Summary
Præsenteret her er en protokol for kronisk søvn fragmentering (CSF) model opnået ved en elektrisk kontrolleret orbital rotor, som kunne fremkalde bekræftet kognitivt underskud og angst-lignende adfærd hos unge vilde-type mus. Denne model kan anvendes til at udforske patogenese af kronisk søvnforstyrrelser og relaterede lidelser.
Abstract
Søvnforstyrrelser er generelt almindelig i populationer som en kronisk sygdom eller en klaget begivenhed. Kronisk søvnforstyrrelser foreslås at være tæt forbundet med patogenese af sygdomme, især neurodegenerative sygdomme. Vi har for nylig konstateret, at 2 måneders søvn fragmentering indledt Alzheimers sygdom (AD)-lignende adfærdsmæssige og patologiske ændringer i unge vilde-type mus. Heri præsenterer vi en standardiseret protokol for at opnå kronisk søvnfragmentering (CSF). Kort, CSF blev induceret af en orbital rotor vibrerende ved 110 omdrejninger i minuttet og opererer med en gentagen cyklus på 10 s-on, 110 s-off, under lys-ON fase (8:00-8:00) kontinuerligt i op til 2 måneder. Svækkelser af rumlig læring og hukommelse, angst-lignende, men ikke depression-lignende adfærd hos mus som konsekvenser af CSF modellering, blev evalueret med Morris vand labyrint (MWM), Novel objekt anerkendelse (NOR), Open field test (OFT) og Tvungen svømning test (FST). Sammenlignet med andre søvnmanipulationer minimerer denne protokol håndteringsarbejde og maksimerer modelleringseffektiviteten. Det producerer stabile fænotyper hos unge mus af vildtypen og kan potentielt genereres til en række forskningsformål.
Introduction
Søvnforstyrrelser bliver mere og mere almindelige både hos patienter med søvnforstyrrelser og raske mennesker med søvnforsnærende hændelser. Det er blevet observeret, at patienter med neurodegenerative sygdomme, kroniske smerter, følelsesmæssig stress, luftvejssygdomme, urinvejssygdomme osv., normalt klager over ubehagelige søvnoplevelser1,2,3,4,5. Obstruktiv søvnapnø (OSA), periodiske lemmer bevægelser i søvn (PLMS), søvn vedligeholdelse søvnløshed blandt andre søvnforstyrrelser er de mest almindelige årsager, som fremkalder søvn fragmentering6,7. I de udviklede lande, OSA har over 5% til 9% prævalens i voksne befolkning og 2% ibørnepopulationen 8,9,10. I mellemtiden er der en stigende andel af den sunde befolkning, der oplever søvnforstyrrelser på grund af overforbrug af smartphones, uregelmæssige søvnvaner, irriterende lyde og arbejdsopgaver, såsom natskift for plejepersonale. Søvn er anerkendt for at være vigtig for hjernens affald clearance11,12, hukommelse konsolidering13,14, metabolisk balance15,16, blandt mange andre fysiologiske processer. Alligevel er det stadig stort set ukendt, om langvarig søvnforstyrrelser giver anledning til irreversible patogeneseændringer hos raske mennesker, og om det er ætiologien eller en medvirkende faktor til at udvikle sygdomme i centralnervesystemet, såsom neurodegenerative sygdomme om et par år nede ad vejen. Vores mål er at rapportere en eksperimentel model, der genererer stabil og tydelig kognitivt underskud og angstlignende adfærd hos unge vilde mus efter en 2-måneders søvnfragmenteringsbehandling. Denne model vil blive anvendt til besvarelse af ovennævnte videnskabelige spørgsmål.
Søvnforstyrrelser er opført som en potentiel risikofaktor for udvikling af Alzheimers sygdom (AD) eller demens. Kang et al. først fundet og beskrev forværringen af AD patologi med 6 timer akut søvnmangel17. Derefter rapporterede mange andre undersøgelser, at søvnmangel eller fragmentering kunne forværre patogenese hos transgene AD-mus modeller18,19,20. Imidlertid har meget få forskere studeret konsekvensen af søvnforstyrrelser hos unge vilde typemus; det vil sige, om søvnforstyrrelser giver anledning til AD-lignende adfærd eller patologiske ændringer hos unge vilde mus. I vores nylige publikation rapporterede vi, at 2 måneders søvnfragmentering inducerede tydeligt rumligt hukommelsesunderskud og angstlignende adfærd samt øget intracellulær Amyloid-β (Aβ) akkumulering både i cortex og hippocampus i 2-3 måneder gamle vilde mus21. Vi observerede også ændrede udtryksniveauer for endosome-autophagosome-lysosome vejmarkører og microglia-aktivering, hvilket svarede til de patologiske ændringer, der blev rapporteret i APP/ PS1-mus21,22.
