超高速ウェスタンブロッティング技術は、免疫反応促進剤と組み合わせて、環状ドレインおよび補充(CDR)技術を介して抗原抗体結合の運動を改善することによって開発される。
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この記事について
サマリー
要約
ウェスタンブロット(免疫ブロットとも呼ばれる)は、生物医学研究のための正規の方法です。これは、特定のタンパク質の相対的なサイズと存在量だけでなく、翻訳後のタンパク質修飾を決定するために一般的に使用されます。この技術は豊かな歴史を持ち、そのシンプルさのために広く使用されています。しかし、ウェスタンブロッティング手順は、スループットを制限する長いインキュベーション時間であるという重大なボトルネックで、完了までに数時間、さらには数日かかることで有名です。これらのインキュベーションステップは、バルク溶液から膜上の固定化された抗原への抗体の拡散が遅いために必要とされる:膜付近の抗体濃度はバルク濃度よりもはるかに低い。ここでは、抗体溶液の循環ドレインおよび補充(CDR)による抗原結合を改善することにより、これらのインキュベーション間隔を劇的に短縮するイノベーションを提示する。また、免疫反応増強技術を用いて、アッセイの感度を維持しました。市販の免疫反応増強剤とのCDR法の組合せは、出力シグナルを高め、抗体インキュベーション時間を実質的に短縮した。得られた超高速のウェスタンブロットは感受性の損失なしで20分で達成することができる。この方法は、化学発光と蛍光検出の両方を使用してウェスタンブロットに適用することができます。この簡単なプロトコルにより、研究者は多くのサンプルでタンパク質発現の分析をよりよく探求することができます。
概要
ウェスタンブロット(イムノブロットとも呼ばれる)は、幅広い科学的および臨床的分野にわたる強力で基本的な技術です。この技術は、タンパク質1の存在、相対的存在量、相対分子質量、および翻訳後修飾を調べるために使用される。デジタル画像解析と組み合わせることで、この方法はタンパク質およびタンパク質修飾の豊富さを確実に分析することができます2.ウェスタンブロットは日常的に行われますが、時間と労力を要する方法です。膜を有する抗体の長いインキュベーションが必要です。ここでは、感度を犠牲にすることなくこの制限を克服するインキュベーション法の改変について述べる。
膜のインキュベーション中、抗体は溶液中に浮遊し、抗原は膜上に固定化される。その高い親和性のために、抗体が抗原に結合する速度は、バルク溶液から膜への抗体の拡散よりも速い。これにより、低濃度の「枯渇層」が作成されます(図1)。この技術では、より遠い抗体が受動的拡散によって膜に到達するまでに数時間かかることがあります。この効果は、大量輸送制限(MTL)3と呼ばれます。抗体含有溶液の繰り返しの排水と補充は、枯渇層を破壊し、MTL4を克服する可能性が提案されている。ここでは、従来のウェスタンブロッテ....
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プロトコル
1. SDS-ページとPVDF膜への転送
- 相対サイズに基づいてタンパク質を分離するためにSDS-PAGEを行います。
注:商用または自家製のゲルシステムは問題ありません。製造元のプロトコルに従ってください。 - 分離したタンパク質をゲルからPVDF膜に移す。
注:一般的な転送方法(半乾式または湿式転送)が適しています。製造元のプロトコルに従ってください。
2. PVDF膜の遮断
- 膜を室温で撹拌して1時間適切なブロッキングバッファーにインキュベートします。
注:一次抗体および検出システムに応じて、適切なブロッキングバッファを選択する必要があります。例えば、最も典型的なブロッカーはBSA、非脂肪乾燥乳、カゼイン、および市販の合成ポリマーである。Tween20 が 0.1% の PBS および TBS は、最も一般的に使用されるバッファーです。このブロッキング工程は、4°Cで一晩行なわれてもよい。
3. 一次抗体によるインキュベーション
- 蒸留水で10%免疫反応増強剤-1溶液(IRE-1)を調製する。渦はよく。
- 10%IRE-1で希釈された一次抗体を調製します。やさしく、十分に混ぜます。
- より大きな膜(4 cm x 8 cm - 8 cm x 8 cm)を使用する場合は、抗....
