Kvantificering af celleunderlagsadhæsionsområde og celleformfordelinger i MCF7-cellemonolag

Summary

Artiklen beskriver kvantificering af 1) størrelsen og antallet af fokale sammenvoksninger og 2) celleform indeks og dens fordeling fra konfokale billeder af sammenløbet monolayers af MCF7 celler.

Abstract

De metoder, der præsenteres her kvantificere nogle parametre for sammenfaldende klæbende celle monolag fra flere passende farvede konfokale billeder: vedhæftning til substratet som en funktion af antallet og størrelsen af fokale sammenvoksninger, og celle form, karakteriseret ved celleform indeks og andre form deskriptorer. Fokale sammenvoksninger blev visualiseret af paxillin farvning og celle-celle grænser var præget af krydset plakoglobin og actin. Metoderne til cellekultur og farvning var standard; billeder repræsenterer enkelte brændpunkter; billedanalyse blev udført ved hjælp af offentligt tilgængelig billedbehandlingssoftware. De præsenterede protokoller bruges til at kvantificere antallet og størrelsen af fokale sammenvoksninger og forskellene i celleformfordeling i monolagene, men de kan repurposed til kvantificering af størrelsen og formen af enhver anden særskilt cellulær struktur, der kan farves (f.eks mitokondrier eller kerner). Vurdering af disse parametre er vigtig i karakteriseringen af de dynamiske kræfter i klæbende cellelag, herunder celleadhæsion og actomyosin-kontraktilitet, der påvirker celleformen.

Introduction

Epitelcellemonolayers fungerer som et kollektiv , hvor celle - og celleunderlag vedhæftning samt kontraktile kræfter og spændinger repræsenterer vigtige parametre , og deres rette balance bidrager til enhed¹,^2,3's overordnede integritet . Derfor repræsenterer en vurdering af disse parametre en måde at fastslå cellelagets aktuelle status på.

De to metoder, der er beskrevet her repræsenterer en to-dimensionel analyse af sammenløbet monolag af klæbende, epitelceller (i dette tilfælde MCF7 brystkræft cellelinje). Analysen udføres ved hjælp af konfokale billeder (enkelte Z-udsnit) fra forskellige områder på Z-aksen; basalområde nær et substrat til fokal vedhæftningsmålinger (FA) og apical region for celleformmålinger. De præsenterede metoder er relativt enkle og kræver standard laboratorieteknikker og open source-software. Konfokal mikroskopi er tilstrækkelig til denne protokol, så det kan udføres uden at anvende mere specialiseret TIRF (Total Internal Reflection Fluorescens) mikroskopi. Protokollen kan således gennemføres i et relativt standardlaboratorium. Selv om nøjagtigheden af metoderne er begrænset, kan de skelne grundlæggende forskelle i fokal vedhæftning og celleform.

Begge metoder, der er beskrevet her, består af standardforsøgsprocedurer såsom cellekultning, immunstaining, konfokal billeddannelse og billedanalyse udført ved hjælp af ImageJ. Der kan dog bruges billedbehandlingssoftware med de relevante funktioner. De præsenterede metoder kan spore og sammenligne ændringer forårsaget af farmakologisk behandling eller minimal genetisk modifikation. Det anbefales ikke at opnå bestemte værdier på grund af disse metoders begrænsede præcision. To automatiserede makroer blev inkluderet, for at lette målinger af mange billeder.