Denne præsenterede søvn fragmentering (SF) protokol blev valideret af Sinton et al.23 og ændret af Li et al.24. Kort sagt afbryder en orbital rotor, der vibrerer ved 110 omdrejninger i minuttet, søvn i 10 s hver 2. minut i lys-ON-fasen (8:00-20:00). Søvnstrukturændring i denne model var tidligere karakteriseret ved elektrofysiologiske søvnoptagelser og rapporteret af Li et al.24, hvilket indikerer en betydelig stigning i vækningstiden og fald i hurtig øjenbevægelse (REM) søvn i lys-ON-fasen, med de samlede søvn- og vågnetider (i 24 timer) upåvirket efter mere end 4 ugers modellering24. I øjeblikket er total søvn eller delvis søvnmangel de mest anvendte søvnmanipulationsmodeller. Total søvnmangel udføres normalt ved vedvarende skånsom håndtering eller udsætte dyret for nye objekter, alternativt ved kontinuerligt at dreje en bar eller et løbebånd25,26,27,28,29. På grund af etiske årsager er den samlede søvnmangel normalt kortere end 24 timer. Den mest almindeligt anvendte delvise søvnmangel model er vand platform metode, som primært ablating REM søvn30,31,32. Andre tilgange ved hjælp af enten et løbebånd eller en bar, der fejer langs bunden af buret, kan fremkalde søvnfragmentering, når den sættes på med faste intervaller33,34,35,36,37,38. Det er bemærkelsesværdigt, at SF afbryder søvn og periodisk forårsager ophidselser på tværs af alle søvnstadier24. En af de fremtrædende fordele ved denne CSF-model, der anvender orbital rotor, er, at den kan udføres kontinuerligt i måneder, der automatisk styres af maskiner, som undgår hyppig behandling af arbejdskraft dagligt bortset fra regelmæssig overvågning. Desuden vil apparatet gøre det muligt samtidig at modellere flere bure af mus under uniformerede indgreb. Under hele modelleringssessioner er mus anbragt i deres hjemmebure med sædvanlige strøelse og nestematerialer, mens nogle andre metoder kræver eksponering for diversificerede miljøer og uundgåelig stress.
Søvnfragmentering var tidligere kendetegnet ved søvnmanipulationsmetoden, som efterligner hyppige ophidselser i søvnfasen og betydelig søvn rebound under vågnefasen. I nogle litteraturer blev EFSR betragtet som dyremodel for OSA39,40. I denne undersøgelse er begrundelsen for den valgte frekvens af ophidselse, der skal være 30 gange i timen, baseret på observation af ophidselsesindeks hos patienter med moderat til svær søvnapnø. Det blev observeret, at 4 ugers søvnfragmentering signifikant øgede hyperkapitalisk ophidselsesventetid og den taktile ophidselsestærskel, som kunne vare mindst 2 uger efter genopretning24. Denne fænotype blev forklaret ved at afsløre c-fos aktivering reduktion i noradrenergic, orexinergic, histaminergic, og cholinrgic wake-active neuroner som reaktion på hypercapnia, samt reduceret katekisamin og orexinergic fremskrivninger i cingulate cortex24. Det er dog nødvendigt at bemærke, at det vigtigste træk i OSA er hypoxi forårsaget af luftvejsobstruktion, hvilket resulterer i søvnforstyrrelser41,42. Søvnforstyrrelser og gentagne hypoxi interagerer gensidigt med hinanden i OSA-patogenese. Derfor er søvnfragmentering alene muligvis ikke i stand til fuldt ud at demonstrere alle nøglefunktioner i OSA hos mus.
Heri præsenterer vi en standardiseret protokol til model kronisk søvnfragmentering hos unge mus af vild type. Kognitiv underskud og angst-lignende samt depression-lignende adfærd efter CSF behandling blev evalueret af Morris vand labyrint, Novel objekt anerkendelse, Open field test, og Tvungen svømning test. Det er vigtigt at bemærke, at denne model skal tages som en helhed, der genererer fænotyper af dysreguleret søvnmønster, kognitivt underskud og angstlignende adfærd. Den nuværende model kan potentielt anvendes, men ikke begrænses, til følgende formål: 1) Yderligere undersøgelse af de funktionelle eller molekylære patogenesemekanismer forårsaget af kronisk søvnforstyrrelser hos unge mus uden genetisk disposition, 2) Identifikation af den direkte vej, der fører til neurodegeneration indledt af søvnforstyrrelser, 3) Udforskning af behandling for forbedring af fænotyper forårsaget af kronisk søvnforstyrrelser, 4) Undersøgelse af de iboende beskyttende / kompenserende mekanismer i vilde mus ved kronisk søvnforstyrrelser, 5) Skal anvendes til at studere søvn-vågne regulering og tilstand-overgang mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology.
1. Mus screening og forberedelse til forsøget
- Vælg vilde voksne (8-10 uger gamle) hanmus med en vægt på 20-28 g for hele eksperimentet.
BEMÆRK: Mus af vild type C57BL/6 fås fra Hubei Research Center for Laboratory Animals, Hubei, Kina. - Tildel tilfældigt alle mus til EFSR'en og kontrolgruppen. Hus 3-5 mus i hvert bur for at undgå social isolationsstress. Antallet af mus, der er anbragt i kontrolburene, matches med det, der er anbragt i de parrede CSF-bure.
BEMÆRK: Mus i samme gruppebure samles for at udføre opfølgende adfærdseksperimenter. - Find kontrolburene i samme rum med CSF-burene for at holde det omgivende miljø og arbejdseffekterne identiske.
- Nummerer og marker musene i hver gruppe på deres ører ved hjælp af et øremærke til overvågningsformål.
- Der skal opretholdes omgivelsestemperatur og fugtighed mellem 21-23 °C og 35%-60 %.
