Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

בידוד של נוזלים פרוקסימליים כדי לחקור את המיקרו-סביבה של הגידול של אדנוקרצינומה של הלבלב

Published: November 5, 2020 doi: 10.3791/61687
Automatic Translation
*1, *2, 1,3, 1,3, 4,5,6, 1,3, 2,7, 2
1Section of Pancreatic Surgery, Humanitas Clinical and Research Center-IRCCS, 2Department of Immunology and Inflammation, Humanitas Clinical and Research Center-IRCCS, 3Department of Biomedical Sciences, Humanitas University, 4Giotto Biotech S.R.L., 5Section of Bioanalytical Chemistry, Division of Systems Medicine, Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Imperial College London, 6National Phenome Centre, Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Faculty of Medicine, Imperial College London, 7Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, University of Milan
* These authors contributed equally

Summary

מיץ לבלב הוא מקור יקר של סמנים ביולוגיים לסרטן הלבלב האנושי. אנו מתארים כאן שיטה להליך איסוף תוך ניתוחי. כדי להתגבר על האתגר של אימוץ הליך זה במודלים של מורין, אנו מציעים דגימה חלופית, נוזל אינטרסטיציאלי של הגידול, ומתארים כאן שני פרוטוקולים לבידודו.

Abstract

אדנוקרצינומה של הלבלב (PDAC) היא הגורם הרביעי המוביל למוות הקשור לסרטן, ובקרוב תהפוך לשנייה. קיים צורך דחוף במשתנים הקשורים לפתולוגיות לבלב ספציפיות כדי לסייע באבחון דיפרנציאלי לפני הניתוח ובפרופיל המטופל. מיץ הלבלב הוא נוזל גוף שלא נחקר יחסית, אשר, בשל קרבתו לאתר הגידול, משקף שינויים ברקמה הסובבת. כאן אנו מתארים בפירוט את הליך האיסוף תוך ניתוחי. למרבה הצער, תרגום איסוף מיץ הלבלב למודלים של PDAC, לביצוע מחקרים מכניסטיים, הוא מאתגר מאוד מבחינה טכנית. הנוזל הבין-תאי של הגידול (TIF) הוא הנוזל החוץ-תאי, מחוץ לדם ולפלזמה, אשר שוטף את תאי הגידול והסטרומל. בדומה למיץ הלבלב, עבור התכונה שלו לאסוף ולרכז מולקולות שנמצאות מדולל בפלזמה, TIF יכול להיות מנוצל כאינדיקטור לשינויים מיקרו-סביבתיים וכמקור רב ערך של סמנים ביולוגיים הקשורים למחלות. מכיוון ש- TIF אינו נגיש בקלות, הוצעו טכניקות שונות לבידודו. אנו מתארים כאן שתי שיטות פשוטות ובלתי תובעניות מבחינה טכנית לבידודה: צנטריפוגה של רקמות והרחבת רקמות.

Introduction

אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) היא אחד הגידולים האגרסיביים ביותר, ובקרוב תהפוך לסיבתהמוות השנייה המובילה 1,2,3. הוא ידוע במיקרו-סביבה המדכאת את מערכת החיסון שלו ובחוסר התגובה שלו לפרוטוקולים אימונותרפיים4. נכון לעכשיו, כריתה כירורגית היא עדיין האפשרות המרפאת היחידה עבור PDAC, ובכל זאת יש תדירות גבוהה של הישנות מוקדמת וסיבוכים לאחר ניתוח. היעדר סימפטומים ספציפיים עד שלב מתקדם אינו מאפשר אבחון מוקדם, תורם למועדי המחלה. יתר על כן, החפיפה של הסימפטומים בין PDAC לבין פתולוגיות לבלב שפירות אחרות יכולה לעכב את ההישג של אבחנה מהירה ואמינה עם אסטרטגיות האבחון הנוכחיות. זיהוי משתנים הקשורים לפתולוגיות לבלב ספציפיות יכול להקל על תהליך קבלת ההחלטות הכירורגיות ולשפר את פרופיל המטופל.

תוצאות מבטיחות בגילוי סמנים ביולוגיים הושגו באמצעות נוזלי גוף נגישים בקלות, כגון דם 5,6,7, שתן 8, רוק9 ומיץ לבלב10,11,12. מחקרים רבים ניצלו גישות מקיפות של "אומיקה", כגון טכניקות גנומיות, פרוטאומיות ומטבולומיות, כדי לזהות מולקולות או חתימות מועמדות שיכולות להבחין בין PDAC לבין פגיעות לבלב שפירות אחרות. לאחרונה הדגמנו כי ניתן להשתמש במיץ לבלב, נוזל גוף שטרם נחקר באופן יחסי, כדי לזהות חתימות מטבוליות של מטופלים עם פרופילים קליניים שונים12. מיץ הלבלב הוא נוזל עשיר בחלבון, אשר צובר את הפרשת תאי צינור הלבלב וזורם לצינור הלבלב הראשי, ולאחר מכן לצינור המרה המשותף העיקרי. בשל קרבתו ללבלב, הוא עשוי להיות מושפע מאוד מהפרעות מיקרו-סביבתיות המושרות על-ידי מסת הגידול (איור 1), ולכן הוא אינפורמטיבי יותר מדם או שתן, או פרופיל מבוסס רקמות. מספר מחקרים בחנו את הפוטנציאל של מיץ לבלב לזהות סמנים ביולוגיים חדשים של מחלות באמצעות גישות שונות, כולל ניתוח ציטולוגי 13, אנליזה פרוטאומית המבוצעת על ידי ספקטרומטריית מסה 14,15, הערכת סמנים גנטיים ואפיגנטיים כגון מוטציות K-ras ו-p53 16,17, שינויים במתילציה של DNA18, ו-miRNAs 19 . מבחינה טכנית, מיץ הלבלב ניתן לאסוף תוך ניתוחי או עם הליכים פולשניים מינימליים, כגון אולטרסאונד אנדוסקופי, cholangio-panracegraphy retrograde, או על ידי אוסף אנדוסקופי של הפרשת מיץ התריסריון20. עדיין לא ברור באיזו מידה הרכב מיץ הלבלב מושפע מטכניקת האיסוף המשמשת. אנו מתארים כאן את הליך האיסוף התוך-ניתוחי ומראים כי מיץ הלבלב יכול להוות מקור יקר ערך לסמנים ביולוגיים של PDAC.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של איסוף מיץ הלבלב. (A) ייצוג סכמטי המתאר את הפרשת מיץ הלבלב לצינור הלבלב ואיסופו במהלך הניתוח. הכניסה מראה תקריב של המיקרו-סביבה של הגידול: מיץ הלבלב אוסף מולקולות המשוחררות על ידי תאים סרטניים וסטרומליים בצינורות הלבלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