Protocol

1. Forberedende skridt

1. Cellesåning for at opnå sammenløbende monolag
   1. Før såning, pels brøndene i en 4-brønde kammer dias med kollagen I (eller anden ECM komponent valg). For kollagen I belægning, følg en kommerciel protokol: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html ved en koncentration på 8 μg/cm².
   2. Seed 400.000 celler til en brønd af en 4-brønd kammer dias.
   3. Cellerne dyrkes i 24 timer (eller længere, afhængigt af de eksperimentelle endepunkter), før farvningen, i en inkubator ved 37 °C, 5% CO₂. Dette trin giver mulighed for modning af celle-celle kontakter og dannelsen af monolag.
   4. Brug et optisk, omvendt mikroskop til at kontrollere sammenløbet (ca. 90% er påkrævet) og en generel tilstand af monolag. Fortsæt ikke, hvis cellerne flyder eller ser stressede ud.
2. Immunfluorescerende farvning
   BEMÆRK: Celler kan farves med en foretrukne protokol. Her blev immunfluorescens udført som tidligere beskrevet⁴.
   1. For fokal vedhæftning analyse, plet cellerne med en fokal vedhæftning protein valg (i denne protokol paxillin). Til celleform analyse plet med celle-celle krydset protein valg (i denne protokol desmosomal protein plakoglobin).
   2. Ved proceduren anvendes 0,5 ml specificerede opløsninger, medmindre andet er angivet.
   3. Fastgør celler i 4% formaldehyd i PBS i 30 min. på is.
   4. Inkuber med 0,1 M ammoniumchlorid (i PBS) i 10 min for at slukke automatisk fluorescens.
   5. Tilsæt 0,5% Triton X-100 (i PBS) i 30 min (permeabilisering).
   6. Blok med 5% mælk (eller 1% BSA) i TBS-T i 1 time.
   7. Inkuber med primær antistof ved 4 °C natten over (anti-paxillin: kanin, 1:250, anti-plakoglobin: kanin, 1:400)
   8. Incubate med sekundært antistof i 30 min (Alexa Fluor 594 gede anti-kanin, 1:500, 1:500)
   9. Pletten med 300 nM DAPI i 1-5 min, beskyttet mod lys.
      BEMÆRK: Eventuelt kan der udføres yderligere farvning af actin med fluorescerende falloidinkonjugater (konjugater i 1:400). phalloidin tilsættes på samme trin som det sekundære antistof.
3. Konfokal billeddannelse
   1. Tag billeder af enkelte Z-skiver ved hjælp af et konfokalt mikroskop (f.eks. Zeiss LSM800).
      BEMÆRK: Valgfri farvning kan hjælpe med at vurdere det korrekte fokusplan. Kortikal actin farvning er til stede i den apikale region, mens actin stress fibre er til stede i den basale region, nær substratet, som illustreret på figur 1.
   2. Billeddannelse af adhæsion
      1. Vælg Z-skiver til fokal vedhæftningsanalyse fra basalområdet tæt på underlaget.
      2. Brug en målsætning med den højeste numeriske blænde (helst 63x N.A.: 1.4).
         BEMÆRK: Formen af FA er meget specifik og let genkendelig. Det anbefales således at starte scanningen fra et brændpunktsplan under cellerne og derefter langsomt scanne mod dem, indtil Finanstilsynet er klart synlige. Billedanalyse vil være mere præcis fra mindre synsfelter, som har tendens til at være mere ensartet, men dette indebærer, at færre celler vil blive beregnet i et enkelt synsfelt.
   3. Billeddannelse af celleceller
      1. Brug en 40x eller 63x målsætning.
      2. Vælg kanaler til nuklear farvning og den foretrukne junction protein farvning.
      3. Vælg Z-udsnit til celleformanalyse fra monolagenes apikale område.
      4. Tag billeder til mindst 3 forskellige synsfelter (200-400 celler).

2. Billedanalyse

BEMÆRK: Forudsat makroer arbejde optimalt på ImageJ version 1.50f eller nyere. Bruges kun til kvantificering af billeder med et højt signal-støj-forhold og uden under- eller overmættede pixel. De beskrevne metoder omfatter trin, der kræver manuel parameterjustering. Således anbefales en blind analyse / blindet eksperiment opsætning. Til kryptering af billedfilnavne kan ImageJ-plugins som "Blind Analysis Tool" (tilgængelig på: https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools) bruges.