- Bevar omgivelserne i 12-timers lys-mørk cyklus (8:00-20:00 light-ON, 8:00-8:00 light-OFF), for at undgå partisk effekt på normal søvnrytme hos mus.
- Minimer støj og interferens, mens forskeren er til stede i modelleringsrummet.
- Giv mus tilstrækkelig mad og vand. Brug lange dyser med kugleventilspidser på vandflasker for at forhindre vandlækage på platformens bevægelser. Fastgør vandflasken oven på buret med en fjeder for at undgå forskydning af flasken under rotorløb.
2. Forberedelse og indstilling af orbital rotoren
- Forbered en elektrisk styret orbital rotor med forstørret platform (67 cm x 110 cm), hvor 10 bure højst kan placeres.
- Indstil orbitalrotoren til i lys-ON-fasen (8:00-20:00), der styres af en programtimer, hvilket er det tidspunkt, hvor mus udviser størstedelen af deres daglige søvn.
- Indstil orbital rotoren med en hastighed på 110 omdrejninger i minuttet og en gentagen cyklus på 10 s-on, 110 s-off kontrolleret med en solid-state timer.
BEMÆRK: Platformens lasteevne er 50 kg. Rotorhorisontens faste amplitude vibrerer 2,5 cm. - Fastgør CSF-burene oven på rotorplatformen med tykke fjedre for at forhindre dislokation af bure ved platformsrotationer.
3. Kronisk søvn fragmentering modellering og overvågning
- Placer CSF'ens bure og kontrolmusene i modelleringsrummet i en uge før forsøgene for at lade musene tilpasse sig det omgivende miljø.
- I begyndelsen af modelleringen skal du sikre dig, at alle mus har fri adgang til mad og vand under orbital rotationer.
- I begyndelsen af modelleringen skal du observere mindst 1 time for at sikre, at orbitalrotoren fungerer i gear.
- I modelleringsperioden skal du kontrollere, at orbitalrotoren fungerer korrekt, og mus betingelser hver 2. dag for at sikre, at mus har nok mad og vand. Skift sengetøj af bure ugentligt.
- I modelleringsperioden skal musene vejes ugentligt kl. 8:00, når du skifter sengetøj. Fjern musene med betydeligt vægttab fra modelleringen, og også fra de eksperimentelle grupper.
BEMÆRK: Betydeligt vægttab defineres som vejer mindre end 20 g varer i 2 uger. - Under hele modelleringssessionerne skal du fjerne aggressoren, hvis der er nogen, fra buret og også fra de eksperimentelle grupper.
- Efter afslutningen af modelleringen skal du fortsætte med at vedligeholde og fodre musene i det oprindelige rum.
4. Morris vand labyrint (MWM) test
- Forberedelse til prøven
- Apparatet forberedes på en cirkulær tank fyldt med varmt vand (20-23 °C).
- Ophæng fire skilte med forskellige former og farver på gardinet omkring tanken i fire kvadrant retninger som den fjerne vision reference. Gør vandet til at fremstå uigennemsigtig ved tilsætning af mælkepulver.
- Find en platform midt i den sydvestlige kvadrant.
- Træningsprøven
- Underkaste mus fire på hinanden følgende forsøg mellem 8:00 og 12:00 hver dag over en 5-dages træningsperiode.
- Slip hver mus i vandet mod sidevæggen på en af fire kvadranter i fire forsøg. I hvert forsøg skal du lade musen svømme i 60 s for at finde platformen. Hvis musen ikke er i stand til at ankomme til platformen inden for 60 s, skal du guide den til platformen og forblive der i 15 s.
- Brug et videosporingssystem til automatisk at registrere musenes flugtventetid for at finde den skjulte platform.
- Sondetesten
- Foretag sondetesten den sjette dag efter 5 træningsdage.
- Fjern platformen. Slip hver mus fra den nordøstlige kvadrant og lad den svømme i 60 s
- Brug et videosporingssystem til automatisk at registrere musens trackdata.
5. Test for genkendelse af nye objekter (NOR)
- Den velkendte fase
- Placer mus i en tank (længde 30 cm, bredde 28 cm, højde 35 cm) i rækkefølge, som indeholder to kopier af objekter (A1 og A2). Lad musene udforske frit (10 min pr. Forsøg).
- Brug et videosporingssystem til automatisk at registrere musens trackdata.
- Testfasen
- Foretag testforsøget efter en forsinkelse på 1 time i den velkendte fase. Erstat et af de oprindelige objekter med et nyt objekt ("roman") i tanken, der holder det andet uændret. Returner musene til tanken og lad den udforske i 5 minutter pr. Forsøg.
- Brug et videosporingssystem til automatisk at registrere den tid, der bruges på at udforske hvert objekt af hver mus.
BEMÆRK: Udforskningen af objektet bestemmes ved at slikke, sniffe, tygge eller bevæge vibrissae, mens du orienterer næsen mod og mindre end 1 cm fra objektet. Diskriminationsindekset (DI) beregnes med ligningen (TN − TF)/(TN + TF), hvor TN = tid brugt på at udforske det "nye" objekt og TF = den tid, der bruges på at udforske det "velkendte" objekt.
6. Åben felttest (OFT)
- Forbered apparatet på en tank (30 cm x 28 cm x 35 cm).
