Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

מודל קסנוגרפט נגזר ממטופל למום ורדי

Published: June 15, 2020 doi: 10.3791/61501
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ליצור מודל קסנוגרפט murine של מום ורדי. מודל זה מבוסס על הזרקה תת עורית של תאים אנדותל נגזר המטופל המכיל HYPER-activating TIE2 ו / או מוטציות גן PIK3CA. נגעים Xenograft מקרוב לסיכום התכונות ההיסטופתולוגיות של רקמת חולה VM.

Abstract

מום ורידים (VM) היא אנומליה כלי דם הנובעת מהתפתחות לקויה של הרשת ורידים וכתוצאה מכך ורידים מורחבים ולעתים קרובות תפקודיים. מטרת מאמר זה היא לתאר בקפידה את הקמתו של מודל xenograft murine המחקה VM אנושי והוא מסוגל לשקף הטרוגניות המטופל. Hyper-activating לא בירושה (סומטי) TEK (TIE2) ומוטציות PIK3CA בתאי אנדותל (EC) זוהו כנהגים העיקריים של הגדלת כלי פתולוגיים ב VM. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד, הטיהור וההרחבה של EC הנגזר ממטופל המביעים מוטציה TIE2 ו/או PIK3CA. EC אלה מוזרקים תת עורית לתוך החלק האחורי של עכברים אתיים immunodeficient כדי ליצור ערוצים כלי דם אקטוטיים. נגעים שנוצרו עם TIE2 או PIK3CA-מוטציה EC הם כלי דם באופן ניכר בתוך 7\u20129 ימים של הזרקה ולתווך מחדש תכונות היסטופתולוגיות של רקמת חולה VM. מודל VM xenograft זה מספק פלטפורמה אמינה לחקור את המנגנונים הסלולריים והמולקולריים המניעים היווצרות VM והרחבה. בנוסף, מודל זה יהיה אינסטרומנטלי עבור מחקרי תרגום בדיקת היעילות של מועמדים לסמים רומן במניעת הגדלת כלי חריג לראות VM האנושי.

Introduction

פגמים בהתפתחות כלי הדם הם הגורם הבסיסי למחלות רבות, כולל מום ורדי (VM). VM היא מחלה מולדת המאופיינת מורפוגנזה חריגה והרחבה של ורידים1. מחקרים חשובים על רקמת VM ותאי אנדותל (EC) זיהו מוטציות רווח-של-תפקוד בשני גנים: TEK, אשר מקודד את קולטן קינאז טירוסין TIE2, ו PIK3CA, אשר מקודד p110α (תת-יחידת קטליטית) איזופורם של PI3-kinase (PI3K)2,,3,,4,,5. מוטציות סומטיות אלה לגרום היפר-הפעלה עצמאית ליגנד של מסלולי איתות אנגיוגני/צמיחה מפתח, כולל PI3K / AKT, וכתוצאה מכך ורידים אקתטייםמורחבים 3. למרות תגליות גנטיות חשובות אלה, המנגנונים הסלולריים והמולקולריים הבאים המפעילים אנגיוגנזה חריגה והיווצרות של ערוצי כלי דם מוגדלים עדיין אינם מובנים במלואם.

במהלך אנגיוגנזה רגילה ופתולוגית, כלי חדשים צומחים מרשת כלי דם קיימת מראש ו-EC עוברים רצף של תהליכים תאיים חשובים כולל התפשטות, הגירה, שיפוץ מטריצה חוץ-תאית (ECM) והווצרות לומן6. שניים ותלת מימדיים (2D/3D) בתרבויות המבחנה של EC הם כלים חשובים לחקור כל אחד ממאפייני הסלולר האלה בנפרד. אף על פי כן, יש דרישה ברורה עבור מודל העכבר recapitulating הרחבת כלי פתולוגי בתוך microenvironment המארח תוך מתן פלטפורמה יעילה להערכה פרה-קלינית של תרופות ממוקדות למחקר תרגום.

עד כה, מודל murine transgenic של VM המשויך TIE2 רווח של פונקציה מוטציות לא דווח. מודלים הנוכחיים עכבר VM transgenic להסתמך על הביטוי בכל מקום או רקמה מוגבלת של המוטציה הפעלת PIK3CA p.H1047R3,5. בעלי חיים טרנסגנים אלה מספקים תובנה משמעותית על כל הגוף או רקמה ספציפית השפעות של מוטציה PIK3CA נקודה חמה זו. המגבלה של מודלים אלה היא היווצרות של רשת כלי דם פתולוגית מאוד וכתוצאה מכך קטלניות מוקדמת. לפיכך, מודלים אלה של העכבר אינם משקפים באופן מלא את המופע הספורדי של אירועי מוטציה ואופי מקומי של פתולוגיית VM.

להיפך, מודלים xenograft נגזר המטופל מבוססים על השתלה או הזרקה של רקמה פתולוגית או תאים נגזר מחולים לעכברים immunodeficient7. מודלים Xenograft הם כלי רב עוצמה כדי להרחיב את הידע על התפתחות מחלות וגילוי של סוכנים טיפוליים רומן8. בנוסף, שימוש בתאים הנגזרים ממטופל מאפשר למדענים להפיק מחדש הטרוגניות מוטציה כדי לחקור את הספקטרום של פנוטיפים המטופל.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול שבו מטופל נגזר VM EC אשר מבטאים צורה מוטציה פעילה באופן זמני של TIE2 ו / או PIK3CA מוזרקים תת עורית בחלק האחורי של עכברים עירום אתימי. תאי כלי דם מוזרקים מושעים במסגרת ECM על מנת לקדם אנגיוגנזה כמתואר בדגמים xenograft כלידם קודמים 9,10,11. אלה VM EC לעבור מורפוגנזה משמעותית וליצור מוגדל, כלי פתולוגיים סוטה בהיעדר תאים תומכים. מודל xenograft המתואר של VM מספק פלטפורמה יעילה להערכה פרה-קולינית של תרופות ממוקדות על יכולתם לעכב התרחבות בלתי מבוקרת של לומן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דגימות רקמת החולה התקבלו מהמשתתפים לאחר הסכמה מדעת מאיסוף ומאגר של דגימות רקמה ונתונים מחולים עם גידולים וחריגות כלי דם תחת ועדת ביקורת מוסדית מאושרת (IRB) על פי מדיניות מוסדית במרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי (CCHMC), סרטן ומחלות דם המכון ועם אישור הוועדה לחקירה קלינית. כל ההליכים של בעלי החיים המתוארים להלן נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בבעלי חיים של CCHMC.