אוסף מיץ הלבלב במודלים גנטיים ואורתוטופיים של עכברים PDAC יהיה מוערך בפרספקטיבה כדי לנצל את זה biofluid במחקרים מכניסטיים פרה-קליניים; עם זאת, הליך זה יכול להיות מאתגר מאוד מבחינה טכנית ואינו אפשרי עבור מודלים פשוטים יותר כגון גידולים תת עוריים. מסיבה זו, זיהינו נוזל אינטרסטיציאלי של הגידול (TIF) כמקור חלופי למיץ הלבלב, בגלל המאפיין הדומה שלו לפעול כאינדיקטור להפרעות בסביבה. נוזל אינטרסטיציאלי (IF) הוא הנוזל החוץ-תאי, הנמצא מחוץ לכלי הדם והלימפה, אשר שוטף תאי רקמה21. הרכב IF מושפע הן ממחזור הדם לאיבר והן מהפרשה מקומית; למעשה, התאים הסובבים מייצרים ומפרישים חלבונים באופן פעיל ב-IF21. האינטרסטיטיום משקף שינויים מיקרו-סביבתיים של הרקמות הסובבות ולכן יכול להוות מקור רב ערך לגילוי סמנים ביולוגיים במספר הקשרים פתולוגיים, כגון גידולים. הריכוז הגבוה של חלבונים מופרשים מקומית ב- TIF יכול לשמש לזיהוי מולקולות מועמדות להיבדק כסמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים או אבחנתיים בפלזמה22,23,24. מספר מחקרים הוכיחו כי TIF הוא מדגם מתאים לגישות פרוטאומיות בעלות תפוקה גבוהה, כגון טכניקות ספקטרומטריית מסות23,24,25, כמו גם גישות ELISA מולטיפלקס26, ופרופיל מיקרו-רנ"א 27.

מספר גישות הוצעו לבידוד של IF בגידולים, אשר ניתן לסווג באופן רחב כמו in vivo (אולטרה סינון נימי 28,29,30,31 ומיקרודיאליזה 32,33,34,35) ושיטות ex vivo (צנטריפוגה רקמה 22,36,37,38 ו רקמות elution 39,40,41,42). טכניקות אלה נסקרו בפירוט רב43,44. הבחירה בשיטה המתאימה צריכה לקחת בחשבון סוגיות כגון ניתוחים ויישומים במורד הזרם והנפח שהתאושש. לאחרונה השתמשנו בגישה זו כהוכחה עקרונית כדי להדגים את הפעילות המטבולית השונה של גידולים משני קווי אדנוקרצינומה של לבלב12. בהתבסס על ספרות24,38, בחרנו להשתמש בשיטת הצנטריפוגה במהירות נמוכה כדי למנוע שבירה ודילול של תאים מתוכן תוך-תאי. גם כמות הגלוקוז וגם הלקטט ב-TIF שיקפו את המאפיינים הגליקוליטיים השונים של שני קווי התאים השונים. כאן נתאר בפירוט את הפרוטוקול של שתי השיטות הנפוצות ביותר לבידוד של TIF: צנטריפוגה של רקמות ואלוציה של רקמות (איור 2).

Figure 2
איור 2: ייצוג סכמטי של שיטות לבידוד נוזלים אינטרסטיציאליים של גידולים. המחשה סכמטית של הטכניקות המתוארות בפירוט בפרוטוקול, כלומר צנטריפוגה של רקמות (A) ואלקטרוגציה של רקמות (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עבור כל החולים שנרשמו, דם היקפי ומיץ לבלב נאספו בזמן הניתוח על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה האתית של המוסד. כל המטופלים נרשמו למחקר לאחר שחתמו על הסכמה מדעת כולל איסוף דגימות ביולוגיות ונתונים קליניים. המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של המוסד (פרוטוקול מספר ICH-595, אישור שניתן במאי 2009). נהלים המערבים עכברים והטיפול בהם הותאמו להנחיות האיחוד האירופי והמוסדות (מזהה פרוטוקול 121/2016-PR).

1. בידוד של מיץ הלבלב

הערה: הנסיגה של מיץ הלבלב מבוצעת בהקשר של הליך פתוח של כריתת לבלב (למשל, כריתת לבלב, כריתת לבלב כוללת, כריתת לבלב דיסטלית) על ידי צייד של מנתחי לבלב מומחים.