- Under testen skal du placere hver mus i midten af tanken og lade den udforske frit i 5 minutter. Rengør tanken med 75% ethanol efter hvert forsøg for at undgå de resterende virkninger af den forrige mus.
- Brug et videosporingssystem til automatisk at registrere musens trackdata.
7. Tvungen svømning test (FST)
- Forbered apparatet på et åbent cylindrisk kar, som indeholder vand (20-23 °C), der er 15 cm dybt.
- Under testen skal du placere hver mus i cylinderen og lade den forblive der i 6 minutter.
- Brug et videosporsystem til automatisk at registrere immobilitetstiden i løbet af de sidste 4 minutter af testen med hver mus.
BEMÆRK: Musen er fast besluttet på at være immobil, når den holder op med at kæmpe og flyder i vandet, hvilket kun gør bevægelser, der er nødvendige for at holde hovedet over vandet.
8. Dataanalyse
- Analyser data ved hjælp af statistisk analysesoftware (f.eks. GraphPad Prism 6.0).
- Udtryk alle data som middelvej ± SEM.
- Sammenlign escape-latenstid i MWM-test mellem to grupper ved hjælp af tovejs ANOVA med gentagne foranstaltninger efterfulgt af Bonferroni-obduktioner. Andre sammenligninger mellem EFSR'en og kontrolgrupperne bestemmes af ikke-fortringsfrie test.
- Overvej forskelle signifikante, hvis P < 0,05 i alle test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle de repræsentative resultater og tal er gengivet i vores seneste publikation21. Genbrug af tallene var tilladt i den oprindelige kladde.
Hele eksperimentelt design er illustreret i tidsrækkefølgen, hvilket indikerer timingen af CSF-modellering, adfærdstest af MWM, NOR, OFT og FST (Figur 1A). Vi opnåede vægte af mus hver uge fra CSF og kontrolgrupperne for at overvåge deres generelle forhold under modelleringssessionerne. Der blev ikke fundet nogen tydelig forskel i vægtstigningen hos mus mellem to grupper under modelleringen (figur 1B).
For at evaluere CSF's virkninger på rumlig læring og hukommelsesydeevne gennemførte vi MWM-adfærdsforsøg43,44. FSR-gruppen udviste dårligere flugtkapaciteter for at finde platformen i løbet af 5 træningsdage sammenlignet med kontrolgruppen (Figur 2A). I sondetesten brugte EFSR-musene betydeligt mindre tidsandel i den målrettede kvadrant og krydsede den tidligere perronplacering med færre gange (figur 2B,C) uden forskel i svømmehastighed (figur 2D). Disse ovennævnte resultater tydede på, at musenes rumlige indlærings- og hukommelsesudtagningskapacitet blev forringet efter EFSR.
Vi har også udført NOR-test for at vurdere objektgenkendelse og korttidsarbejdshukommelse efter CSF45. I den velkendte fase var der ingen signifikant forskel i den samlede efterforskningstid mellem EFSR'en og kontrolgruppen (figur 3A). Tilsvarende blev der ikke fundet nogen forskelle i efterforskningstiden mellem objekterne A1 og A2 i henholdsvis to grupper (Figur 3B). Ovenstående resultater garanterede, at der ikke var nogen forskelle i musenes evner til udforskning og præferencer for placering. I testfasen blev FSR-musenes diskriminationsindeks (DI) reduceret betydeligt i forhold til kontrollerne (figur 3C), hvilket åbenbart tydede på underskud i objektgenkendelse og korttidsarbejdshukommelse efter EFSR.
Vi udførte yderligere OFT og FST for henholdsvis at undersøge angstlignende og depressionslignende adfærd hos mus46,47. Interessant nok blev det i OFT konstateret, at FSR-gruppen brugte mindre tid i den centrale zone end kontrolgruppen (Figur 4A), som illustrerede, at søvnfragmentering til en vis grad kunne fremkalde angstlignende adfærd. Derudover udstillede CSF-mus længere samlet afstand flyttet i tanken (Figur 4B), hvilket tyder på øget spontan aktivitet efter modellering. Ikke desto mindre kunne denne CSF-modellering ikke fremkalde depressionslignende adfærd, verificeret af ikke-signifikant forskel i immobilitetstiden mellem to grupper, der er udsat for FST (Figur 4C).