1. הכנת חומרים ופתרונות מלאי

  1. הכנת מדיום גדילה מלא של תאים אנדותל (EGM)
    1. תוספת אנדותל בזל בינוני (EBM) עם גורמי גדילה הבאים הנוכחיים ערכה (ראה טבלת חומרים):גורם גדילה פיברובלסט אנושי-בטא (hFGF-β), גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF), ארוך Arg3 אינסולין דמוי גורם גדילה- I (R3-IGF-I), חומצה אסקורבית, גורם גדילה אפידרמיס (EGF), ג'נמיצין גופרתי ואמפוטריסין-B, ו הפרין. הוסף 1% פניצילין/ סטרפטומיצין / L-גלוטמין (PSG) פתרון ו 20% סרום חזיר עוברי (FBS).
      הערה: איננו ממליצים להוסיף הידרוקורטיזון.
    2. סטרילי לסנן את הפתרון תחת מכסה המנוע זרימה למינאר דרך מסנן בקבוק 0.2 μm העליון לתוך בקבוק זכוכית autoclaved ומדיה aliquot לתוך 50 mL צינורות חרס ולאחסן ב 4 ° C עד שבוע או ב -20 ° C עד שנה אחת.
  2. הכנת פתרון מניות של קולגנאז
    1. הכן 50 מ"ג/מ"ל קולגנאז פתרון מניות ב-1x פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS).
    2. סטרילי לסנן את הפתרון תחת מכסה המנוע זרימה למינאר עם 0.2 μm מסנן ומזרק, ולאחסן 100 μL aliquots ב -20 °C.
  3. הכנת אוסף רקמות בינוני (מאגר A)
    1. הכןCa 2+/Mg2+ פתרון מניות על ידי הוספת 0.927 גרם של סידן כלוריד דיהידרט (CaCl2.2H2O) ו 1 גרם של מגנזיום גופרתי heptahydrate (MgSO4.7H2O) כדי 500 מ"ל של מים מזוקקים. סטרילי לסנן את הפתרון באמצעות מסנן בקבוק 0.2 μm העליון לתוך בקבוק זכוכית autoclaved ולאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
    2. תוספת של Dulbecco שונה נשר בינוני (DMEM) עם 10% Ca2+/ מ"ג2+ פתרון ו 2% FBS.
    3. סטרילי לסנן את הפתרון תחת מכסה המנוע זרימה למינאר עם 0.2 μm מסנן מזרק ולאחסן aliquots של 5 מ"ל ב -20 °C.
  4. ציפוי פיברונקטין של צלחות תרבות רקמות
    1. הכן את מאגר הציפוי (מאגר ב') על-ידי המסת 5.3 גרם נתרן קרבונט (Na2CO3; 0.1 M) ב-500 מ"ל של מים מנומנמים. כוונן את ה-pH של המאגר ל- 9.4 באמצעות חומצה הידרוכלורית של 1 M (HCl). לסנן מתחת למכסה המנוע לזרום למינאר דרך מסנן בקבוק 0.2 μm העליון לתוך בקבוק זכוכית autoclaved ולאחסן ב RT.
    2. לציפוי, פיפט 2 מ"ל/5 מ"ל/10 מ"ל של מאגר B לכל 60 מ"מ/100 מ"מ/145 מ"מ צלחת תרבות רקמות, בהתאמה. מוסיפים 1 μg/cm2 של תמיסת חלבון מטוהרת פלזמה אנושית ולהפיץ בעדינות את הנוזל על הצלחת.
    3. דגירה ב 37 °C, 5% CO2 במשך 20 דקות.
    4. שאפף את Buffer B ושטוף את הצלחת עם PBS לפני התאים הקולטים.