  1. בחירת המטופל
    1. שקול עבור ההליך כל חולה מתוכנן כריתה לבלב פתוח.
    2. אשרו הכללה אם גודל צינור הלבלב הראשי נחשב מספיק כדי לאפשר שליפת מיץ לבלב. הגבול המינימלי בקוטר של צינור הלבלב הראשי נחשב 2 מ"מ בהדמיית CT משופרת בניגוד.
  2. מחקר טרום ניתוחי של צינור הלבלב בהדמיית CT משופרת בניגוד כדי לסייע בתכנון שליפת מיץ לבלב
    1. למקם באופן תלת-ממדי את צינור הלבלב הראשי בתוך הבלוטה ברמה של צוואר הלבלב: למדוד את המרחק של צינור הלבלב הראשי מן השוליים הקדמיים, העליון והתחתון של הלבלב על שקופיות חתך, ועיבודים קורונליים וסגיטליים. לאחר הכניסה לחדר הניתוח, השתמש במדידות אלה כדי להעריך את המקום הנכון שבו יש לנקב את הלבלב כדי לתמרן את צינור Wirsung ולשלוף מיץ הלבלב.
  3. הכנת חומר
    1. חומר סטרילי: פתח את המעטפת הסטרילית של מחט אחת של 25 גרם ומזרק אחד של 3 מ"ל, ומקם אותם בשדה הסטרילי בשיתוף אחות השפשוף.
    2. חומר לא סטרילי: יש להחזיק מבחנה של ואקום K2EDTA בגודל 3 מ"ל בהישג יד בחדר הניתוח לאחסון הנוזל.
  4. הכנת המטופל
    1. הנח את המטופל על מיטת חדר הניתוח. לגרום הרדמה כללית מעורבת, באמצעות Remifentanil, Sevorane ו Rocuronium, ולאחר מכן אינטובציה ולהתחיל לאוורר את המטופל. מקם את החולה בשכיבה כאשר זרוע ימין תחובה לגוף וזרוע שמאל חטופה ל 90 מעלות מאובטחת על לוח זרוע.
    2. לחטא את העור של הבטן באתר החתך. ליצור ולתחזק שדה סטרילי על הבטן העוטף את המטופל.
  5. הליך כירורגי
    1. בצע חתך subcostal ולקבל גישה לחלל הבטן. מקם נסיגת בטן של רוצ'רד לחשיפה לאיברים.
    2. לחשוף ולגייס את הלבלב באמצעות תמרון קוצ'ר, פתיחת הרצועה הגסטרוקולית, חתך של הרקמה הרטרופריטונאלית לאורך גבול עליון ונחות של הלבלב היוצר מישור דיסקציה בין צוואר הלבלב לבין וריד מזנטרי מעולה הממוקם אחורית.
    3. לאחר שהלבלב מגויס וחשוף, ממשיכים למשיכת מיץ הלבלב לפני חיתוך צוואר הלבלב.
  6. זיהוי ולוקליזציה של צינור הלבלב
    1. הערך את מיקום צינור הלבלב באמצעות המדידה שבוצעה בהדמיה ולאחר מכן משש את פני השטח הקדמיים של הלבלב כדי לזהות את מיקומו המדויק.
  7. אוסף מיץ לבלב
    1. החזק את ראש הלבלב ואת התריסריון מלמטה והרם אותו ביד שמאל, מסמן את מיקום צינור הלבלב עם הספרה הראשונה.
    2. קח את היד הימנית של מזרק 3 מ"ל עם מחט 25 G מותקן על.
    3. השתמש ביד ימין כדי להחדיר את המחט ללבלב רק דיסטלי לאגודל שמאל. להחליט על עומק החדירה ומידת הנטייה של המחט על סמך מדידות טרום ניתוחיות ועל סמך התפיסה של חדירה לדופן הצינור.
    4. למשוך את המיץ עם המזרק. אם לא ניתן לאחזר את המיץ, העבירו את המחט לארבעת הכיוונים בניסיון לתמרן את צינור הלבלב.
    5. לאחר שליפת מיץ הלבלב, העבירו אותו אל מחוץ לשדה הסטרילי והעבירו אותו למבחנה של ואקום K2EDTA בגודל 3 מ"ל. יש לשמור על טמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד להעברת הדגימה למעבדה ולהמשיך בעיבוד מוקדם ככל האפשר.
      הערה: נפח מיץ הלבלב שניתן לשחזר עם הליך זה משתנה מאוד, ונע בין 0.2 מ"ל ל -3 מ"ל מניסיוננו. כמות המיץ המוחזרת תלויה מאוד בחולה: הממד של צינור Wirsung והמצב התפקודי של הלבלב (תפקוד לעומת בלוטה אטרופית). מניסיוננו אין שום תועלת שניתן להשתמש בה כדי להגדיל את כמות מיץ הלבלב שאחזר.

2. עיבוד של מיץ הלבלב

  1. מיץ לבלב צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר תאים או פסולת.
    הערה: מיץ הלבלב צריך להיות שקוף ושקוף בצבע לפני צנטריפוגה. זיהום דם במהלך הניתוח יכול לפעמים להתרחש, מה שהופך את הדגימה להיראות עכור ואדום יותר בצבע. שקול להוציא דגימות כאלה מניתוחים נוספים.
  2. לשחזר את supernatant, aliquot ולאחסן ב -80 °C עד ניתוחים נוספים.

3. אינדוקציה של גידולים תת עוריים

הערה: קווי התאים מורין Panc02 ו- DT6606 התקבלו מפרופ' לורנצו פיימונטי (מכון סן רפאלה לסוכרת, מילאנו, איטליה) ופרופ' פרנצ'סקו נובלי (המרכז למחקר ניסויי ומחקרים רפואיים, טורינו, איטליה) בהתאמה, כפי שתואר קודםלכן 12.