Figur 1: Rutediagrammet over eksperimentel designprocedure. (a)Den eksperimentelle konstruktionsprocedure, der angiver tidspunktet for EFSR-modellerings- og adfærdstest (dvs. MWM, NOR, OFT og FST). B) FSR's og kontrolmusenes kropsvægtkurver i den første måned efter afslutningen af EFSR-modellen. Dette tal er blevet ændret fra Xie et al.21Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: CSF-forringet rumlig indlærings- og hukommelsesevne evalueret ved MWM-test. (A) EFSR-musene udførte længere udslipsventetid sammenlignet med kontrolmusene under 5-dages træningstesten. **p < 0,01. (B) I sondetesten udviste EFSR-musene mindre procentid i perronkvadranten i modsætning til kontrolmusene. Øverste panel viser repræsentative sporinger af to grupper. p < 0,0001. (C) I sondetesten foretog EFSR-gruppen færre gange for passage af perronens placering sammenlignet med kontrolgruppen. *p < 0,05. d) Svømmehastigheden for to grupper i sondeprøven. n.s. indikerer, at ændringer mellem forskellige grupper ikke var signifikante. Data blev alle præsenteret som middelværdi ± SEM. n = 10 pr. gruppe. Dette tal er blevet ændret fra Xie et al.21Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: FSR nedsat objektgenkendelse og korttidsarbejdshukommelse evalueret af NOR-testen. (A) Den samlede efterforskningstid mellem EFSR'en og kontrolmusene i den velkendte fase, n.s. indikerer ingen væsentlige ændringer mellem forskellige grupper. (B) Efterforskningstiden for objekterne A1 og A2 mellem to grupper i den velkendte fase. n.s. angiver ingen væsentlige ændringer mellem forskellige grupper. (C) I testfasen blev FSR-gruppens forskelsbehandlingsindeks (DI) reduceret betydeligt i forhold til kontrolgruppens. *p < 0,05. Data blev alle præsenteret som middelværdi ± SEM. n = 10 pr. gruppe. Dette tal er blevet ændret fra Xie et al.21Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: EFSR forværret angst-lignende, men ikke depression-lignende adfærd evalueret af OFT og FST. (A) EFSR-musene tilbragte mindre tid i den centrale zone i de observerede 5 minutter sammenlignet med kontrolmusene i OFT. *p < 0,05. (B) CSF-gruppen udviste længere samlet afstand, der blev flyttet i tanken i forhold til kontrolgruppen i OFT. *p < 0,05. (C) Ubevægelighedstiden mellem EFSR'en og kontrolgrupperne i FST. n.s. angiver ingen væsentlige ændringer mellem forskellige grupper. Data blev alle præsenteret som middelværdi ± SEM. n = 10 pr. gruppe. Dette tal er blevet ændret fra Xie et al.21Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i den nuværende protokol omfatter opsætning af søvnfragmenteringsmaskiner med de optimerede parametre i henhold til undersøgelsesformålet og vedligeholdelse af musene i behageligt og roligt miljø gennem hele modelleringssessionerne. Det er også vigtigt at beslutte den korrekte timing for at afbryde eller stoppe søvnfragmentering og arrangere adfærdstest for disse mus. Ligesom andre søvnmanipulationsmodeller er det vigtigt at udføre protokollen i et dedikeret rum med kontrollerede lyscyklusser og ugyldig af alle mulige unødvendige forstyrrelser. Der bør gøres en indsats for at undgå at fremkalde lyde og minimere forskernes driftstid til kontrol, genopfyldning af fødevarer og vandforsyning, ændring af strøelse osv. I sjældne tilfælde er der aggressorer, der angriber littermates, især ved indledningen af ubehagelige søvnforstyrrelsessessioner. Aggressoren, når den er til stede, skal fjernes ud af hjemmeburene såvel som forsøgsgrupperne. De fleste af forsøgsdyrene, bortset fra nogle få til vores erfaring, ville tilpasse sig behandlingen og formår at få adgang til vand og mad efter behov. Mus med iboende problemer, såsom deforme tænder, undervægtige og hudsår kan forårsage vægttab eller svaghed. De skal også undgås at blive brugt til modellering. Da denne protokol potentielt kan fremkalde kronisk stress og metabolisk dysregulering, er det vigtigt at bruge mus screenet med uniformerede kriterier, såsom kropsvægt, til modellering og eksperimenter.
I den beskrevne protokol tændes orbitalrotoren automatisk i løbet af 8:00-20:00 (light-ON) dagligt, hvilket er det tidspunkt, hvor mus udviser det meste af deres daglige liv. Rotoren blev sat kørende på en gentagen cyklus på 10 s-on, 110 s-off i lys-ON fase for at fremkalde hyppige ophidselser. Forskellige modellering varigheder ville give anledning til forskellige fænotyper. Akut søvnfragmentering kan resultere i absolut reduktion i søvnvarighed, øget sympatisk nervesystemaktiviteter, såsom forhøjede kortisonniveauer og nedsat insulinfølsomhed23,24. Imidlertid viste kronisk søvnfragmentering upåvirket kortisonniveauer og afbalanceret samlet søvntid24. Eventuelle ændringer baseret på den aktuelle protokol, såsom lyscyklusser, matchede vibrerende indstillinger (hastighed, amplitude, gentagen cyklus osv.) og modelleringsvarigheder, kan potentielt ændre fænotyperne. Det er nødvendigt at foretage søvnregistrering og søvnstrukturanalyse under forskellige modelleringsindstillinger for at identificere søvnfostyperne. Det kan også resultere i markante adfærdsmæssige og patologiske ændringer. Da vi udforskede det kognitive underskud efter langvarig snarere end en nats søvnfragmentering og havde tendens til at undgå de partiske virkninger af intermitterende søvnfragmentering på musadfærd i MWM og NOR, udførte vi disse to adfærdstest efter afslutning af CSF-protokollen på dag 60. Virkningen af genvindingssøvn hos mus kan dog uundgåeligt have forvirret resultaterne for MWM og NOR vist.