2. בידוד של תאי אנדותל מרקמות חולה VM

  1. בידוד של EC מרקמות VM מוצקות
    הערה: רקמת VM נותתת על ידי ניתוחdebulking 12,13 תחת פרוטוקול IRB מאושר.
    1. לשטוף רקמת VM (משקל מדגם רקמה בדרך כלל נע בין 0.5 g ו 1.5 גרם) ב 5% PSG ב PBS.
    2. מעבירים רקמה לצלחת של 100 מ"מ של תרבות תאים, מטחון דגימת רקמה לחתיכות קטנות באמצעות כלי ניתוח סטריליים, והעברתו לצינור 50 מ"ל.
    3. להוסיף 100 μL של קולגן פתרון מניות 5 מ"ל של מאגר A עבור ריכוז סופי של 1 מ"ג / מ"ל, ואז להוסיף את זה לרקמה ולעכל את הרקמה טחון ב 37 ° C במשך 30 דקות תוך ניעור תוכן כל 5 דקות.
    4. טחון בזהירות את הרקמה המעכלת ב RT באמצעות מטחנת עלי 6 מ"מ, משטח חלק בתוך צינור חסוני 50 מ"ל.
    5. המשך לטחון בזהירות רקמה מעוכלת באמצעות עלי תוך הוספת 5 מ"ל של PBS קר בתוספת 0.5% אלבומין סרום בקר (BSA) ו 2% PSG. חזור על שלב זה ארבע פעמים.
    6. לסנן את הפתרון דרך מסננת תא 100 μm לתוך צינור חסין 50 מ"ל כדי להסיר שברי רקמות.
    7. מתלה תא צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 400 x g ב- RT.
  2. בידוד של VM EC מדם נגעי המתקבל מחולים
    1. להשיג דם נגע VM אנושי מsclerotherapy תחת פרוטוקול IRB אישר.
    2. לדלל את הדם נגע (נפח מדגם בדרך כלל נע בין 0.5 מ"ל ו 5 מ"ל) ב PBS לנפח סופי של 40 מ"ל.
    3. מתלה תא צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 200 x g ב- RT.
  3. ציפוי תא ראשוני
    1. בטל את supernatant ופנס מחדש את הכדור של תא יחיד ב- 1 מ"ל של EGM.
    2. הוסף 9 מ"ל של EGM מלא על פיברונטין מצופה (1 μg / cm²) 100 מ"מ צלחות זרע 1 מ"ל של מתלה תא.
    3. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס בלח 5% CO2 אטמוספרה.
    4. כל יומיים להסיר 2 מ"ל של מדיה ולהוסיף 2 מ"ל של FBS מסונן סטרילי.
    5. ברגע שתרביות תאים מגיעות לתרביות של 40\u201250% לשנות את המדיום כדי להשלים EGM. זה בדרך כלל לוקח בין 2\u20123 שבועות עבור התאים כדי להגיע confluency זה.
    6. שים לב מדי יום למראה מושבות EC. הם יכולים להיות מזוהים על ידי מורפולוגיה טיפוסית שלהם "כמו מרוצף"(איור 1A). בין 3\u20125 מושבות EC מופיעות בכל מדגם.
    7. לשנות את המדיום כל יומיים לעוד 5\u20127 ימים עד מושבות EC בודדים להתחיל לגעת אחד בשני.
  4. בידוד ידני של מושבות EC בודדות
    1. כדי לקצור מושבות EC, לשטוף את הצלחת עם 5 מ"ל של PBS ושאף באופן ידני עם פיפטה סרולוגית.
    2. קח את הצלחת למיקרוסקופ והקיף את המיקומים של מושבות EC מרובות באמצעות עט סימון הן על המכסה והן על התחתון לפני החזרתו למכסה המנוע לזרום למינאר.
    3. נתק מושבות EC על ידי pipetting 50 μL של 0.05% פתרון טריפסין-EDTA על האזורים המסומנים.
    4. באמצעות מגרד תאים קטן או קצה פיפטה, בעדינות לגרד תאים מהצלחת.
    5. הטה את הלוח לקצה הקרוב ביותר, ושטוף עם 1 מ"ל EGM לכל אזור מסומן ולאסוף תאים.
    6. ספור את מספר התאים באמצעות מד-ממוציט או מונה תא אוטומטי.
    7. לוח מושבות EC שנאספו בצפיפות של 1 x 104 תאים / ס"מ2 על פיברונטין מצופה (1 μg / cm²) מנות תרבות תא המכיל EGM טרי. למחרת, לשנות מדיום כדי להשלים EGM.
    8. שנה את המדיום כדי להשלים EGM כל יומיים במשך 2\u20123 שבועות עד תאים להגיע 80% confluency.
    9. Trypsinize EC עם 2 מ"ל של טרום חימום 0.05% טריפסין-EDTA לכל 100 מ"מ צלחת ב 37 ° C במשך 2 דקות ולנטרל טריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של EGM.
    10. לאסוף את מתלה התא לתוך צינור אחד 15 מ"ל חסינה צנטריפוגה ב 400 x g ב RT במשך 5 דקות. לשאוף את תאי supernatant ולתו מחדש ב 2 מ"ל של EGM.
    11. ספור את מספר התאים באמצעות מד-ממוציט או מונה תא אוטומטי. מספרי תאים טיפוסיים שהתקבלו הם 1 x 106 תאים לכל לוח תרבות תא 60 מ"מ או 2 x 106 תאים לכל 100 מ"מ צלחת תרבות רקמות.
    12. גלול התאים על ידי צנטריפוגציה ב 400 x g ב RT במשך 5 דקות ולאסוף את supernatant. המשך לשלב 3.2.1.

3. בחירת תאים אנדותל והרחבה

  1. הכנת חרוזים מגנטיים אנטי-CD31
    1. מערבולת הבקבוקון המכיל את החרוזים המגנטיים נגד CD31-התווסת עבור 30 s. מספר החרוזים הנדרשים הוא 8 x 106 חרוזים/2 x 106 תאים.
    2. לשטוף את הכמות הרצויה של חרוזים מגנטיים נגד CD31-conjugated עם 1 מ"ל של פתרון כביסה המכיל 0.1% BSA ב PBS בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
    3. מניחים את צינור המיקרוצנטריפוגה במגנט בידוד תאים למשך דקה אחת.
    4. שאף את הסופרנטנט וחזור על שלב הכביסה.
  2. טיהור וציפוי של תאים אנדותל
    1. גלולת תא Resspend שהושגה ב 2.4.12 ב 500 μL של פתרון כביסה המכיל 0.1% BSA ב PBS.
    2. הוסף תמיסת תאים לצינור microcentrifuge המכיל חרוזים מגנטיים וssuspend ביסודיות.
    3. דגירה במשך 20 דקות ב 4 ° C עם הטיה עדינה.
    4. להוסיף 500 μL של 0.1% BSA ב PBS ולערבב היטב.
    5. מניחים את הצינור על מגנט בידוד תא במשך 1 דקות.
    6. שאפף בעדינות את כל הנוזל, המכיל את השבר השלילי של תאים CD31 מבלי לגעת בחרוזים.
    7. יש לשטוף את גלולת החרוז המכילה את שבר התא ה-CD31 החיובי עם 1 מ"ל של 0.1% BSA ב-PBS וחזר על ההפרדה המגנטית.
    8. שלב כביסה והפרדה מגנטית חוזרים למשך 3 פעמים לפחות כדי לטהר שבר תא CD31 חיובי.
    9. תוסתה מחדש תאים אנדותל מטוהרים לתוך צינור חרוכי 15 מ"ל וספין למטה במשך 5 דקות ב 400 x g ב RT.
    10. הסר כדורי תא supernatant וssspend ב 1 מ"ל של EGM.
    11. הוסף 9 מ"ל של EGM מלא על פיברונטין מצופה (1 μg / cm²) 100 מ"מ צלחות זרע 1 מ"ל של מתלה תא. שים לב כי כמה חרוזים מגנטיים עדיין מחוברים לתאים בשלב זריעה ראשוני זה. רוב החרוזים לשטוף במהלך הרחבת התא, אבל מספר קטן של חרוזים עשויים להימשך במעברים מוקדמים.
    12. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס בלח 5% CO2 אטמוספרה.
    13. לשנות את המדיום כל יומיים עד תאים להגיע 80% confluency(איור 1B).
  3. הרחבת תאים אנדותל
    1. ברגע שהתאים מגיעים ל-80% confluency, נתקו עם 2 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לכל 100 מ"מ ב-37°C למשך 2 דקות.
    2. לנטרל טריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של EGM ולאסוף תאים לתוך צינור חסין אחד 15 מ"ל.
    3. צנטריפוגה ב 400 x g ב RT במשך 5 דקות.
    4. לשאוף את supernatant, resuspend תאים ב 2 מ"ל של EGM, ולספור את מספר התאים עם hemocytometer או על ידי ספירת תאים אוטומטית.
    5. תאי זרע בצפיפות של 1 x 104 תאים/cm² לתוך 145 מ"מ פיברונקטין מצופה (1 μg / cm²) צלחות תרבות רקמות.
    6. המשך למעבר לתאים עד למספר התא הרצוי. קח בחשבון כי לוח תרבות רקמות confluent 145 מ"מ מכיל כ 8\u20129 x10 6 תאים ומספר התאים הדרושים הוא 2.5 x 10 6 תאים לכלהזרקה. רק תאים בין מעבר 3 ו-8 צריכים להיחשב לשנאת זרים.

