De vorming van een goed sarcomerenetwerk is belangrijk voor de rijping van iPSC-afgeleide cardiomyocyten. We presenteren een super resolutie-gebaseerde aanpak die het mogelijk maakt voor de kwantitatieve evaluatie van de structurele rijping van stamcel afgeleide cardiomyocyten, ter verbetering van de cultuuromstandigheden ter bevordering van de ontwikkeling van het hart.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Analyseren van de α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocyten Using Single Molecule Localization Microscopy
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De rijping van iPSC-afgeleide cardiomyocyten is een cruciaal probleem voor hun toepassing in regeneratieve therapie, drugstesten en ziektemodellering. Ondanks de ontwikkeling van meerdere differentiatieprotocollen blijft de generatie iPSC cardiomyocyten die lijken op een volwassen fenotype een uitdaging. Een belangrijk aspect van cardiomyocyten rijping omvat de vorming van een goed georganiseerd sarcomere netwerk om een hoge contractiecapaciteit te garanderen. Hier presenteren we een super resolutie-gebaseerde aanpak voor semi-kwantitatieve analyse van het α-actinin netwerk in cardiomyocyten. Met behulp van fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie werd een vergelijking gemaakt van de sarcomerelengte en de z-discdikte van iPSC-afgeleide cardiomyocyten en hartcellen geïsoleerd van neonatale weefsel. Tegelijkertijd tonen we het belang aan van goede beeldvormingsvoorwaarden om betrouwbare gegevens te verkrijgen. Onze resultaten tonen aan dat deze methode geschikt is om de structurele rijpheid van hartcellen met een hoge ruimtelijke resolutie kwantitatief te monitoren, waardoor zelfs subtiele veranderingen van de sarcomere organisatie kunnen worden gedetecteerd.
Inleiding
Hart- en vaatziekten (CVD) zoals een hartinfarct of cardiomyopathie blijven de belangrijkste doodsoorzaak in de westerse wereld1. Aangezien het menselijk hart slechts een slechte regeneratieve capaciteit bezit, is er behoefte aan strategieën om het herstel van CVD's te bevorderen. Dit omvat celvervangende therapieën om verloren cardiomyocyten (CM) aan te vullen, evenals de ontwikkeling van nieuwe antiritmische geneesmiddelen voor efficiënte en veilige farmaceutische interventie. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) zijn aangetoond dat een veelbelovende celbron voor de onbeperkte generatie van menselijke CM in vitro, geschikt voor regener....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle stappen in dit protocol met neonatale en volwassen muizen werden uitgevoerd volgens de ethische richtlijnen voor de dierverzorging van het Rostock Universitair Medisch Centrum.
1. Teelt en dissociatie van iPSC-afgeleide cardiomyocyten
- Onderscheid hiPSC-CMs gedurende 25 dagen met behulp van een 2D monolayer methode zoals eerder beschreven17.
- Prewarm dissociatiemedium tot 37 °C en steun middel tot kamertemperatuur.
- Was cellen twee keer met PBS.
- Voeg voorverwarmd dissociatiemedium toe aan cellen en broed gedurende 12 minuten bij 37 °C en 5% CO2.
- Voeg onde....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Voor het schatten van de mate van structurele rijping van CM, neonatale, volledig volwassen volwassen, en iPSC CM werden in eerste instantie gelabeld de CM met α-actinine antilichaam om het sarcomere netwerk te visualiseren. Na palm-acquisitie werden beelden gereconstrueerd en werd de dikte van de Z-disc gemeten met behulp van op plugin gebaseerde beeldverwerkingssoftware voor de automatische detectie van de breedte van individuele filamenten. Sarcomere lengte werd berekend door het meten van de afstand tussen twee aangr.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De generatie van functionele iPSC-afgeleide CM in vitro is belangrijk voor regeneratieve therapieën, ziektemodellering en de ontwikkeling van drugscreeningplatforms. Echter, onvoldoende rijpheid van deze CM is een groot obstakel in cardiovasculair onderzoek20. In dit verband zijn beeldvormingstechnieken met hoge resolutie nodig die het mogelijk maken de structurele rijpingstoestand van iPSC-afgeleide CM te monitoren. Tegelijkertijd kan microscopie met superresolutie een waardevol hulpmiddel zijn o.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door het Structuurfonds van de EU (ESF/14-BM-A55-0024/18). Daarnaast wordt H.L. ondersteund door het FORUN Programma van het Rostock Universitair Medisch Centrum (889001 en 889003) en de Josef and Käthe Klinz Foundation (T319/29737/2017). C.I.L. wordt ondersteund door het Clinician Scientist Program van het Rostock University Medical Center. R.D wordt ondersteund door de DFG (DA1296/6-1), de DAMP foundation, de Duitse Hartstichting (F/01/12) en de BMBF (VIP+ 00240).
Wij danken Madeleine Bartsch voor haar technische ondersteuning in de iPSC celcultuur en hartdifferentiatie.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
Referenties
- McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