Selv om denne model er berettiget med søvn fragmentering model, er det faktisk består af fragmenteret søvn mønstre i lys-ON fase, dysregulering af døgnrytmen, og kompenserende søvn rebound i lys-OFF fase. Denne protokol kunne fremkalde ikke kun søvnmønsterændringer, men også betydelig neuroinflammation, metabolisk ubalance, immunsystemforstyrrelserosv. 21,23,24. Alle disse patologiske processer kan interagere med hinanden og mægle fænotyper som et orkester. Denne model bør tages som en helhed for at generere musene med fænotyper af dysreguleret søvnmønster, kognitivt underskud og angstlignende adfærd hos unge vilde mus. Som nævnt i det foregående afsnit afspejler denne model ikke nøjagtigt OSA på grund af mangel på gentagen hypoxi. En anden begrænsning er, at det er svært at generere nøjagtige patologiske ændringer og søvnphoenotyper i de samme mus. Den udbredte EEG/ EMG elektrode implantation til søvnregistrering uundgåeligt induceret svær gliose i cortex48. I de senere år blev videoovervågnings- og billedanalyseteknikker baseret på kunstig intelligens anvendt i søvnundersøgelser, som ville indsamle præcise søvnoplysninger uden invasiv elektrodeimplantation49,50,51.
Betydningen af denne EFSR-metode i sammenligning med eksisterende metoder omfatter: 1) Forskellig fra søvnmangel protokoller, der normalt udføres i timevis eller dage, den nuværende protokol bedre efterligner langsigtede søvnforstyrrelser hos raske mennesker. Den kompenserende søvn rebound i søvn fragmenterede mus afspejler perfekt dagtimerne somnolence og retardant arbejdsindsats hos mennesker med dårlig søvnkvalitet i løbet af natten52,53. 2) Det er indtil videre den eneste kroniske søvnfragmenteringsmodel hos unge vilde mus med bekræftet kognitivt underskud og angstlignende, men ikke depressionslignende adfærdsphoenotyper samt åbenlyse molekylære patologiske ændringer i hjernevæv. 3) Denne behandling forårsager mildere irritationer til mus, så modelleringen kan vare i måneder, selv med mulighed for at blive udført i længere tid. 4) Med korrekte indstillinger kan denne model generere stabile fænotyper af søvnforstyrrelser, kognitivt underskud og angstlignende adfærd, som kan bruges enten som sygdomsmodeller eller interventioner til forskellige undersøgelsesdesign. 5) Nogle søvnmangel modeller kræver fuld session indblanding af forskere til at anvende blid håndtering eller nye objekter. Bortset fra regelmæssig overvågning minimerer denne metode håndtering af arbejde, hvilket også eliminerer den kunstige bias.
Denne EFSR-protokol giver mulighed for at besvare en række vigtige videnskabelige spørgsmål, såsom kronisk søvnforstyrrelser årsagen eller konsekvensen af neurodegenerative sygdomme? Er kronisk søvnforstyrrelser induceret patogenese under ung alder reversibel? Varierer kompenserende mekanismer ved kroniske søvnforstyrrelser mellem unge og ældre, raske mennesker og patienter? Denne protokol kan også anvendes til at udforske behandling ved at vurdere sværhedsgraden og forbedringen af adfærdsmæssige og molekylære fænotyper. Det ville også blive anvendt til model musene med kronisk craniectomy, optisk fiber implantation præparater til funktionelle optagelser. Desuden kan det muligvis bruges som interventionsstrategi for at fremkalde eller forværre fænotyper ud over allerede eksisterende forhold. Endelig kan det bruges til at studere søvn-vågne tilstand overgangsmekanismer. Interessant nok kunne den nuværende CSF-model fremkalde angstlignende snarere end depressionslignende adfærd hos mus, hvilket er i overensstemmelse med den kliniske observation af, at søvnforstyrrelser hos patienter sandsynligvis ville være forbundet meget mere med angst end med depression54,55. Det giver en praktisk model til at studere følelsesmæssige lidelser hos gnavere.
Sammenfattende præsenterer vi protokollen til modellering af kronisk søvnfragmentering ved hjælp af en vibrerende orbital rotor, som kan producere stabile fænotyper hos unge vilde mus og minimere modelleringsarbejde med høj effektivitet. Det kan potentielt genereres til en række forskningsformål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (61327902-6 til W. Wang og 81801318 til F.F. Ding). Vi anerkender Dr. Sigrid Veasy for at etablere SF eksperimentelle system og venligt give tekniske detaljer. Vi anerkender Dr. Maiken Nedergaard for lærerige kommentarer til relaterede eksperimenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Any-maze behavior tracking system | Stoelting,Inc,USA | - | A video-tracking system which was used to record the behavior track of mice. |
| C57BL/6J mice | Hubei Research Center for Laboratory Animals, Hubei, China. | - | healthy male C57BL/6J mice aged 10-12 weeks were purchased from Hubei Research Center for Laboratory Animals |
| Graphpad Prism 6.0 Software | Graphpad Software,Inc.USA | - | Graphpad Prism 6.0 software was used to draw statistical graphs. |
| Morris water maze system | Shanghai XinRuan Information Technology Co.,Ltd,China | XR-XM101 | The system was used to perform Morris water maze test |
| Orbial rotor | Shanghai ShiPing Laboratory Equipment Co.,Ltd,China | SPH-331 | The orbital rotor was used to establish the chronic sleep fragmentation model |
| Solid state timer | OMRON Corporation, Kyoto, Japan | H3CR-F8-300 | The solid state time was used to control the frequency and time of the rotor running |
| Wooden Lusterless Tank | - | - | length 30 cm, width 28 cm, height 35 cm The tank was used to perform open field test and novel object recognition test |
References
- Peter-Derex, L., Yammine, P., Bastuji, H., Croisile, B. Sleep and Alzheimer's disease. Sleep Medicine Reviews. 19, 29-38 (2015).