  1. צמיחה של תאים סרטניים
    1. תרבית Panc02 ותאי DT6606 במכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 בינוני המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS), 2mM L-גלוטמין ו-1% אנטיביוטיקה פניצילין-סטרפטומיצין.
    2. הפשרת תאים קפואים 1-2 שבועות לפני הזרקת הגידול, על פי קצב הצמיחה של קו התאים.
    3. לגדל תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ו-95% לחות בתנאים סטריליים.
    4. לנתק תאים עם 0.025% טריפסין / EDTA פתרון במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כאשר הם מגיעים 80% מפגש ולחסל טריפסין על ידי צנטריפוגה.
      הערה: DT6606 הם תאים ראשוניים, לא מונצחים, שמקורם בעכבר LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre, ואין להעביר אותם יותר מ -3 פעמים לפני הזרקת in vivo על מנת לשמור על המאפיינים המקוריים שלהם. מומלץ להפשיר תאי DT6606 7-10 ימים לפני ההזרקה.
  2. הזרקת תאי גידול in vivo
    1. יש לבצע טריפסינזציה של תאים (ראו שלב 3.1.4) ולשטוף אותם פעם אחת עם תמיסת מלח עם פוספט (PBS). בטל PBS על ידי צנטריפוגה והשהה תאים ב- PBS טרי לפני הספירה.
    2. סופרים את התאים ומחזירים אותם ל-PBS בריכוז של 0.5-1 x 107 תאים /מ"ל על מנת שיהיה ריכוז סופי של 0.5-1 x 106 תאים /100 μL להזריק בכל עכבר. הכן את התאים עודף. שמור את התאים ב 4 מעלות צלזיוס או על קרח עד סוף ההליך.
    3. קבץ את החיות (נקבות עכברי C57BL/6J בנות 8 שבועות) בכלובים שונים בהתאם לקווי תאים או טיפולים שונים.
    4. רסנו את בעלי החיים באופן ידני והרדימו אותם באמצעות תערובת של קטמין (80 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) או על פי נהלים מקומיים מאושרים.
    5. לגלח את אתר ההזרקה, בדרך כלל אגף מעל רגל, עם מכונת גילוח חשמלית ולנקות בזהירות את אתר ההזרקה עם אלכוהול.
    6. פיפטה למעלה ולמטה במתלה התא עם מזרק 1 מ"ל, הסרת כל בועות האוויר על ידי הזזת הבוכנה למעלה ולמטה. חברו מחט של 25 גרם למזרק ודחפו את הבוכנה כלפי מעלה עד שמתלה התא מגיע לפתח המחט.
    7. צובטים את עור האגף במלקחיים שטוחים ומחדירים בזהירות את המחט בבסיס קפל העור בין המלקחיים מבלי לנקב את חלל הצפק או את השרירים. כדי לוודא את המיקום הנכון של המחט, נסה בעדינות להזיז את קצה המחט לצדדים מתחת לעור. המחט צריכה לנוע בחופשיות.
    8. להזריק באיטיות 100 μL של תרחיף התא (המכיל 0.5-1 x 106 תאים ), להדק בעדינות את אתר ההזרקה למשך מספר שניות ולמשוך לאט את המחט ללא כל תנועה לצדדים.
    9. החזירו את העכבר לכלוב שלו ועקבו אחר ההתאוששות מההרדמה.
    10. בדוק את צמיחת הגידול באמצעות קליפר במשך 3-4 שבועות. להרדים את בעלי החיים כאשר הגידולים מגיעים לכ-0.5-1 ס"מ3 באמצעות CO2 או על פי נהלים שאושרו במקום.

4. בידוד של נוזל אינטרסטיציאלי של הגידול (TIF)

  1. כריתה של גידולים תת עוריים
    1. לחסום את הגפיים של בעלי החיים עם נייר דבק ולנקות את העור עם אלכוהול. חותכים את העור פתוח על הבטן על מנת להפריד אותו מן הצפק ולהמשיך עד הגפיים. הבלו את הגידול גדל מתחת לעור של האגף בעזרת מספריים, מלחציים ובסופו של דבר אזמל.
    2. שוקלים את הגידול ושומרים אותו בצינור נקי על הקרח עד לאחר בידוד של TIF.
  2. בידוד TIF על ידי צנטריפוגה
    1. חותכים את הגידול לשניים, שוטפים את שני החלקים במהירות ב- PBS ומכתימים אותם בעדינות על נייר סינון כדי להסיר עודף של PBS. בצע צעדים אלה מהר ככל האפשר כדי למנוע אידוי מן הגידול.
    2. מעבירים מיד את הגידול למסננת תאי ניילון בקוטר 20 מיקרומטר המודבקת על גבי צינור חרוטי בגודל 50 מ"ל.
    3. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: צנטריפוגה זו במהירות נמוכה שומרת על שלמות התא ומונעת זיהום של TIF על ידי תא תוך-תאי. ניתן לבדוק דליפת תוכן תוך-תאי ביישומים במורד הזרם, למשל על-ידי הערכת נוכחותם של חלבוני משק בית תוך-תאיים, כגון חלבונים ריבוזומליים25.
    4. לשחזר את TIF מתחתית הצינור, בסופו של דבר aliquot אותו מיד להקפיא אותו על קרח יבש ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד ניתוח נוסף.
      אופציונלי: בהתבסס על הניתוח הפרוטאומי במורד הזרם שיש לבצע, דילל את הדגימה ב- PBS עם קוקטייל מעכב פרוטאז כדי למנוע פירוק של מולקולות ספציפיות.
      הערה: בהתאם להרכב הגידול, במקרים מסוימים גידולים קטנים מאוד אינם מניבים נוזל.
  3. בידוד של TIF על ידי אלוטיון
    1. חותכים את הגידול לחתיכות קטנות (≈1-3 מ"מ3) עם מספריים או אזמל ושוטפים בזהירות עם PBS קר.
      הערה: בשלב זה חשוב מאוד לעבוד מהר ולבצע מניפולציה מינימלית כדי למנוע נזק לתאים.
    2. מעבירים את חלקי הגידול לצינור של 1.5 מ"ל ומוסיפים 500 מיקרון של PBS עם קוקטייל מעכב פרוטאז כדי למנוע השפלה של אנליטים. דגירה למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
    3. לשחזר את supernatant ולהעביר אותו צינור חדש 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר את כל התאים מן הדגימה.
    4. מעבירים את הסופר-נאטנט לצינור חדש וצנטריפוגה שוב ב-2,000 x g למשך 8 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    5. מעבירים את הסופר-נאטנט לצינור חדש וצנטריפוגה שוב ב-20,000 x גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר לכלוך. לשחזר את supernatant. יש להקפיא מיד דגימת TIF על קרח יבש ולאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לניתוח נוסף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עקבנו אחר ההליך שתואר לעיל כדי לקבל מיץ לבלב מחולים עם PDAC (n = 31) ומחלות לבלב שפירות אחרות (שאינן PDAC, n = 9), כולל דלקת הלבלב (n = 2), גידולים פפילריים-אמפולה (n = 4), גידולים נוירואנדוקריניים (n = 2), ניאופלזיה פפילרית רירי תוך-דוקטלית (IPMN; n = 1)12. דגימות מיץ הלבלב עברו אנליזה מטבולית באמצעות תהודה מגנטית גרעינית (1H-NMR)12. על-ידי סינון אותות ה-NMR הרחבים של מקרומולקולות (למשל, ליפופרוטאינים, שומנים וכו') הצלחנו להעריך בפירוט מטבוליטים במשקל מולקולרי קטן, כפי שמוצג בספקטרום ה-1D Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) (איור 3A). ניתוח OPLS-DA מפוקח הראה שהפרופיל המטבולי שזוהה במיץ הלבלב היה מסוגל להבחין בין חולי PDAC לחולים שאינם PDAC בדיוק של 82.4% שהושג על ידי אימות צולב (איור 3B). באופן מעניין, ניתוח מטבולי שבוצע על דגימות פלזמה מאותם חולים לא הניב את אותה עוצמה מפלה (דיוק של 75.2% שהושג על ידי אימות צולב) (איור 3C). תוצאות אלה מצביעות על כך שמיץ הלבלב הוא דגימה עשירה בחלבון ומתאימה לניתוחי "אומיקה" מקיפים. יתר על כן, כוח ההבחנה המעולה של מיץ לבלב בהשוואה לפלזמה מצביע על כך שמעבר "במעלה הזרם" לדגימות פרוקסימליות יותר לאתר הגידול יכול להיות אסטרטגיה מוצלחת לזיהוי סמנים ביולוגיים המסייעים להפריד PDAC ממחלות לבלב אחרות.