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結果
この例は、ウェスタンブロット上の免疫増強技術と共にCDR法の有効性を示す。スタティックインキュベーションは、PVDF膜を抗体溶液と共にインキュベートした半透明のフレキシブルフィルムに対して行ったのに対し、CDRインキュベーションは膜および抗体溶液を含む回転チューブによるハイブリダイゼーションオーブン中であった(Movie)。 図2 は、ウェスタンブロット上の化学発光検出に必要な抗原量および抗体をそれぞれ示した。静的およびCDRインキュベーションの両方で、IRE溶液の使用は感度を高めました:IREは、静的条件下でß-アクチンを検出するために必要な細胞溶解物(抗原)の最小量を2.2μgから1.1μgに減少させ、CDRを使用して1.1 μgから0.275 μgにさらに減少しました(図2A)。同様に、抗6x Hisタグ抗体の最小濃度は、静的条件下では100 ng/mLから50ng/mLに、CDR条件下では100 ng/mLから12.5ng/mLに低下した(図2B)。5.......
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ディスカッション
ウェスタンブロットは、約40年前に開発された特定のタンパク質を検出するために広く使用されている分析技術です7,8.それ以来、技術は進化し続けており、その後の技術革新により、技術2、9、10、11、12、13の感度、速度、定量性が向上しています。ここで紹介する強化された超高速ウェスタンブロッティングプロトコルは、既存の技術にいくつかの大幅な強化を行います。IREによる検出閾値を下げることにより、感度を犠牲にすることなくインキュベーション時間を短縮します。特別なまたは高価な機器は必要ありません:ハイブリダイゼーションオーブンでチューブ.......
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開示事項
著者らは、この記事の内容に直接関係する競合する利益を宣言していません。
謝辞
この研究は、国立衛生研究所の国立心臓・肺・血液研究所の壁内研究部門によって支援されました。S.H.は日本の官民パートナーシップ学生留学プログラムの支援を受け、H.N.とK.Y.は武勇とVドラッグ海外研修奨学金を受けた。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 14 mL丸底高透明度PP試験管、目盛り付き、スナップキャップ | 付き、ファルコン | 352059 | |
| アポロ透明フィルム、レーザープリンター用 | N/A | N/A | レーザープリンター透明フィルムは問題ありません。 |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | 化学発光および/または蛍光検出には、あらゆる種類の画像取得システムに適しています。 |
| シグナル免疫反応増強剤溶液 | 東洋紡 | NKB-101 | |
| CARNATION インスタント無脂肪ドライミルク | カーネーション | N/A | |
| ECL 抗マウス IgG、西洋わさびペルオキシダーゼ リンク F(ab')ヒツジからの2つの断片 | Healthcare | NA9310V | |
| ECL抗ウサギIgG、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合F(ab')ロバからの2つのフラグメント | ヘルスケア | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A チューブ | が水平位置で均等に回転している限り、任意のハイブリダイゼーションオーブンで問題ありません。 |
| Immobilon-P PVDFメンブレン、0.45 µm 細孔サイズ | ミリポアシグマ | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD ヤギ抗マウスIgG二次抗体 | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW ヤギ抗ウサギIgG二次抗体 | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| マウス抗-szlig;アクチン抗体 | ミリポアシグマ | A5316 | |
| オデッセイ ブロッキングバッファー (PBS) | LICOR | 927-40100 | 蛍光検出用ブロッキングバッファー |
| OXO サラダスピナー | OXO | 32480V2B | PVDF 膜が破れることなく激しくすすがれている限り、どんなサラダスピナーでも問題ありません。 |
| パラフィルムシーリングフィルム | Bemis | Parafilm M PM996 | 半透明フレキシブルフィルム |
| ポリエチレン フラットトップスクリューキャップ 50 mL 円錐底遠心分離チューブ用 | ファルコン | 352070 | |
| リング 50 ml チューブの中心に 14 ml チューブを保持するリング | N/A | N/A | 機械工場で準備 |
| ウサギ anti-6X 彼のタグ抗体 | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | ミリポアシグマ | P2287 |
参考文献
- MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
- Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. ....
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再版と許可