- Mathias, J. L., Cant, M. L., Burke, A. L. J. Sleep disturbances and sleep disorders in adults living with chronic pain: a meta-analysis. Sleep Medicine. 52, 198-210 (2018).
- Murphy, M. J., Peterson, M. J. Sleep Disturbances in Depression. Sleep Medicine Clinics. 10 (1), 17-23 (2015).
- Walter, L. M., et al. Sleep disturbance in pre-school children with obstructive sleep apnoea syndrome. Sleep Medicine. 12 (9), 880-886 (2011).
- Helfand, B. T., et al. The relationship between lower urinary tract symptom severity and sleep disturbance in the CAMUS trial. Journal of Urology. 185 (6), 2223-2228 (2011).
- Kimoff, R. J. Sleep fragmentation in obstructive sleep apnea. Sleep. 19 (9), Suppl 61-66 (1996).
- Dhondt, K., et al. Sleep fragmentation and periodic limb movements in children with monosymptomatic nocturnal enuresis and polyuria. Pediatric Nephrology. 30 (7), Berlin, Germany. 1157-1162 (2015).
- Young, T., Peppard, P. E., Gottlieb, D. J. Epidemiology of obstructive sleep apnea: a population health perspective. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 165 (9), 1217-1239 (2002).
- Peppard, P. E., et al. Increased prevalence of sleep-disordered breathing in adults. American Journal of Epidemiology. 177 (9), 1006-1014 (2013).
- Marcus, C. L., et al. Diagnosis and management of childhood obstructive sleep apnea syndrome. Pediatrics. 130 (3), 714-755 (2012).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), New York, N.Y. 373-377 (2013).
- Benveniste, H., et al. The Glymphatic System and Waste Clearance with Brain Aging: A Review. Gerontology. 65 (2), 106-119 (2019).
- Stickgold, R., Walker, M. P. Memory consolidation and reconsolidation: what is the role of sleep. Trends in Neurosciences. 28 (8), 408-415 (2005).
- Stickgold, R. Sleep-dependent memory consolidation. Nature. 437 (7063), 1272-1278 (2005).
- Aalling, N. N., Nedergaard, M., DiNuzzo, M. Cerebral Metabolic Changes During Sleep. Current Neurology and Neuroscience Reports. 18 (9), 57 (2018).
- Rempe, M. J., Wisor, J. P. Cerebral lactate dynamics across sleep/wake cycles. Frontiers in Computational Neuroscience. 8, 174 (2014).
- Kang, J. E., et al. Amyloid-beta dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (5955), New York, N.Y. 1005-1007 (2009).
- Minakawa, E. N., et al. Chronic sleep fragmentation exacerbates amyloid beta deposition in Alzheimer's disease model mice. Neuroscience Letters. 653, 362-369 (2017).
- Qiu, H., et al. Chronic Sleep Deprivation Exacerbates Learning-Memory Disability and Alzheimer's Disease-Like Pathologies in AβPP(swe)/PS1(ΔE9) Mice. Journal of Alzheimer's Disease : JAD. 50 (3), 669-685 (2016).
- Holth, J. K., et al. The sleep-wake cycle regulates brain interstitial fluid tau in mice and CSF tau in humans. Science. 363 (6429), New York, N.Y. 880-884 (2019).
- Xie, Y., et al. Chronic sleep fragmentation shares similar pathogenesis with neurodegenerative diseases: Endosome-autophagosome-lysosome pathway dysfunction and microglia-mediated neuroinflammation. CNS Neuroscience & Therapeutics. 26 (2), 215-227 (2020).
- Ba, L., et al. Distinct Rab7-related Endosomal-Autophagic-Lysosomal Dysregulation Observed in Cortex and Hippocampus in APPswe/PSEN1dE9 Mouse Model of Alzheimer's Disease. Chinese Medical Journal (England). 130 (24), 2941-2950 (2017).
- Sinton, C. M., Kovakkattu, D., Friese, R. S. Validation of a novel method to interrupt sleep in the mouse. Journal of Neuroscience Methods. 184 (1), 71-78 (2009).
- Li, Y., et al. Effects of chronic sleep fragmentation on wake-active neurons and the hypercapnic arousal response. Sleep. 37 (1), 51-64 (2014).
- Misrani, A., et al. Differential effects of citalopram on sleep-deprivation-induced depressive-like behavior and memory impairments in mice. Progress Neuro-psychopharmacology & Biological Psychiatry. 88, 102-111 (2019).
- Xu, A., et al. Roles of hypothalamic subgroup histamine and orexin neurons on behavioral responses to sleep deprivation induced by the treadmill method in adolescent rats. Journal of Pharmacological Sciences. 114 (4), 444-453 (2010).
- Saito, L. P., et al. Acute total sleep deprivation potentiates amphetamine-induced locomotor-stimulant effects and behavioral sensitization in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 117, 7-16 (2014).
- Spano, G. M., et al. Sleep Deprivation by Exposure to Novel Objects Increases Synapse Density and Axon-Spine Interface in the Hippocampal CA1 Region of Adolescent Mice. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (34), 6613-6625 (2019).
