Dit manuscript beschrijft een protocol voor de minimale volume vitrification van onrijpe katoocyten met laboratorium-gemaakte media op commerciële steunen. Het dekt elke stap van eicelisolatie van ex vivo gonaden tot vitrificatie en opwarming.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Minimale volume vitrificatie van onvolwassen feline oocyten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In de instandhoudingsprogramma's van wilde dieren is gamete banking cruciaal om genetische hulpbronnen van waardevolle individuen en zeldzame soorten te beschermen en het behoud van de biodiversiteit te bevorderen. In felids, de meeste soorten worden bedreigd met uitsterven, en binnenlandse rassen worden gebruikt als een model om de efficiëntie van protocollen voor kiemplasma bankieren te verhogen. Onder oocyte cryopreservatie technieken, vitrification is meer en meer populair in de menselijke en veterinaire ondersteunde voortplanting. Cryotop vitrification, dat in eerste instantie werd ontwikkeld voor menselijke eicellen en embryo's, heeft aangetoond zeer geschikt te zijn voor kattenoraad. Deze methode biedt verschillende voordelen, zoals de haalbaarheid in het veld omstandigheden en de snelheid van de procedure, die nuttig kunnen zijn wanneer meerdere monsters moeten worden verwerkt. De efficiëntie is echter sterk afhankelijk van de vaardigheden van de operator en intra- en interlaboratoriumstandaardisatie zijn nodig, evenals personeelstraining. Dit protocol beschrijft minimale volume vitrificatie van onrijpe katachtige eicellen op een commerciële ondersteuning in een stap voor stap veld-vriendelijk protocol, van eicel collectie tot opwarming. Volgens het protocol, behoud van eicelintegriteit en levensvatbaarheid bij opwarming (tot 90%) kan worden verwacht, hoewel er nog ruimte is voor verbetering in de post-opwarming van de rijping en de embryonale ontwikkelingsresultaten.
Inleiding
Cryopreservatie is uitgegroeid tot een belangrijke stap van geassisteerde reproductietechnieken (ART's). Bij mensen, het maakt het behoud van de vruchtbaarheid of uitstel van het ouderschap om medische of persoonlijke redenen. Bij dieren is het noodzakelijk om afstand en tijd in geplande paringen te overwinnen, vooral bij boerderijdieren en huisdieren, of om genetisch materiaal van waardevolle onderwerpen in instandhoudingsprogramma's te behouden, met name bij bedreigde diersoorten. Gamete cryopreservatie is de beste keuze wanneer de te fokken personen nog niet zijn gekozen of om ethische problemen in verband met het invriezen van embryo's te voorkomen, vooral in de m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De afgebeelde procedures hebben geen ethische goedkeuring ondergaan, aangezien kattenstokken bij veterinaire klinieken werden verzameld als bijproducten van door de eigenaar gevraagde routineovariectomie of ovariohysterectomie.
1. Oocytencollectie
- Bereid voor aanvang van de experimenten oplossingen voor eierstok- en eicelcollectie. Bereid eierstokverzameloplossing met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met een mengsel van antibiotica en antimycotica (100 IU/mL penicilline G natrium, 0,1 mg/mL streptomycinesulfaat, 0,25 μg/mL amphotericine B). Bereid oocytenopvangoplossing (d.w.z. PBS/PVA) met PBS met 100 IU/mL penicilline G nat....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na cat oocyte vitrification en opwarming volgens het huidige protocol (Figuur 1 en Supplemental Figuur 1), de overgrote meerderheid van de gameten overleven. Na vitrificatie, onder andere technieken, kan de levensvatbaarheid worden geëvalueerd op de optische microscoop als morfologische integriteit22 of met het gebruik van vitale vlekken. Een van de laatste is fluoresceïne diacetaat / propidium jodide (FDA / PI), die het mogelijk maakt de identificati.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Oocyte cryopreservatie is een cruciale kiemplasma behoud techniek, vooral in taxa waar veel soorten worden bedreigd, zoals Felidae familie. In dit manuscript werd een eenvoudig en veldvriendelijk protocol voor de vitrificatie van onrijpe katoocyten gepresenteerd. Laboratoriummedia, ondersteuning van het minimale volume vitrification en opgeleid personeel zijn de belangrijkste factoren voor het succes van deze methode, die het mogelijk maakt om consequent en herhaaldelijk levensvatbare eicellen te verkrijgen, zoals blijkt.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd mede ondersteund door EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 en door Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). We willen ook dr. MariaGiorgia Morselli bedanken voor haar bijdrage aan de experimenten die hierbij worden afgebeeld en aan de beeldaanwinst.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatische pipetten & tips | / | / | Nodig om 20, 100, 240 en 300 µL af te pipetten |
| Chirurgische scalpels | / | / | Maat 10 is meestal ok |
| Bunsen beker | / | / | / |
| Klemmen | / | / | Sommige kleine (Mosquito klemmen) voor eierstofisolatie, enkele grotere (Klemmer klemmen) om in vloeibare stikstof te werken |
| Cryotop | Kitazato (distributeur: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributeurs en catalogusnummer kunnen in verschillende landen veranderen |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethyleenglycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetaal bovien serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glazen Pasteur pipetten | / | / | Aangeraden lengte 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | Afhankelijk van de canisters van de opslagtank |
| Verwarmingsfase | / | / | Alle verwarmingsfasen zijn ok, zolang ze 38ºC kunnen aanhouden |
| Vloeibare stikstof | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicilline G natrium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plaat | Kitazato (distributeur: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributeurs en catalogusnummer kunnen in verschillende landen veranderen |
| Stereomicroscoop | / | / | Zolang de operator de oöcyten kan selecteren, zijn andere stereomicroscopen ok |
| Opslagtank | / | / | Elke regelmatig gevulde tank is ok |
| Streptomycine sulfaat | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/stikstofbestendige doos | / | / | Alle dozen die vloeibare stikstof kunnen bevatten zijn ok, zolang de operator comfortabel is. Kitazato doos wordt "Cooling Rack" genoemd |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | Alle timers die tot 9 minuten ingesteld kunnen worden, zijn ok |
Referenties
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