Figure 3
איור 3: תכולת מטבוליזם במיץ הלבלב ובפלזמה. (A) ספקטרום H-NMR CPMG שלדגימות PDAC (n=31, כחול) ודגימות שאינן PDAC (n=9, ירוק) המציגות פרטים על המטבוליטים הקטנים במשקל מולקולרי הכלולים במיצי הלבלב. עמודים לדקה, חלקים למיליון. (B) תוצאות של ניתוח OPLS-DA רב-משתני מפוקח על ספקטרום CPMG מדגימות PDAC של מיץ לבלב (עיגולים כחולים) ודגימות שאינן PDAC (משולשים סגולים). הניתוח מפריד בין שתי הקבוצות (כל אחת מהן מתוארת על ידי עלילת עכביש), עם דיוק של 82.4% המתקבל על ידי אימות צולב. (C) תוצאות של ניתוח OPLS-DA רב-משתני מפוקח על ספקטרום 1D-NOESY מדגימות PDAC פלזמה (n=22, עיגולים כחולים) ודגימות שאינן PDAC (n=7, משולשים סגולים). דיוק של 75.2% המתקבל על ידי אימות צולב. נתון זה שונה מ- Cortese et al.12 באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

כדי להדגים שתכולת TIF משקפת באופן מהימן שינויים במיקרו-סביבה של הגידול, הזרקנו תת-עורית שני קווי תאים של סרטן הלבלב עם קצב גליקוליטי מנוגד, Panc02 (גליקוליטי מאוד) ו-DT6606 (גליקוליטי נמוך), בהתאם לפרוטוקול שתואר לעיל. לאחר מכן בודדנו את TIF מהגידולים שנכרתו באמצעות שיטת הצנטריפוגה במהירות נמוכה שתוארה לעיל (ראה סעיף 4.2). מגידולים במשקל שבין 0.25-1 גרם, התאוששנו מטווח של 5-15 μL של TIF, ששימש אז לכימות ריכוז הגלוקוז והלקטט. TIF מגידולים גליקוליטיים מאוד הכיל פחות גלוקוז ויותר לקטט בהשוואה לגידולים עם גליקוליטי נמוך (איור 4). נתונים אלה מראים כי TIF יכול לשמש כמקור למטבוליטים שמקורם בגידול ולשינויים בהתאם לגידול עצמו.