4. פרוטוקול קסנוגרפט נגזר ממטופל VM

הערה: בפרוטוקול זה אנו משתמשים 5\u20126 בן שבוע, immunodeficient זכר, עכברים עירום אתימי Foxn1nu.

כל ההליכים בבעלי חיים חייבים להיות מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (IACUC).

  1. הכנת חומרים ביום שלפני ההזרקה
    1. מזרקים לפני צינה, מחטים, וטיפים pipet ב -20 מעלות C מקפיא לילה.
    2. להפשיר לאט את קרום המרתף מטריצה חוץ תאית (BMEM) לילה על דלי קרח ממוקם ב 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע צמיגות מוגברת של הג'ל.
  2. הכנת מתלה תא להזרקה
    1. טריפסיניז EC עם 5 מ"ל של טרום חימום 0.05% טריפסין-EDTA לכל 145 מ"מ צלחת ב 37 ° C במשך 2 דקות.
    2. לנטרל טריפסין על ידי הוספת 5 מ"ל של EGM ולאסוף תאים לתוך צינור אחד 15 מ"ל חסין.
    3. צנטריפוגה ב 400 x g ב RT במשך 5 דקות.
    4. לשאוף את supernatant, להשתמש מחדש תאים ב 3 מ"ל של EGM, ולספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer או מונה תא אוטומטי.
    5. קבע את המספר הכולל של תאים הדרושים עבור כל הזריקות המתוכננות.
      הערה: מספר התאים המומלץ הוא 2.5 x 106 תאים לכל הזרקה. סה"כ 2 זריקות מבוצעות בדרך כלל בכל עכבר עבור כפילויות טכניות. יש צורך לחשב עודף של 10% ממספר התא כדי לתת דין וחשבון על אובדן במהלך ההעברה למזרק.
    6. העבר את אמצעי האחסון המכיל את מספר התא המחושב לתוך צינור חסונים חדש 50 מ"ל ותאי גלולה על ידי צנטריפוגציה ב 400 x g ב RT במשך 5 דקות.
    7. לשאוף את supernatant, עוזב נפח קטן (על 50\u201270 μL) כדי לשחרר את הכדור.
  3. הכנת מזרק
    1. לחשב נפח עודף של 20 μL / הזרקה חשבון על אובדן במהלך ההעברה למזרק. תולה מחדש את כדור התא עם 220 μL של BMEM לכל הזרקה על קרח. הנפח המוזרק של מתלה התא יהיה 200 μL לכל נגע.
    2. מערבבים את מתלי התא ביסודיות על קרח כדי להשיג מתלה תאים הומוגני ולהימנע מיצירת בועות.
    3. באמצעות צינור 1 מ"ל ומזרק 1 מ"ל, בו זמנית pipet תערובת BMEM-תא לתוך פתיחת מזרק על ידי כוח יניקה תוך משיכת בוכנה של מזרק.
    4. Luer לנעול מחט סטרילית 26G x 5/8 אינץ' למזרק ולשמור מזרקים מוכנים שטוח על קרח לפני ההזרקה.
  4. הזרקה תת עורית לתוך העכבר
    1. להדהים את העכברים עם 5% תערובת isoflurane / חמצן בקצב זרימה של 1 L/min באמצעות מאדה isoflurane. להבטיח הסתמה נכונה של בעלי חיים (למשל, חוסר מגיבה לצביטות בהונות). לשמור על הרדמה באמצעות ניהול רציף של 1.5% isoflurane / חמצן מועבר באמצעות קונוס האף.
    2. מניחים עכברים על הבטן שלהם, חושפים את האזור האחורי שבו תתרחש השתלה ולחטא את אזור ההזרקה עם 70% אתנול.
    3. מגלגלים בעדינות את המזרק המוכן כדי לתוסת מחדש את כל התאים המיושבים. בועות החלק אל קצה המחט של המזרק ולגרש נפח קטן של מתלה התא כדי להבטיח את הסרת כל הבועות.
      הערה: ניתן לבצע שתי זריקות עבור כל עכבר – בצד שמאל וימין של העכבר בחזרה.
    4. צבוט וליצור מבנה 'כמו אוהל' באמצעות האגודל והאצבע המורה ולהכניס את המחט תת עורית ממש מתחת לעור. ודא כי המחט היא רק עור עמוק על ידי שחרור עור צבוט כדי למנוע הזרקה לתוך רקמת שריר.
    5. החזקת מחט בזווית 45° בזהירות להזריק 200 μL של מתלה התא כדי ליצור מסה כדורית קטנה(איור 1C).
    6. להקליט משקל העכבר עם קנה מידה, לתייג את האוזן העכבר, ולחזור לכלוב.
    7. עקוב אחר עכברים בעקבות ההסתמה כדי להבטיח שהם יחזרו לפעילות רגילה.
  5. ניטור צמיחת נגע
    1. באמצעות קליפר, למדוד את האורך והרוחב של כל תקע(איור 1D).
    2. מדידות מסמך כל יומיים עד לאיסוף הנגעים.