- Morrow, J. D., Opp, M. R. Sleep-wake behavior and responses of interleukin-6-deficient mice to sleep deprivation. Brain, Behavior, and Immunity. 19 (1), 28-39 (2005).
- Arthaud, S., et al. Paradoxical (REM) sleep deprivation in mice using the small-platforms-over-water method: polysomnographic analyses and melanin-concentrating hormone and hypocretin/orexin neuronal activation before, during and after deprivation. Journal of Sleep Research. 24 (3), 309-319 (2015).
- Aleisa, A. M., Alzoubi, K. H., Alkadhi, K. A. Post-learning REM sleep deprivation impairs long-term memory: reversal by acute nicotine treatment. Neuroscience Letters. 499 (1), 28-31 (2011).
- Zagaar, M., Dao, A., Alhaider, I., Alkadhi, K. Regular treadmill exercise prevents sleep deprivation-induced disruption of synaptic plasticity and associated signaling cascade in the dentate gyrus. Molecular and Cellular Neurosciences. 56, 375-383 (2013).
- McKenna, J. T., et al. Sleep fragmentation elevates behavioral, electrographic and neurochemical measures of sleepiness. Neuroscience. 146 (4), 1462-1473 (2007).
- Tartar, J. L., et al. Hippocampal synaptic plasticity and spatial learning are impaired in a rat model of sleep fragmentation. The European Journal of Neuroscience. 23 (10), 2739-2748 (2006).
- Guzman-Marin, R., Bashir, T., Suntsova, N., Szymusiak, R., McGinty, D. Hippocampal neurogenesis is reduced by sleep fragmentation in the adult rat. Neuroscience. 148 (1), 325-333 (2007).
- Nair, D., et al. Sleep fragmentation induces cognitive deficits via nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-dependent pathways in mouse. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (11), 1305-1312 (2011).
- McCoy, J. G., et al. Experimental sleep fragmentation impairs attentional set-shifting in rats. Sleep. 30 (1), 52-60 (2007).
- Dumaine, J. E., Ashley, N. T. Acute sleep fragmentation induces tissue-specific changes in cytokine gene expression and increases serum corticosterone concentration. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (12), 1062-1069 (2015).
- Carreras, A., et al. Chronic sleep fragmentation induces endothelial dysfunction and structural vascular changes in mice. Sleep. 37 (11), 1817-1824 (2014).
- Khalyfa, A., et al. Circulating exosomes potentiate tumor malignant properties in a mouse model of chronic sleep fragmentation. Oncotarget. 7 (34), 54676-54690 (2016).
- Ferreira, C. B., Cravo, S. L., Stocker, S. D. Airway obstruction produces widespread sympathoexcitation: role of hypoxia, carotid chemoreceptors, and NTS neurotransmission. Physiological Reports. 6 (3), (2018).
- Tripathi, A., et al. Intermittent Hypoxia and Hypercapnia, a Hallmark of Obstructive Sleep Apnea, Alters the Gut Microbiome and Metabolome. mSystems. 3 (3), (2018).
- D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Research. Brain Research Reviews. 36 (1), 60-90 (2001).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
- Vogel-Ciernia, A., Wood, M. A. Examining object location and object recognition memory in mice. Current Protocols in Neuroscience. 69, 1-17 (2014).
- Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The Open Field Test for Measuring Locomotor Activity and Anxiety-Like Behavior. Methods in Molecular Biology. 1916, Clifton, N.J. 99-103 (2019).
- Porsolt, R. D., Bertin, A., Blavet, N., Deniel, M., Jalfre, M. Immobility induced by forced swimming in rats: effects of agents which modify central catecholamine and serotonin activity. European Journal of Pharmacology. 57 (2-3), 201-210 (1979).
- Hauglund, N. L., Kusk, P., Kornum, B. R., Nedergaard, M. Meningeal Lymphangiogenesis and Enhanced Glymphatic Activity in Mice with Chronically Implanted EEG Electrodes. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
- Nguyen-Michel, V. H., et al. Rapid eye movement sleep behavior disorder or epileptic seizure during sleep? A video analysis of motor events. Seizure. 58, 1-5 (2018).
- Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31 (11), 1587-1598 (2008).
- Abad, J., et al. Automatic Video Analysis for Obstructive Sleep Apnea Diagnosis. Sleep. 39 (8), 1507-1515 (2016).
- Sandlund, C., Hetta, J., Nilsson, G. H., Ekstedt, M., Westman, J. Impact of group treatment for insomnia on daytime symptomatology: Analyses from a randomized controlled trial in primary care. International Journal of Nursing Studies. 85, 126-135 (2018).
- Shekleton, J. A., Rogers, N. L., Rajaratnam, S. M. Searching for the daytime impairments of primary insomnia. Sleep Medicine Reviews. 14 (1), 47-60 (2010).
- Dixon, L. J., Lee, A. A., Gratz, K. L., Tull, M. T. Anxiety sensitivity and sleep disturbance: Investigating associations among patients with co-occurring anxiety and substance use disorders. Journal of Anxiety Disorders. 53, 9-15 (2018).
- Press, Y., Punchik, B., Freud, T. The association between subjectively impaired sleep and symptoms of depression and anxiety in a frail elderly population. Aging Clinical and Experimental Research. 30 (7), 755-765 (2018).