1. Analyse af adhæsion
   BEMÆRK: De anbefalede inputfiler til følgende metoder er: billeder af 3'er, der er repræsenteret i 8-bit gråtoneskala, der er gemt i .tiff-format.
   1. Åbn billede ved hjælp af ImageJ.
   2. Indstil skalaen for et billede til pixel (Analysér | Angiv skala; Fjern indstillingen Skaler og markér global).
   3. Medtag filnavnet og det område af investeringsafkastet i måleindstillinger (Analysér | Sæt målinger...); kontrol indstillinger for område og visningsetiket.
   4. Træk baggrund fra( Proces | Trække baggrund fra. indstille rullende kugleradiusparameter til 50 pixel; kontrol Glidende paraboloid mulighed). Hvis der er tale om pseudofarvede RGB-billeder: opdelte RGB-kanaler, skal du lade kanalen med åbnede FAs lukkes, lukke de resterende kanaler (Billede | Farve | Opdelte kanaler).
   5. Bestem arealet af den mindste interesseregion. Brug af frihånds- eller polygonvalg skitserer den mindste fokuskant og mål dens område (Analysér | Mål). Gentag dette trin for forskellige PI'er fra nogle få tilfældigt udvalgte billeder (for i alt 20 ROI'er). Beregn og gem gennemsnit af opnåede resultater.
      BEMÆRK: Dette trin er kun påkrævet, når et givet sæt billeder analyseres for første gang (specifik cellelinje, belægningsdias med specifikke ekstracellulære matrixkomponenter, forskellige kulturforhold).
   6. Konverter billedet til binært ved hjælp af en af følgende metoder:
      1. Angiv den globale grænse (Billede | Juster | Tærskel; markér Indstillingerne Standard, B&W og Mørk baggrund, juster tærsklen manuelt, eller indstil den automatisk).
      2. Angiv den lokale grænse(billede | Juster | Automatisk lokal tærskel...; indstille Metode til Phansalkar og kontrollere Hvide objekter på sort baggrund indstilling. Dernæst invertere billedet (Edit | Inverter).
   7. Mål antallet og arealet af ROI'er. Vælg Analysér | Analyser partikler; kontroller Pixel-enheder, Visningsresultater, Ryd resultater og Opsummer indstillinger, angiv størrelsesparameter, som en lavere grænse skal du bruge middelværdien af de mindste ROI'er fra trin 2.1.5. Den øvre grænse kan indstilles til 25 % af et typisk celleområde.
   8. Overfør data (der omfatter billednavn, antal FA'er, total- og middelområde for udligningsbeløb. Slice, Count, Total Area, Average Size Summary
   9. Bestem antallet af celler pr. billede ved at tælle DAPI-farvede kerner. Optælling kan ske manuelt (Plugins | Analysere | Celletæller) eller som i tilgængelige protokoller, f.eks.: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation.
   10. Alternativt kan du bruge den vedhæftede ImageJ-makro (FAs.ijm) for at lette optælling af frihandelsaftaler.
       1. Flyt .ijm-filen med makroen til plug-ins eller makromapper, der er placeret i mapper med Kildefiler i ImageJ.
       2. Bestem et område med det mindste investeringsafkast som beskrevet i trin 2.1.4.
       3. Åbn makrofil (Plugins | Makroer | Rediger...).
       4. Før du kører makroen, skal værdien af tre variabler: fyldværdien for area_of_the_smallest_region_of_interest med et tal, der er anskaffet under trin 2.1.4. Angiv threshold_type værdi til manuel eller automatisk.
       5. Gem ændringer (makroen skal være klar til brug).
       6. Ring til makroen fra panelet Billedj, eller opret en genvej til den. Makroen starter med det åbne standarddialogvindue. Vælg det billede, der skal behandles.
          BEMÆRK: I tilfælde af manuel tærskeljustering kræves manuel bekræftelse af tærskelværdien (undgå at acceptere ændringer ved hjælp af knappen Anvend tærskel i dialogvinduet Handling påkrævet i stedet). Resultater, der opnås ved at arbejde med makroen, er de samme som dem, der er beskrevet i trin 2.1.8 (inkluderet i dialogboksen Oversigt). I tilfælde af manuel tærskeljustering vises lavere tærskelniveau desuden i et logdialogvindue, da denne værdi gør det muligt at reproducere opnåede resultater i fremtiden, hvis det er nødvendigt. Log Supplerende tal S1 og S2 blev medtaget som et træningsdatasæt for FAs.ijm-makroen.
2. Analyse af cellefigur
   1. Manuel
      1. Åbn et billede i ImageJ eller en anden billedbehandlingssoftware med et lignende sæt funktioner (yderligere instruktioner vedrører ImageJ). Vælg de parametre, der skal måles, ved at vælge i menuen Analyse | Angiv Mål og tikkende Figurbeskrivelser i det afkrydsningsfeltet vises.
      2. Manuelt afgrænse cellekanter, markeret med krydset protein (r) valg, ved hjælp af Freehand valg ikon. De valgte parametre beregnes automatisk for hver celle. Gem resultaterne efter at have skitseret hver celle ved at klikke på Rediger | Udvælgelse | Føj til administrator. Kun fuldstændige, helt synlige celler med uafbrudte kanter skal tælles.
      3. Når alle celler i synsfeltet er skitseret, skal du foretage målingen ved at markere alle de tal, der vises i venstre boks i ROI Manager (svarende til celler), og klikke på Mål mål resultaterne vises i feltet Resultater og kan overføres til det foretrukne regneark.
   2. Automatiseret
      BEMÆRK: For at lette kvantificeringen af celleform deskriptorer (CSI, højde-bredde, rundhed, soliditet) en ImageJ makro er blevet udarbejdet og knyttet til denne artikel (CSI.ijm). Makroen er primært baseret på ImageJ plugin kaldet MorphoLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ)⁵. Makroen udfører følgende trin: 1) Udvidelse af hver kant af billedet med 10 sorte pixel [MorpholibJ]; 2) Dilatationer og erosionsrunder - morfologisk filter [MorpholibJ]; 3) Generering af binært billede af cellergrænser ved morfologiske segmentering [MorpholibJ]; 4) Udvidelse af cellegrænser; 5) Inversion af pixels værdi; 6) Generering af markeringer og måling af område og omkreds af celler på billedet; og 7) Lagring af billede med skitserede celler og Valg af ImageJ-roi til en ny fil.
      1. Flyt .ijm-filen med makroen til mappen plugins eller makroer, der findes i mapperne Med Kildefilerne i ImageJ. Kald makroen fra panelet Billedret, eller opret en genvej til den.
      2. Før kvantificeringen af et nyt datasæt skal du bestemme værdierne for de mindste og de største interesseregioner. Kontur (frihånds- eller polygonmarkering) nogle få (3-10) eksempler på de mindste og største celler på billedet og mål derefter deres område (Analysér | Mål).
      3. Du kan også afspille makroen med standardindstillinger (den nederste størrelsesgrænse er indstillet til 0, og den øvre grænse er indstillet til uendelig), vente på, at makroen afsluttes, og vælg Angiv indstillinger for cellestørrelsesgrænser. Mål området for de mindste og de største celler ved at klikke på deres etiket, og tryk derefter på Mål i ImageJ ROI Manager. Angiv værdien af variabler for the_smallest_cell og the_biggest_cell. Gem ændringer, luk alle makrodialogboksvinduer, og afspil makroen igen.
         BEMÆRK: Makroen kan bruges uden at sætte ROI størrelse grænser, men det anbefales ikke, fordi det øger en chance for at måle uhensigtsmæssige cellefragmenter eller celle klynger.
      4. Start makroen med standarddialogvinduet Åbn. Vælg det billede, der skal behandles (gråtoneskala).
      5. Analyser resultaterne. Det output, der leveres af makroen, består af: tabel over resultaterne (celleetiket, billedetiket, celleområde [pixel²], celleomkreds [pixel²], cirkularitet [CSI], højde-bredde- og stund), billede med skitserede celler og listen over valg af investeringsafkast (som også gemmes i ny fil i undermappen Resultater). Resultattabellen kopieres automatisk til brugerens udklipsholder.
         BEMÆRK: Supplerende tal S3 og S4 blev medtaget som et træningsdatasæt for CSI.ijm-makroen.

3. Kvantificering

1. Kvantificering af udligningsbeløb
   1. Beregn det gennemsnitlige FAs-tal og den gennemsnitlige anlægsstørrelse pr. celle/kerner.
      BEMÆRK: For nogle cellelinjer er det muligt at tælle Frihandelsaftaler separat i forskellige celler. For cellelinjer, der har stærke cellecellekontakter og vokser som monolag som MCF7, kan antallet og størrelsen af Frihandelsaftaler pr. celle beregnes ved at dividere de værdier, der er opnået fra Frihandelsaftaler, med antallet af kerner i hele billedet.
   2. Vurder statistisk signifikans af potentielle forskelle mellem populationer (forsøgsgrupper). Afhængigt af dataenes fordeling og varians skal der til sammenligning af de to forskellige grupper anvendes Student t-test (normal distribution) eller ikke-parametrisk U-test (Mann-Whitney). Til sammenligning af flere grupper bruger envejs ANOVA eller Kruskal-Wallis sammen med de relevante post-hoc test.
2. Analyse af cellefigur
   1. Beregning af figurbeskrivelser
      1. Manuel analyse: Beregn celleformindeks (CSI, også kaldet cirkularitet eller celleform) i det foretrukne regneark for hver målt celle fra det relevante område og omkreds ved hjælp af formlen:
         
         BEMÆRK: CSI antager værdier mellem 1 (cirkulær) og 0 (aflang). Eksemplerne på forskellige celleformer (med samme område) og deres respektive repræsentanterne for repræsentanterne for 2 vises i figur 2. I automatiseret analyse beregnes værdierne af formbeskrivelser (hyret og defineret nedenfor) automatisk og vises i resultatfeltet:
         1) CSI = 4π*areal/(omkreds)²
         (2) AR = hovedakse/mindre akse
         (3) Rundhed = 4*areal/π*(hovedakse)²
         (4) Soliditet = areal/konvekst område
   2. Histogrammer af celleformfordeling
      1. Plot celleformfordeling som et histogram af cirkularitet (CSI). Klassificere celler i henhold til deres CSI-værdi (beregnet for mindst 200-400 celler) til et af de ti ensartede intervaller (interval: 0-1, placeringsbredde: 0,1). Histogrammet viser antallet af celler i hver kategori.
         BEMÆRK: Histogrammet, der viser formfordelingen af det typiske MCF7-cellelag, viser et højdepunkt på omkring 0,7-0,8 CSI. Hvis cellernes form fordrejes af en faktor (f.eks. paclitaxelbehandling, som forårsager G2/M faseartætning, og i konsekvens flere celler er runde), bør det afspejles på histogrammet.
   3. Kumulative fordelingsparceller
      1. Sammenlign kumulative CSI-fordelinger for hver cellelinje, fordi det er den bedste måde at vurdere statistisk vigtige forskelle i celleformændringer (eller andre ændringer i distributionen. Det kan f.eks.
      2. Beregn cdf-funktionen (Kumulativ fordeling) for at sammenligne fordelinger. CDF tildeler for en given CSI-værdi (afbildet på X-akse) den procentdel (eller relative antal), for hvilken alle værdier er mindre eller lig med denne CSI-værdi (afbildet på Y-akse). Efterhånden som CSI-værdien bliver højere, bliver procentdelen af det sæt værdier, der er mindre eller lig med denne værdi, således også højere. CDF kan beregnes ved hjælp af den foretrukne statistiske software eller manuelt.
      3. Til statistisk analyse skal du bruge Kolgomorov-Smirnov nonparametrisk test.

Representative Results

Analyse af adhæsion
Knockdown af HAX1-genet har tidligere vist sig at påvirke fokale sammenvoksninger⁶. Celler blev dyrket på kollagen I-belagt overflade for 48 h. Billeder af MCF7 kontrolceller og MCF7 celler med en HAX1 knockdown(HAX1 KD) fra tre uafhængige eksperimenter farves med fokal vedhæftning protein paxillin blev opnået ved hjælp af en konfokal mikroskop (billede fra enkelt brændvidde / Z-slice fra basal region). 3-2.500 celler fra hver cellelinje blev kvantificeret ved hjælp af den beskrevne protokol. Middelværdien for den mindste fokale vedhæftning blev sat til 50 (pixel²). Repræsentative billeder af FAs tæller med ImageJ, herunder de endelige, nummererede konturer og overlejringen af frihandelsaftalerne med det oprindelige billede, vises for begge cellelinjer på figur 3A. Forskelle i antal og størrelse af frihandelsaftaler i begge cellelinjer er præsenteret på figur 3B.

Analyse af cellefigur
Manuel vurdering: MCF7-celler blev dyrket i 24 timer, mediet blev udskiftet med det samme friske medium (ubehandlet) eller mediet med 0,1 μM paclitaxel (PTX) – for at fremkalde celleafrunding - og dyrket i yderligere 24 timer. Billeder af sammenløbet MCF7 monolag plettet med anti-plakoglobin antistof og DAPI blev opnået ved hjælp af et konfokalisk mikroskop (enkelt Z-slice fra apical region). Omkring 200-400 celler (2-3 synsfelter) fra hvert eksperiment (ubehandlet/behandlet) blev dokumenteret (40x mål), og billederne blev vurderet ved hjælp af ImageJ billedbehandling software (Figur 4A). Repræsentative områder af hvert cellelag med skitserede celler er vist i figur 4A (ubehandlede og PTX-behandlede celler). Alle celler blev kategoriseret efter deres CSI-værdier (10 intervaller, placeringsbredde 0,1) og præsenteret i de respektive histogrammer (Figur 4B), som viser en stigning i den sidste placering (0,9-1) og udfladningen af de vigtigste toppe (0,6-0,9) for de PTX-behandlede celler, sammenlignet med den ubehandlede kontrol. Forskelle i den kumulative fordeling af CSI blev beregnet for statistisk signifikans ved hjælp af Kolgomorov-Smirnov-testen (K-S), en ikke-parametrisk test af ligheden mellem endimensionale sandsynlighedsfordelinger. Frekvensfordeling histogrammer og kumulative fordeling plots (Figur 4C) blev genereret med software.

Automatiseret vurdering: MCF7 celler blev dyrket i 24 timer, fast og farves med fluorophore-konjugeret falloidin til at visualisere actin. Billeder blev taget ved hjælp af en konfokal mikroskop (enkelt Z-slice fra apikale region). Gråtonebillederne af monolagene blev analyseret ved hjælp af den vedhæftede makrofil i henhold til den medfølgende protokol (Figur 5A-C). I alt blev 512 celler fra 12 synsfelter kvantificeret. Resultaterne blev afbildet som et histogram, der præsenterede fordelingen af cirkularitet (Figur 5D).

Figur 1: Actin farvning med fluorophore-konjugerede falloidin, to forskellige Z-skiver fra samme synsfelt. (A) Den apikale region med kortikale actin. (B) Den basale region med actin stress fibre. Bar: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Eksempler på forskellige CSI-værdier (Cell Shape Index) for figurerne med forskellige omkredse, men det samme område. Den meget aflange form til venstre har CSI tæt på 0, mens den ideelle cirkel til højre har CSI på 1. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Kvantificering af adhæsions vedhæftning. (A) Repræsentative billeder af MCF7-baserede cellelinjer: CONTROL og HAX1 KD plettet med paxillin; fra venstre mod højre: (1) paxillin og kerner (2) skitseret og nummereret FAs (3) overlay af FAs skitserer og det oprindelige billede. Bar: 20 μm. Insets (under hvert billede) viser zoomede områder med bokse. (B) Afbilder, der viser forskellen i Størrelsen og tallet mellem de to cellelinjer. Statistisk signifikans blev vurderet ved hjælp af Student t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Ændringer i celleform forårsaget af paclitaxel (PTX) i MCF7 cellelag; manuel optælling. (A) Repræsentative regioner af MCF7 monolag, celler ubehandlet og behandlet med PTX, plettet med junction protein plakoglobin og DAPI, bar: 20 μm. Panelet til højre viser det billede, der behandles i ImageJ. cellekanter er skitseret, og alle optalte celler er nummererede. (B) Histogrammer, der viser CSI-fordeling i ubehandlede og PTX-behandlede celler, 200-400 celler i hvert forsøg (ubehandlet/behandlet), binbredde: 0,1. Plots blev genereret ved hjælp af frekvensfordelingsanalyse med relative frekvenser som en brøk. (C) Det område, hvor den kumulative fordeling for ubehandlede og PTX-behandlede monolag er beregnet til at foreligget. Statistisk forskel beregnet ved hjælp af Kolgomorov-Smirnov nonparametrisk test (KS). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Celleform i MCF7 monolag vurderet ved hjælp af den automatiserede metode. (A-C) Et eksempel på den automatiserede billedanalyse, der illustrerer efterfølgende trin, der udføres af den vedhæftede makro. (A) Inputbillede; kortikale actin; gråtoner, skala bar 10 μm (til informative formål; skaleringslinjer bør ikke indlejres i analyserede billeder). (B) Cellelag efter segmentering cellekanter, der er skitseret celler uden fuldstændige kanter elimineret. (C) Overlejring af cellen konturer på det oprindelige billede. (D) Et histogram, der viser fordelingen af CSI i det analyserede datasæt, 512 celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur S1, S2: MCF7-celler, paxillin og DAPI-farvede for at visualisere Frihandelsaftaler og kerner. Leveres som et træningsdatasæt for makroen FAs.ijm.
Figur S1: Klik her for at downloade dette tal.
Figur S2: Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur S3, S4: MCF7 celler, plakoglobin og DAPI-farvede til at visualisere celle-celle kryds og kerner. Leveres som et træningsdatasæt for CSI.ijm-makroen.
Figur S3: Klik her for at downloade dette tal.
Figur S4: Klik her for at downloade dette tal.

FAs.txt: Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Celle-celle og celle-substrat vedhæftning udgør iboende attributter af epitelceller og spiller den afgørende rolle i væv morfogenese og embriogenese. I voksne væv den korrekte regulering af mekaniske egenskaber af cellelaget er afgørende for at opretholde homøostase og forebygge patologiske reaktioner som tumor progression og metastase. Størrelsen og antallet af fokale sammenvoksninger afhænger af styrken af celle-substrat vedhæftning, mens celleform afhænger af kontraktile kræfter og er relateret til status for celle-celle-kontakter.

Her beskriver vi to enkle metoder til kvantitativ analyse af området, antallet og formen af cellulære strukturer farves af immunofluorescens, i dette tilfælde fokale sammenvoksninger og hele cellerne i cellelaget. De foreslåede værktøjer kan dog anvendes til kvantificering af en hvilken som helst valgt struktur. Det centrale spørgsmål for disse analyser er kvaliteten af immunfluorescerende farvning og konfokal billeddannelse. Disse metoder kan implementeres i ethvert standardlaboratorium, der er udstyret med en cellekulturenhed og et konfokalt mikroskop. De er designet til at sammenligne cellelinjer, især når forskellene (naturlige eller induceret af specifik behandling) i de målte parametre er betydelige. De anbefales ikke at måle små forskelle eller til at fastsætte absolutte målinger, fordi de er følsomme over for minimale ændringer i de oprindelige vilkårlige indstillinger, især i tilfælde af fokale sammenvoksninger. Denne metode til FAs kvantificering er ringere end mere avancerede og specifikke metoder som TIRF mikroskopi, men det har en fordel ved ikke at kræve avanceret udstyr.

Lignende metoder til foerhæftningsmålinger blev beskrevet før^7,8,9,10. Her har vi angivet indstillingerne og skabt en gratis ImageJ makro, med flere muligheder, for at lette målingerne.

Celleformanalyse blev beskrevet mange gange, herunder meget komplekse og detaljerede metoder^11,12. Her præsenterer vi en enkel metode til at spore ændringerne i epitelcellemonlag, hvilket kan være meget vigtigt for at sammenligne cellemorfologi eller udviklingsændringer. Den manuelle metode til celleformanalyse i de monolag, der præsenteres i denne protokol, blev beskrevet i en tidligere rapport⁶. CSI-formlen som en måde at beskrive og sammenligne formen på et eller flere objekter anvendes i vidt omfang i forskellige discipliner^13,14, herunder geologi, hvorfra det stammer fra. Præsentation af resultaterne i form af et histogram og/eller som en kumulativ fordelingsfunktion anvendes almindeligvis til sammenligning af fordelinger af enhver art^8,10,15.

Især præsenterer vi her et værktøj til den automatiserede celle form analyse baseret på ImageJ plugin MorhpLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ). Vi leverer en makrofil, som kan udføre denne analyse hurtigt og effektivt. Denne metode genkender ikke altid de korrekte cellekanter, men procentdelen af defekte målinger (som er til stede i hver automatiseret analyse) er minimal og bør ikke påvirke det endelige resultat væsentligt, især hvis nok antal celler analyseres. Celler uden fuldstændige kanter fjernes. Automatiseret celle form analyse har ubestridelige fordele, og vi præsenterer denne metode, så det kan blive værdsat af det videnskabelige samfund.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	goat anti-rabbit, 1:500
Ammonium chloride	Sigma	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
Collagen from calf skin	Sigma	C9791-10MG
DAPI	Sigma	D9542	1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
Junction plakoglobin	Cell Signaling	2309S	rabbit, 1:400
Laminar-flow cabinet class 2	Alpina		standard equipment
MCF7-basedHAX1KD cell line	Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019		MCF7 cell line withHAX1knockdown
MCF7 cell line (CONTROL)	ATCC	ATCC HTB-22	epithelial, adherent breast cancer cell line
Olympus CK2 light microscope	Olympus
Paxillin	Abcam	ab32084	rabbit, 1:250, Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
Phalloidin-TRITC conjugate	Sigma	P1951	1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling
PTX	Sigma	T7402-1MG
TBST – NaCl	Sigma	S9888
TBST – Trizma base	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
Zeiss LSM800 Confocal microscope	Zeiss