5. איסוף ועיבוד רקמות

  1. המתת סד לעכברים 9 ימים לאחר ההשתלה בתא CO2 ולבדוק סימנים חיוניים כדי לאשר את המוות. לבצע נקע צוואר הרחם על העכברים כשיטה משנית כדי להמתת סד העכבר.
  2. לקצור את נגע xenograft / תקע מהאגף של העכבר על ידי ניתוח באמצעות מגרסות כירורגיות ומספריים.
    הערה: על מנת למנוע קרע של כלי הדם המלאים בדם בתוך התקע, חשוב להימנע מלגעת בתקע הנגע עם כלי קרע ולהשאיר רקמה מוגזמת סביב כגון העור המחובר לתקע.
  3. לטבול את הנגע החתך בPBS לשטוף.
  4. הגדר שלב מצלמה עם מצלמה. ישר תקעים ללוח חיתוך עם סרגל. לצלם תמונה של כל התקעים כדי להקליט כלי דם ברוטו של נגעים(איור 1E).
  5. תקן תקעים על ידי שקוע ב 10% פורמלין לילה ב RT.
  6. לשטוף את התקעים PBS למחרת ולהעביר אותם 70% אתנול.
  7. תקעי נגע תהליך להטביעת פרפין (ליבת פתולוגיה).

6. קטע נגע

  1. השתמש microtome כדי לחתוך 5 μm מקטעים מן נגעים murine שנאספו על שקופיות טעונות חיובית.
    הערה: לניתוח הבא, מקטעים במרכז התקע (כ 50\u201270 μm לתוך הרקמה) הם בעלי חשיבות.
  2. ממיסים פרפין ב-60 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפני הכתמים.
  3. De-paraffinize ו מחדש הידרציה רקמות באופן רציף תחת מכסה המנוע זרימת אדים כימיים. לכן, דגירה להחליק xylene במשך 10 דקות, 100% אתנול (EtOH) עבור 5 דקות, 90% EtOH עבור 3 דקות, ו 80% EtOH עבור 3 דקות.
  4. לשטוף את המגלשה במים deionized במשך 5 דקות.

7. המטוקסילין ואאוסין (H&E)

  1. מדגם בהמטוקסילין למשך 2 דקות.
  2. מניחים מגלשות בצנצנת מכתימים וצורפי בכיור על ידי זרם קבוע של מי ברז עד שהמים צלולים.
  3. De-hydrate שקופיות על ידי דגירה רקמה רצפת ב 70% EtOH עבור 1 דקות, 80% EtOH עבור 1 דקות, 90% EtOH עבור 1 דקות, 100% EtOH עבור 1 דקות, ו טרי 100% EtOH עבור 1 דקות.
  4. כתמים באוסין Y עבור 30 s.
  5. יש לשטוף ב-100% ETOH טריים עד שהפתרון ברור.
  6. דגירה שקופית קסילן במשך 2 דקות. תן לשקופיות להתייבש במשך 5\u201210 דקות מתחת למכסה המנוע של האדים.
  7. לחלק טיפה של קבוע, לא מים הרכבה בינוני מעל מקטעים xenografts וכיסוי מקום על גבי.
  8. אפשר לשקופיות להתייבש במהלך הלילה לפני ההדמיה.

8. אימונוהיסטוכימיה

  1. הכן מאגר אחזור אנטיגן (Tris-EDTA) על-ידי שקילת 0.6 גר' של בסיס Tris ו-1 מ"ל של 0.5 M EDTA עד 500 מ"ל של מים מצועצים. כוונן את ה-pH ל- 9.0 באמצעות 1 M HCl. הוסף 250 μL של Tween-20.
  2. דגירה de-paraffinized רקמה שקופיות (כפי שהושג בשלב 6.2\u20126.3) בבקת עם מאגר אחזור אנטיגן, ערבוב על בלוק חימום, במשך 20 דקות ב 95 °C.
  3. הסר את החתמת מבלוק החימום, אפשר לפתרון להתקרר ל-35°C ולאחר מכן לשטוף ב-PBS למשך 3 דקות.
  4. לחסום רקמות מקטעים ב 5% סרום סוס רגיל PBS במשך 30 דקות ב RT.
  5. להכין פתרון עבודה Ulex europaeus agglutinin-I (UEA-I) ביוטינלציה על ידי דילול 20 μg/mL של UEA-I ביוטינילציה בסרום סוסים רגיל 5% PBS.
  6. Pipet 50\u2012100 μL של UEA-I עובד פתרון לכל סעיף דגירה במשך 1 שעה ב RT בתא לחות.
  7. לשטוף שקופיות פעמיים ב PBS במשך 3 דקות.
  8. מרווה מקטעים שקופיות ב 3% מי חמצן במשך 5 דקות ב RT.
  9. לשטוף שקופיות פעמיים ב PBS במשך 3 דקות.
  10. להכין 5 μg /mL של סטרפטאבידין חזרת peroxidase-conjugated ב 5% סרום סוס רגיל PBS.
  11. Pipet 50\u2012100 μL על כל שקופית רקמה דגירה במשך 1 שעה ב RT בתא לחות.
  12. לשטוף שקופיות פעמיים ב PBS במשך 3 דקות.
  13. להכין 3,3'Diaminobenzidine (DAB) פתרון על פי הוראות היצרן ולהוסיף 50\u2012100 μL לכל סעיף.
  14. מקטעים דגירה עבור 10\u201215 דקות, בדיקה וניטור לפיתוח של כתם כל 2\u20125 דקות.
  15. לשטוף שקופיות שלוש פעמים PBS במשך 3 דקות.
  16. מוסיפים טיפת המטוקסילין וגרה במשך 3 דקות.
  17. מניחים מגלשות בצנצנת מכתימים וצורפי בכיור על ידי זרם קבוע של מי ברז עד שהמים צלולים.
  18. שקופית דגירה רצף ב 80% EtOH עבור 1 דקות, 90% EtOH עבור 1 דקות, 100% EtOH עבור 1 דקות, ו xylene במשך 2 דקות.
  19. תן לשקופיות להתייבש במשך 5\u201210 דקות מתחת למכסה המנוע של האדים.
  20. לחלק טיפה של קבוע, לא מים הרכבה בינוני מעל מקטעים xenografts וכיסוי מקום על גבי.
  21. אפשר לשקופיות להתייבש במהלך הלילה לפני ההדמיה.