Figure 4
איור 4: תכולת הגלוקוז והלקטאט ב-TIF משקפת תכונות פנימיות של הגידול. (A) ריכוז גלוקוז ו-(B) לקטאט בנוזל אינטרסטיציאלי, שבודד בשיטת הצנטריפוגה של הרקמה, מ-Panc02 (גליקוליטי מאוד, n=10 ב-A, n=9 ב-B) ו-DT6606 (גליקוליטי נמוך, n=5 ב-A, n=4 ב-B) מושתל באופן תת-עורי. חלקות תיבה נותנות חציון, רבעון תחתון ורבעון עליון לפי התיבה, ומינימום ומקסימום לפי שפם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה תיארנו את הטכניקה לאיסוף תוך-ניתוחי של מיץ הלבלב, ביופסיה נוזלית שטרם נחקרה ברובה. לאחרונה הראינו כי מיץ הלבלב יכול להיות מנוצל כמקור סמנים מטבוליים של מחלה12. ניתוח מטבולי של ביופסיות נוזליות אחרות, כגון דם 5,6,7, שתן 8 ורוק9, הראה תוצאות מבטיחות בהבחנה בין PDAC לבין נבדקים בריאים או דלקת הלבלב. מיץ הלבלב, לעומת זאת, מופרש ישירות על ידי תאי צינור הלבלב, ובשל קרבתו לאתר הגידול, הוא יכול להיות אינדיקטור אמין יותר לשינויים ברקמה הסובבת, אפילו בשלבים המוקדמים מאוד של המחלה. למעשה, בעוד שנתונים ספקטרליים של H-NMR של מיץ לבלב השיגו אפליה בין חולי PDAC למחלות לבלב שפירות אחרות, דגימות פלזמה לא. לכן, למרות שהוא פחות נגיש מביופסיות נוזליות אחרות, מיץ הלבלב מהווה מקור יקר ערך של סמנים ביולוגיים קליניים, ויכול לסייע בזיהוי מחלות המתפתחות במהירות. תיארנו כאן את הטכניקה התוך-ניתוחית לאיסוף מיץ הלבלב; עם זאת, זה יכול להתבצע גם במהלך הליכים זעיר פולשניים, בפרספקטיבה של זיהוי סמנים מוקדמים יקרי ערך של מחלה. נותר לברר אם הליכי האיסוף השונים משפיעים על ההרכב הפרוטאומי של מיץ הלבלב.

בעוד שביופסיות נוזליות אחרות נגישות בקלות במודלים של PDAC מורין, איסוף מיץ הלבלב in vivo יכול להיות מאתגר מאוד אם לוקחים בחשבון מודלים גנטיים או אורתוטופיים, ואינו אפשרי כלל במודלים תת-עוריים. לכן, במאמר זה הצענו את השימוש בנוזל אינטרסטיציאלי של הגידול כחלופה חשובה וישימה באופן נרחב. למעשה, הרכב נוזל interstitial, בדומה מיץ הלבלב, מושפע ישירות על ידי שינויים בסביבה המקומית. פרופיל פרוטאומי על TIF מגידולים שונים, כגון הפטוצלולרי 45,46, תא כליה 41, שחלות 22,47,48, וקרצינומות שד42,49, הראו תוצאות מעודדות במחקר עבור סמנים ביולוגיים מועמדים. עם זאת, יש חפיפה מועטה בחלבונים המועמדים שזוהו, מה שמרמז על כך שהגישה המשמשת לבידוד TIF, יחד עם הניתוח במורד הזרם שבוצע ואיסוף הנתונים, עשויה להשפיע על האנליטים שזוהו. מחקר שנערך לאחרונה על קרצינומה של תאי קשקש והשווה בין שתי שיטות הבידוד TIF שתוארו כאן, צנטריפוגה ואלוציה, הבחין בעקביות חזקה בהרכב TIF ללא תלות בשיטה שבה נעשה שימוש, אם כי צנטריפוגה הניבה תכולה גבוהה יותר של חלבונים חוץ-תאיים25.

לשתי השיטות המתוארות כאן לבידוד של TIF, צנטריפוגה של רקמות והרחבת רקמות, יש יתרון בכך שהן אינן תובעניות מבחינה טכנית, מהירות, ודורשות רק ציוד מעבדה בסיסי. בהשוואה לגישות אחרות, כגון מיקרודיאליזה ואולטרה-סינון נימי, טכניקות הצנטריפוגה וההעתקה קיימות עם המגבלה הפנימית של היותן אפשריות בלבד ex vivo. חשוב לקחת בחשבון מספר נושאים בעת בחירת השיטה המתאימה, כגון המטרה האנליטית של הניסוי, נפח התאושש ושבירת תאים. הרכב הגידול צריך להיחשב גם, כפי שהוא יכול להשפיע על נפח TIF התאושש. צנטריפוגה של רקמות פותחה במקור עבור רקמות עניות בתאים ועשירות בקולגן כגון קרנית38; גידולים לעומת זאת, הם בדרך כלל רקמות המאופיינות בתאים גבוהים וכלי דם עשירים, שתי תכונות המגבירות את המוליכות ההידראולית, ולכן אמורות להקל על בידוד TIF על ידי צנטריפוגה. עם זאת, גידולים מסוימים, כולל PDAC, נוכחים עם מרכיב סטרומלי או פיברוטי שופע, עשיר בחלבוני מטריצה חוץ-תאיים, כגון קולגן, אשר נוטים לשמור על מקרומולקולות ברקמה21.

אלוטיון רקמות, לעומת זאת, מבוסס על דיפוזיה פסיבית של חלבונים מהרקמה אל האלואט, ונוצל בהצלחה למגוון רחב של גידולים43. Elution מעניק התאוששות של כמויות גדולות יותר, אולם חלבונים ידוללו. מסיבה זו, ייתכן שאלוטיון רקמות אינו מתאים למולקולות עם שפע נמוך מאוד. יתר על כן, אלוציה דורשת מידה רבה יותר של מניפולציה של הגידול, מה שעלול לגרום לדליפת תוכן תוך תאי ב- TIF. זה עשוי להיות לא רלוונטי לגילוי סמנים ביולוגיים, אך עלול לגרום להטיה אם המטרה היא לקבוע ייצור מקומי של חלבונים. יש לבדוק את כמות שבירת התאים ביישומים במורד הזרם על מנת לבחור את השיטה המתאימה ביותר בהתאם לסוג הגידול. זה יכול להתבצע במספר דרכים, למשל על ידי בדיקת נוכחות של חלבונים משק הבית, כגון חלבונים ribosomal, ב TIF25. גישה מוצעת נוספת היא זו של השוואת הריכוזים של חומרים חוץ-תאיים נבחרים, כגון קריאטינין או Na+, ב- TIF ובפלזמה, אשר אמורים להיותדומים 22. יש לשקול גם דליפת תוכן תוך תאי לשיטת הצנטריפוגה; למעשה, עדיין אין הסכמה כללית לגבי מה צריך להיחשב "מהירות נמוכה" על מנת למנוע שבירת תאים, אולי בשל ההבדלים בהרכב הגידול. בחרנו להשתמש במהירות של 400 x g, שכן הוכח כי לא מתרחש דילול מתוכן תוך תאי עבור כוחות g <42438.

ללא קשר לגישה, TIF מייצג מקור יקר וישים באופן נרחב לדגימת המיקרו-סביבה של הגידול. הראינו כי הוא משחזר תכונות פנימיות של הגידול ויכול להיות שימושי לזיהוי סמנים ביולוגיים של מחלות או מטרות טיפוליות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לרוברטה מיליורה על הסיוע הטכני. המחקר שהוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מ- Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) במסגרת פרויקט IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה על הוצאתם לאור או בהכנת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD Biosciences 309659
1.5 mL Eppendorf tube Greiner BioOne GR616201
20 µm nylon cell strainer pluriSelect 43-50020-03
25G needle BD Biosciences 305122
3 mL K2EDTA vacutainer BD Biosciences 366473
3 mL syringe BD Biosciences 309656
50 mL Falcon tube Corning 352098
Clamps Medicon 06.20.12
Disposable scalpel Medicom 9000-10
Fetal bovine serum Microtech MG10432
Flat-tipped forceps Medicon 06.00.10
Penicillin-Streptomycin Lonza ECB3001D
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Protease inhibitor cocktail Roche 34044100
RPMI medium Euroclone ECB9006L
Scissors Medicon 02.04.09
Trypsin/EDTA 1x Lonza BE17-161F
Ultraglutamine 100x Lonza BE17-605E/U1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Costello, E., Greenhalf, W., Neoptolemos, J. P. New biomarkers and targets in pancreatic cancer and their application to treatment. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (8), 435-444 (2012).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (1), 7-30 (2020).
  3. Neoptolemos, J. P., et al. Therapeutic developments in pancreatic cancer: current and future perspectives. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (6), 333-348 (2018).
  4. Sahin, I. H., Askan, G., Hu, Z. I., O'Reilly, E. M. Immunotherapy in pancreatic ductal adenocarcinoma: an emerging entity. Annals of Oncology. 28 (12), 2950-2961 (2017).
  5. Mayerle, J., et al. Metabolic biomarker signature to differentiate pancreatic ductal adenocarcinoma from chronic pancreatitis. Gut. 67 (1), 128-137 (2018).
  6. Bathe, O. F., et al. Feasibility of identifying pancreatic cancer based on serum metabolomics. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 20 (1), 140-147 (2011).
  7. Mayers, J. R., et al. Elevation of circulating branched-chain amino acids is an early event in human pancreatic adenocarcinoma development. Nature Medicine. 20 (10), 1193-1198 (2014).
  8. Napoli, C., et al. Urine metabolic signature of pancreatic ductal adenocarcinoma by (1)h nuclear magnetic resonance: identification, mapping, and evolution. Journal of Proteome Research. 11 (1), 1274-1283 (2012).
  9. Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).
  10. Chen, R., et al. Comparison of pancreas juice proteins from cancer versus pancreatitis using quantitative proteomic analysis. Pancreas. 34 (1), 70-79 (2007).
  11. Mori, Y., et al. A minimally invasive and simple screening test for detection of pancreatic ductal adenocarcinoma using biomarkers in duodenal juice. Pancreas. 42 (2), 187-192 (2013).
  12. Cortese, N., et al. Metabolome of Pancreatic Juice Delineates Distinct Clinical Profiles of Pancreatic Cancer and Reveals a Link between Glucose Metabolism and PD-1+ Cells. Cancer Immunology Research. , (2020).
  13. Tanaka, M., et al. Cytologic Analysis of Pancreatic Juice Increases Specificity of Detection of Malignant IPMN-A Systematic Review. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 17 (11), 2199-2211 (2019).
  14. Chen, K. T., et al. Potential prognostic biomarkers of pancreatic cancer. Pancreas. 43 (1), 22-27 (2014).
  15. Tian, M., et al. Proteomic analysis identifies MMP-9, DJ-1 and A1BG as overexpressed proteins in pancreatic juice from pancreatic ductal adenocarcinoma patients. BMC Cancer. 8, 241 (2008).
  16. Shi, C., et al. Sensitive and quantitative detection of KRAS2 gene mutations in pancreatic duct juice differentiates patients with pancreatic cancer from chronic pancreatitis, potential for early detection. Cancer Biology & Therapy. 7 (3), 353-360 (2008).
  17. Rogers, C. D., et al. Differentiating pancreatic lesions by microarray and QPCR analysis of pancreatic juice RNAs. Cancer Biology & Therapy. 5 (10), 1383-1389 (2006).
  18. Matsubayashi, H., et al. DNA methylation alterations in the pancreatic juice of patients with suspected pancreatic disease. Cancer Research. 66 (2), 1208-1217 (2006).
  19. Cote, G. A., et al. A pilot study to develop a diagnostic test for pancreatic ductal adenocarcinoma based on differential expression of select miRNA in plasma and bile. The American Journal of Gastroenterology. 109 (12), 1942-1952 (2014).
  20. Yu, J., et al. Digital next-generation sequencing identifies low-abundance mutations in pancreatic juice samples collected from the duodenum of patients with pancreatic cancer and intraductal papillary mucinous neoplasms. Gut. , (2016).
  21. Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiological Reviews. 92 (3), 1005-1060 (2012).
  22. Haslene-Hox, H., et al. A new method for isolation of interstitial fluid from human solid tumors applied to proteomic analysis of ovarian carcinoma tissue. PLoS One. 6 (4), 19217 (2011).
  23. Zhang, J., et al. In-depth proteomic analysis of tissue interstitial fluid for hepatocellular carcinoma serum biomarker discovery. British Journal of Cancer. 117 (11), 1676-1684 (2017).
  24. Sullivan, M. R., et al. Quantification of microenvironmental metabolites in murine cancers reveals determinants of tumor nutrient availability. Elife. 8, (2019).
  25. Matas-Nadal, C., et al. Evaluation of Tumor Interstitial Fluid-Extraction Methods for Proteome Analysis: Comparison of Biopsy Elution versus Centrifugation. Journal of Proteome Research. 19 (7), 2598-2605 (2020).
  26. Espinoza, J. A., et al. Cytokine profiling of tumor interstitial fluid of the breast and its relationship with lymphocyte infiltration and clinicopathological characteristics. Oncoimmunology. 5 (12), 1248015 (2016).
  27. Halvorsen, A. R., et al. Profiling of microRNAs in tumor interstitial fluid of breast tumors - a novel resource to identify biomarkers for prognostic classification and detection of cancer. Molecular Oncology. 11 (2), 220-234 (2017).
  28. Yang, S., Huang, C. M. Recent advances in protein profiling of tissues and tissue fluids. Expert Review of Proteomics. 4, 515-529 (2007).
  29. Huang, C. M., et al. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6 (22), 6107-6116 (2006).
  30. Leegsma-Vogt, G., Janle, E., Ash, S. R., Venema, K., Korf, J. Utilization of in vivo ultrafiltration in biomedical research and clinical applications. Life Sciences. 73 (16), 2005-2018 (2003).
  31. Schneiderheinze, J. M., Hogan, B. L. Selective in vivo and in vitro sampling of proteins using miniature ultrafiltration sampling probes. Analytical Chemistry. 68 (21), 3758-3762 (1996).
  32. Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clinical Applications. 5 (11-12), 636-643 (2011).
  33. Xu, B. J., et al. Microdialysis combined with proteomics for protein identification in breast tumor microenvironment in vivo. Cancer Microenvironment. 4 (1), 61-71 (2010).
  34. Bendrik, C., Dabrosin, C. Estradiol increases IL-8 secretion of normal human breast tissue and breast cancer in vivo. The Journal of Immunology. 182 (1), 371-378 (2009).
  35. Ao, X., Stenken, J. A. Microdialysis sampling of cytokines. Methods. 38 (4), 331-341 (2006).
  36. Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
  37. Choi, J., et al. Intraperitoneal immunotherapy for metastatic ovarian carcinoma: Resistance of intratumoral collagen to antibody penetration. Clinical Cancer Research. 12 (6), 1906-1912 (2006).
  38. Wiig, H., Aukland, K., Tenstad, O. Isolation of interstitial fluid from rat mammary tumors by a centrifugation method. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (1), 416-424 (2003).
  39. Li, S., Wang, R., Zhang, M., Wang, L., Cheng, S. Proteomic analysis of non-small cell lung cancer tissue interstitial fluids. World Journal of Surgical Oncology. 11, 173 (2013).
  40. Fijneman, R. J., et al. Proximal fluid proteome profiling of mouse colon tumors reveals biomarkers for early diagnosis of human colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 18 (9), 2613-2624 (2012).
  41. Teng, P. N., Hood, B. L., Sun, M., Dhir, R., Conrads, T. P. Differential proteomic analysis of renal cell carcinoma tissue interstitial fluid. Journal of Proteome Research. 10 (3), 1333-1342 (2011).
  42. Turtoi, A., et al. Novel comprehensive approach for accessible biomarker identification and absolute quantification from precious human tissues. Journal of Proteome Research. 10 (7), 3160-3182 (2011).
  43. Wagner, M., Wiig, H. Tumor Interstitial Fluid Formation, Characterization, and Clinical Implications. Frontiers in Oncology. 5, 115 (2015).
  44. Haslene-Hox, H., Tenstad, O., Wiig, H. Interstitial fluid-a reflection of the tumor cell microenvironment and secretome. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2336-2346 (2013).
  45. Hsieh, S. Y., et al. Secreted ERBB3 isoforms are serum markers for early hepatoma in patients with chronic hepatitis and cirrhosis. Journal of Proteome Research. 10, 4715-4724 (2011).
  46. Sun, W., et al. Characterization of the liver tissue interstitial fluid (TIF) proteome indicates potential for application in liver disease biomarker discovery. Journal of Proteome Research. 9 (2), 1020-1031 (2010).
  47. Haslene-Hox, H., et al. Increased WD-repeat containing protein 1 in interstitial fluid from ovarian carcinomas shown by comparative proteomic analysis of malignant and healthy gynecological tissue. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2347-2359 (2013).
  48. Wang, T. H., et al. Stress-induced phosphoprotein 1 as a secreted biomarker for human ovarian cancer promotes cancer cell proliferation. Molecular & Cellular Proteomics. 9, 1873-1884 (2010).
  49. Gromov, P., et al. Up-regulated proteins in the fluid bathing the tumour cell microenvironment as potential serological markers for early detection of cancer of the breast. Molecular Oncology. 4 (1), 65-89 (2010).

Tags

חקר הסרטן גיליון 165 אדנוקרצינומה של הלבלב מיץ הלבלב נוזל אינטרסטיציאלי של הגידול נוזל פרוקסימלי ביופסיה נוזלית סמנים ביולוגיים פרוטאומיקה
בידוד של נוזלים פרוקסימליים כדי לחקור את המיקרו-סביבה של הגידול של אדנוקרצינומה של הלבלב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donisi, G., Barbagallo, M.,… More

Donisi, G., Barbagallo, M., Capretti, G., Nappo, G., Takis, P. G., Zerbi, A., Marchesi, F., Cortese, N. Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma. J. Vis. Exp. (165), e61687, doi:10.3791/61687 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter