミクログリアはまた、シナプス2を剪定することによって、神経発達において重要な役割を果たす。ミクログリアは、含むが、制限されていないいくつかの神経疾患の病態生理学の中心です。アルツハイマー病5、パーキンソン病6、脳卒中7、多発性硬化症8、外傷性脳損傷9、神経因性疼痛10、脊髄損傷11および神経膠腫などの脳腫瘍12。

CNS恒常性および疾患に関する研究は、コスト効率が良く、時間効率の高いヒト原発性ミクログリア分離プロトコル....

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Protocol

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すべての組織は、インド工科大学ジョードプルと全インド医科学研究所(AIIMS)ジョードプルの研究所倫理委員会からの倫理的クリアランスの後に取得されました。

1.組織の獲得と処理(0日目)

  1. 10 mLの氷冷人工脳脊髄液(aCSF)を含む50 mLチューブに組織を収集する(2 mM CaCl2∙2H2O、10 mMグルコース、3 mM KCl、26 mM NaHCO 3、2.5 mM NaH2PO4、1mM MgCl2∙6H2O、202 mmmscesce)320組織を別の場所に移す必要がある場合は、チューブが氷の上に保たれていることを確認してください。
    注:オートクレーブ蒸留水でaCSFを準備してください。ラミナーフードの0.22 μmシリンジフィルターでフィルターします。4°Cで1ヶ月間保存できます。
  2. 70%アルコールで回収管を丁寧に拭き取り、無菌層空気流室に移します。
  3. aCSFを慎重に廃棄し、無菌状態で組織を計量します。組織の重量は、その後のステップに必要なトリプシン-EDTAの体積を計算するために不可欠です。
  4. 37°Cで5分間、新鮮な温かいaCSFで組織を保ちます。このステップは細胞死を避....

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Results

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上記のプロトコル(図1)を用いることで、生きた外科的に切除された脳組織から原発ヒトミクログリアを分離することができた。培養細胞は、ミクログリア(緑色)のリシヌスコミュニス凝集剤-1(RCA-1)レクチン(緑色)と、前述の22、23、24、25、26,23,24,25,26のようにアストロサイトのグリア性フィブリラリー酸性タンパク質(図2)を用いて染色した。4',6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)を使用して、核(青)を染色した。実験開始から6日目に、細胞はさらなる実験の準備ができていた。染色された細胞は、.......

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Discussion

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ミクログリアは、正常な脳における恒常性を確保し、様々な神経疾患の病態生理学において中心的な役割を果たす4.ミクログリアは、シナプス2の神経発達と形成の中心である。ミクログリア研究は、多様な神経疾患の発症と進行を理解する上で極めて重要であることが証明されている 4.げっ歯類ミクログリアは、一次ミクログリア研究のための選択の一般的なモデルですが、しかし、げっ歯類ミクログリアは重要な側面で一次ヒトミクログリアとは異なります13.一次ヒトミクログリアを分離するための費用対効果の高い、高収量のプロトコルの開発は、このギャップを埋めるのに役立つ可能性があります。我々は、生きている、外科的に切除された、成人、人間の脳組織から原発性ヒトミクログリアを単離するためのプロトコルを開発した。7日目 に確認した約80%のミクログリア純度を達成することができました。

プロトコルの最も重要なステップ.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SJの研究所は、IITJの機関補助金を受けて設立され、バイオテクノロジー省(BT/PR12831/MED/30/10/1089/2015)とインド電子情報技術省(No.4(16)/2019-ITEA)からの助成金を受けています。ヒトの脳組織切片は、全インド医科学研究所(AIIMS)ジョードプルから制度倫理委員会のクリアランスの後に得られた。デザイン・アンド・アーツ・ソサエティIIT JodhpurのB.Tech学生メンバーであるMayank Rathorに、ビデオ撮影のサポートに感謝します。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
抗生物質-抗真菌剤溶液HimediaA002
カルシウムSigma223506
遠心分離機(4°C;C)シグマ146532
遠心分離管腹部P10203
CO2インキュベーターニューブランスウィックギャラクシー170 S
D-グルコースHimedia GRM077
グルタミン入りDMEM培地HimediaAL007S
ウシ胎児血清HimediaRM9955
フラコンチューブ(50 ml)Thermo Fsiher Scientific 50CD1058
フルオレセイン Ricinus communis 凝集素-1ベクターFL-1081
蛍光顕微鏡ライカDM2000LED
フルオロシールド DAPIシグマF6057
GFAP抗体GA53670S
インキュベーター シェーカーニューブランスウィック サイエンティフィックイノーバ 42
L929ATCCNCTCクローン929細胞株 [L細胞、L-929、L株の誘導体] (ATCC CCL-1)
層流Thermo Fsiher Scientific 1386
マグネシウムHimediaMB040
ナトリウムメルク
栄養混合物F-12ハム培地HimediaAl106S
シャーデュラングループ237554805
リン酸塩緩衝生理食塩水HimediaML023
カリウムHimediaMB043
血清ピペット実験器具LW-SP1010
重炭酸ナトリウムHimediaMB045
ショ糖HimediaMB025
シリンジフィルター (0.2μ;、直径 25 mm)AxivaSFPV25R
T-25 接着細胞培養に適したフラスコ。HimediaTCG4-20X10NO
トリプシン-EDTA (0.25%)Gibco 〒25200-056
塩化塩化リン酸567545レ塩化

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allen, N. J., Barres, B. A. Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
  2. Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9

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Human MicrogliaBrain Tissue IsolationTissue DigestionTrypsin EDTACell CultureImmunocytochemistryPrimary Cell IsolationCell HarvestingCentrifugation ProtocolMicroglia Characterization

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