9. ניתוח ערוצי כלי דם הנגזרים על ידי בני אדם

הערה: כלי דם של נגעים VM הוא מכמת על ידי מדידת אזור כלי הדם וצפיפות כלי דם. רק איחוד האירופי-I חיובי, ערוצים נגזרים על ידי בני אדם נשקלת לכמת.

  1. לצלם ארבע עד חמש תמונות לכל קטע נגע עם מיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה של פי 20 (שדות הספק גבוה [HPF]). לצלם תמונות HPF בתבנית x-plane בתוך סעיף הנגע כדי למנוע חפיפה(איור 1F-H). כלול סרגל קנה מידה בתמונות שצולמו.
  2. פתח את תמונות HPF בתמונה J (קובץ > פתח). כיול הפיקסלים של סרגל קנה המידה באופן הבא. השתמש בכלי קו ישר ולעבור על סרגל קנה המידה. כדי להמיר את הפיקסלים הנמדדים למ"מ לחץ על נתח > הגדר קנה מידה.
  3. לחץ על נתח > הגדר מידות ובחר אזור והוסף לתיך-על.
  4. מדוד את שטח השדה הכולל ב- HPF באמצעות ניתוח > מדידה. שמור מדידה זו לכמת בשלב 9.8.
  5. באמצעות הכלי בחירות ביד חופשית, מתאר באופן ידני UEA-I+ ערוצי כלי דם.
    הערה: ערוץ כלי דם מוגדר כאזור המסומן ב- UEA-I+ - EC שעשוי להכיל תאי דם.
  6. לחץ על נתח > למדוד כדי לכמת את UEA-I+ אזור כלי דם (מ"מ2/HPF).
  7. חזור על מדידה זו עבור כל חמשת HPF שצולמו בתקע אחד.
  8. ממוצע שטח כלי הדם הכולל של כל חמשת HPF. אזור כלי הדם שהושג לכל HPF מחולק לאחר מכן על-ידי אזור השדה של HPF (במ"מ2, שלב 9.5) ומתבטא באחוז (%).
  9. לכמת את צפיפות כלי הדם, ספרו את מספר ערוצי UEA-I+ כלי דם של כל HPF שנלקחו. צפיפות כלי הדם היא המספר הממוצע של ערוצי UEA-I+ כלי דם נספרו לפי אזור HPF (כלי שיט/מ"מ2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר את התהליך של יצירת מודל xenograft murine של VM בהתבסס על הזרקה תת עורית של EC נגזר החולה לתוך הגב של עכברים עירומים immunodeficient. מושבות תא אנדותל ניתן לקצור בתוך 4 שבועות לאחר בידוד תאים ראשוניים רקמת VM או דם נגע(איור 1A, B). יום לאחר ההזרקה, תקע הנגע xenograft מכסה שטח פנים של כ 80\u2012100 מ"מ2. בידיים שלנו, תקעים נגע עם TIE2/PIK3CA-מוטציה EC הם כלי דם באופן ניכר וsperized בתוך 7\u20129 ימים מן הזרקה 14,,15 (איור 1C-E). עם זאת, היקף הצמיחה נגע משתנה ומשקף הטרוגניות המטופל ודגימה.

תקעי נגע ים מחדש את התכונות ההיסטופתולוגיות של רקמת VM אנושית: ערוצי כלי דם מוגדלים מרופדים בשכבה דקה של תאי אנדותל(איור 1F\u2012H). מבנים אלה כלי דם מכילים בדרך כלל אריתרושיטים, המאשרים anastomoses פונקציונלי עם כלי הדם של העכבר המארח (איור 1F\u2012H). כתמים חיסוניים באמצעות lectin UEA-אני יכול לאשר כי תאים רירית נגעים בכלי דם נגזרים תאים מושתלים אנושיים ולא כלי דם של עכבר(איור 1H). ערכה המסכמת את השלבים מבידוד VM-EC לפירוק תקע נגע מוצגת באיור 2.

Figure 1
איור 1: תוצאות מייצגות.
(א)תמונה מייצגת של תרבות תאים מעורבים ראשוניים שלושה שבועות לאחר הבידוד מרקמות VM לפני בחירת EC. מושבת תאים אנדותל טיפוסית (EC) ופיברובלסט מזהם (FB). (ב)תמונה של תרבות תאים אנדותל מטוהרים (בחירת חרוז CD31) מרקמות הניגזרות ממטופל VM. סרגל קנה מידה = 200 μm.(ג)הנגע יהיה ליצור מבנה כדורי. כלי דם גלויים בשל צבע כחול דרך העור של עכברים עירומים. (D)קווים מקווקווים מראים כיצד גודל הנגע מקודד מחדש על-ידי מדידת האורך (L) והרוחב (W) באמצעות קליפר. (ה)תמונה של נגע כלי דם לכאורה, xenograft explant ביום 9. סרגל קנה מידה = 1ס"מ( F ) תמונה מייצגת של סעיף תקע נגע. תבנית x-plane שבה חמש תמונות שדה הספק גבוה נלקחות לכמת מסומן על-ידי תיבות מקווקות לבנות. סרגל קנה מידה = 1000 μm. (G\u2012H) תמונות מייצגות של מקטעי תקע נגע VM. (ז)המטוקסילין ואאוסין מכתימים ו-(H)אימונוהיסטוכימיה של לקטין UEA-I. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 2
איור 2: סכמטי של זרימת העבודה כדי ליצור xenograft נגזר המטופל של VM.
(א)תאים אנדותל מבודדים מסרטן VM נגע רקמות מוצקות או דם נגע מצופה, כאשר 80% confluency הוא הגיע, נבחרים על ידי אנטי CD31-התואם חרוזים חיסוניים מורחב. (ב)עבור הזרקה תת עורית של EC, ביום 0, העור על החלק האחורי של העכבר הוא צבט באמצעות אצבע ואגודל כדי ליצור מבנה כמו אוהל. נגעים נמדדים ביום הראשון ולאחר מכן כל יומיים (חצים אדומים) באמצעות קליפר דרך יום ניסיוני 9. נגעים נותחים ומעובדים לניתוח היסטולוגי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת מודל קסנוגרפט נגזר ממטופל של VM. מודל murine זה מציג מערכת מצוינת המאפשרת לחוקרים להשיג הבנה עמוקה יותר של הגדלת לומן פתולוגית ויהיה אינסטרומנטלי בפיתוח טיפולים יעילים יותר ממוקדים לטיפול VM. זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לחקור סוגים אחרים של חריגות כלי דם כגון מום ורידי נימים16. ישנם מספר צעדים החיוניים לדור המוצלח של נגעים כלי דם לשחזור. ראשית, תאי אנדותל הנגזרים ממטופל חייבים להיות טהורים (ללא נוכחות של סוגי תאים אחרים) וגדלים באופן אקספוננציאלי בזמן ההזרקה. מזהם פיברובלסט או mesenchymal אחר שאינו EC ניתן לזהות בקלות על ידי מורפולוגיה מוארך. במקרים נדירים, ייתכן כי גם לאחר טיהור באמצעות נוגדנים נגד CD31 בהדברת חרוזים מגנטיים, מספר קטן של שאינם EC להישאר בתרבות. תרבויות אלה דורשות טיהור נוסף עם סמני פני השטח של התא התותל. כגישה חלופית, התרחבות תא אחד clonal של תאים אנדותל אפשרי. זה היה להבטיח מחדש את ההומוגניות של מוטציה-EC כמו כל התאים בתוך תרבות אחת היה להפיק מתא אחד. עם זאת, גישה זו אינה מומלצת עבור EC נגזר VM כמו תאים נוטים להתעלות על יכולות ההתפשטות שלהם ולהמיר פנוטיפ senescent לאחר 9\u201210 קטעים. זה קריטי להשתמש בתאים בין קטעים 3\u20128 לניסויים xenograft ולא מעבר תאים יום לפני הזריקה.

ניתן לשנות את מודל הקסנוגרפט כדי לחקור חריגות אחרות בכלי הדם הנושאות מוטציות הפעלה שונות. יתר על כן, כמו דגימות רקמת המטופל קשה לגשת עבור מעבדות מסוימות, מודל xenograft יכול להיות מותאם באמצעות EC, כגון תאי אנדותל דם טבור אנושי (HUVEC), מהונדס גנטית לבטא את המוטציה / s ידוע לגרום לצמיחה כלידם לקויים 15,17.

מספר התאים המומלצים להזרקה xenograft הוא 2.5 x 106 תאים/200 μL של BMEM. עם זאת, אם מספר התא אינו מספיק ניתן להפחית את מספר הזריקות לכל בעל חיים לאחד או להפחית את נפח ההזרקה למינימום של 100 μL. עבור האחרון, חשוב ככל שיהיה לשמור על יחס צפיפות התא למשל, 1.25 x 106 תאים/100 μL BMEM. בעת עבודה עם BMEM, כל השלבים חייבים להתבצע על קרח כדי למנוע גיהופיקציה של מתלה התא לפני ההזרקה. במהלך ההזרקה, חשוב כי המחט מוכנס בזווית של 45 ° ישירות מתחת לעור והרחק רקמת השריר, כמו הזרקה לתוך השריר תפוגה נגע רבייה והופך את הצלקת קשה. ניתן לבצע בסך הכל שתי זריקות בכל עכבר - אחת בצד ימין והשנייה בצד שמאל של כל בעל חיים. הזריקה השנייה באותו עכבר יכולה לשמש כשכפל טכני. זריקות נוספות על הגב אינן מומלצות כמו נגעים לגדול לאורך זמן עלול להפריע אחד לשני. לניתוח סטטיסטי במחקרים פרה-קליניים המשווים תקעים של עכברים שטופלו לעומת עכברים לא מטופלים (רכב בלבד), אנו ממליצים על שימוש של לפחות 5 בעלי חיים (10 תקעי קסנוגרפט) לכל קבוצת מחקר. אם היא זמינה, הזריקה השנייה יכולה לחילופין לשמש כ'בקרה פנימית' באמצעות EC שאינו מוטנט. השתמשנו EC ראשי שאינו מוטציה, כגון HUVEC, כפקד והוצגנו כי תאים אלה יצרו מספר זניח שלערוצים קטנים 14,15. יתר על כן, אלה HUVEC בקרת תקעים נגע, הבחנו חדירה של ערוצים כלי דם נגזר מורין לתוך התקע אחרי היום 9. אם העיצוב הניסיוני דורש זמני דגירה ארוכים יותר, ערוצים חודרים אלה יכולים להישלל בקלות מניתוח על ידי כתם עבור סמן ספציפי לאדם כגון נוגדן CD31 ספציפי לאדם או Ulex europaeus agglutinin I (UEA-I) שאינו חוצה להגיב עם העכבר.

כדי להבטיח כי הנגע לא יהפוך לנטל על בריאות בעלי החיים ורווחתו חשוב לשמור על גודל הנגע, לתעד משקל העכבר מדי יום, ולשים לב לכל סיבוכים בצד כגון דימום וחבלות. אם נפח הנגע עולה על 500 מ"מ3, יש לסיים את הניסוי.

כאשר נגעים בכלי דם מוגדלים ומנוונים, יש לשלם תשומת לב קיצונית במהלך הקרע כדי למנוע קרע ברצועה. חשוב להימנע מלגעת בתקע הנגע עם כלי פעולה ולהשאיר רקמה מוגזמת מסביב (כגון עור) מחוברת לתקע. פעולה זו מונעת קריסה של מבני כלי הדם בתוך תקע xenograft אשר יפריע לניתוח מדויק.

לבסוף, כדי לשמור על עקביות, חשוב כי הניתוח היסטולוגי הראשוני מתחיל במרכז התקע (על 50\u201270 μm לתוך הרקמה) ולא את אזורי הגבול שבו כלי דם עכבר anastomosing עשוי להיות נוכח. מומלץ מאוד להכתים את מקטעי הרקמות עם סמן EC ספציפי לאדם, כגון UEA-I או נוגדן חלופי ספציפי לאדם אשר לא יצטלב עם העכבר, כדי לאשר כי מבני כלי דם נוצרים על ידי EC נגזר אדם ולא פולש עכבר EC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לנורה לייקס על ההגהה. מחקרים שדווחו בכתב יד זה נתמכו על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם, תחת פרס מספר R01 HL117952 (E.B.), חלק מהכונים הלאומיים לבריאות. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males Envigo 069(nu)/070(nu/+) Subcutaneous injection
Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) Vector Laboratories B-1065 Histological anlaysis
Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) Thermo Fisher 974106 Cell culture
Bovine Serum Albumin (BSA) BSA A7906-50MG Cell culture; Histological analysis
Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) Sigma C7902-500G Cell culture
Caliper Electron Microscopy Sciences 50996491 Lesion plug measurment
CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) Life Technologies 11155D EC separation
Cell strainer (100 μM) Greiner 542000 Cell culture
Collagenase A Roche 10103578001 Cell culture
Conical Tube; polypropylene (15 mL) Greiner 07 000 241 Cell culture
Conical Tube; polypropylene (50 mL) Greiner 07 000 239 Cell culture
Coplin staining jar Ted Pella 21029 Histological anlaysis
Coverglass (50 X 22 mm) Fisher Scientific 12545E Histological anlaysis
DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) Vector Laboratories SK-4105 Histological anlaysis
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) Corning 10-027-CV Cell culture
DynaMag-2 Life Technologies 12321D EC separation
Ear punch VWR 10806-286 Subcutaneous injection
EDTA (0.5M, pH 8.0) Life Technologies 15575-020 Histological anlaysis
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) Lonza CC-3162 Cell culture
Eosin Y (alcohol-based) Thermo Scientific 71211 Histological anlaysis
Ethanol Decon Labs 2716 Histological anlaysis
Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone GE Healthcare SH30910.03 Cell culture
Filter tip 1,250 μL MidSci AV1250-H Multiple steps
Filter tip 20 μL VWR 10017-064 Multiple steps
Filter tip 200 μL VWR 10017-068 Multiple steps
Formalin buffered solution (10%) Sigma F04586 Lesion plug dissection
Hemacytometer (INCYTO; Disposable) SKC FILMS DHCN015 Cell culture
Hematoxylin Vector Hematoxylin H-3401 Histological anlaysis
Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) Sigma FC010-10MG Cell culture
Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) Sigma H1009 Histological anlaysis
ImageJ Software Analysis
Isoflurane, USP Akorn Animal Health 59399-106-01 Subcutaneous injection
magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) Sigma M1880-500G Cell culture
Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) Corning 356237 Subcutaneous injection
Microcentrifuge tube (1.5 mL) VWR 87003-294 EC separation
Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) Fisher Scientific 1255015-CS Histological anlaysis
Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles Becton Dickinson (BD) BD305115 Subcutaneous injection
Normal horse serum Vector Laboratories S-2000 Histological anlaysis
Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) Corning 30-009-CI Cell culture
Permanent mounting medium (VectaMount) Vector Laboratories H-5000 Histological anlaysis
Pestle Size C, Plain Thomas Scientific 3431F55 EC isolation
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP3994 Cell culture
Scale VWR 65500-202 Subcutaneous injection
Serological pipettes (10 ml) VWR 89130-898 Cell culture
Serological pipettes (5ml) VWR 89130-896 Cell culture
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma 223530 Cell culture
Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC Vector Laboratories SA-5004 Cell culture
Syringe (60ml) BD Biosciences 309653 Cel culture
SYRINGE FILTER (0.2 µM) Corning 431219 Cell culture
Syringes (1 mL with Luer Lock) Becton Dickinson (BD) BD-309628 Subcutaneous injection
Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) Greiner 664160 Cell culture
Tissue culture-treated plate (145X20 mm) Greiner 639160 Cell culture
Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm Eppendorf 30701119 Cell culture
Tris-base (Trizma base) Sigma T6066 Histological anlaysis
Trypan Blue Solution (0.4 %) Life Technologies 15250061 Cell culture
Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) Corning 25-052-Cl Cell culture
Tween-20 Biorad 170-6531 Histological anlaysis
Wheaton bottle VWR 16159-798 Cell culture
Xylenes Fisher Scientific X3P-1GAL Histological anlaysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
  2. Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
  3. Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).
  4. Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
  5. Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).
  6. Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
  7. Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889 (2019).
  8. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
  9. Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).
  10. Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
  11. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
  12. Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
  13. Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
  14. Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
  15. Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
  16. Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
  17. Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 160 מום וריד קסנוגרפט תאי אנדותל TIE2 PIK3CA נגע בכלי דם
מודל קסנוגרפט נגזר ממטופל למום ורדי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schrenk, S., Goines, J., Boscolo, E. … More

Schrenk, S., Goines, J., Boscolo, E. A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation. J. Vis. Exp. (160), e61501, doi:10.3791/61501 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter