Summary
Bukspottkörteljuice är en värdefull källa till biomarkörer för human bukspottkörtelcancer. Vi beskriver här en metod för intraoperativ insamlingsprocedur. För att övervinna utmaningen att anta denna procedur i murina modeller föreslår vi ett alternativt prov, tumörinterstitiell vätska, och beskriver här två protokoll för dess isolering.
Abstract
Pankreas adenokarcinom (PDAC) är den fjärde ledande orsaken till cancerrelaterad död och snart den andra. Det finns ett akut behov av variabler associerade med specifika pankreaspatologier för att hjälpa preoperativ differentialdiagnos och patientprofilering. Bukspottkörteljuice är en relativt outforskad kroppsvätska, som på grund av sin närhet till tumörstället återspeglar förändringar i den omgivande vävnaden. Här beskriver vi i detalj det intraoperativa insamlingsförfarandet. Tyvärr är det tekniskt mycket utmanande att översätta pankreasjuicesamling till murina modeller av PDAC, för att utföra mekanistiska studier. Tumörinterstitiell vätska (TIF) är den extracellulära vätskan, utanför blod och plasma, som badar tumör- och stromaceller. På samma sätt som bukspottkörteljuice, för dess egenskap att samla och koncentrera molekyler som finns utspädda i plasma, kan TIF utnyttjas som en indikator på mikromiljöförändringar och som en värdefull källa till sjukdomsassocierade biomarkörer. Eftersom TIF inte är lättillgängligt har olika tekniker föreslagits för dess isolering. Vi beskriver här två enkla och tekniskt krävande metoder för dess isolering: vävnadscentrifugering och vävnadsel.
Introduction
Pankreatiskt duktalt adenokarcinom (PDAC) är en av de mest aggressiva tumörerna och kommer snart att bli den näst vanligaste dödsorsaken 1,2,3. Det är välkänt för sin immunsuppressiva mikromiljö och för sin svarslöshet på immunterapiprotokoll4. För närvarande är kirurgisk resektion fortfarande det enda botande alternativet för PDAC, men det finns en hög frekvens av tidiga återfall och posturgiska komplikationer. Bristen på specifika symtom tills ett avancerat stadium tillåter inte en tidig diagnos, vilket bidrar till sjukdomens tidsfrister. Dessutom kan överlappningen av symtom mellan PDAC och andra godartade pankreaspatologier hindra uppnåendet av en snabb och tillförlitlig diagnos med de nuvarande diagnostiska strategierna. Identifieringen av variabler associerade med specifika pankreaspatologier kan underlätta den kirurgiska beslutsprocessen och förbättra patientprofilering.
Lovande resultat i biomarkörupptäckt har uppnåtts med hjälp av lättillgängliga kroppsvätskor, såsom blod 5,6,7, urin8, saliv 9 och bukspottkörteljuice10,11,12. Många studier har utnyttjat omfattande "omics" -metoder, såsom genomiska, proteomiska och metabolomiska tekniker, för att identifiera kandidatmolekyler eller signaturer som kan skilja mellan PDAC och andra godartade bukspottkörtelbesvär. Vi visade nyligen att bukspottkörteljuice, en relativt outforskad kroppsvätska, kan användas för att identifiera metaboliska signaturer hos patienter med distinkta kliniska profiler12. Bukspottkörteljuice är en proteinrik vätska som ackumulerar sekretomet hos bukspottkörtelkanalceller och strömmar till huvudkanalen i bukspottkörteln och sedan till den huvudsakliga gemensamma gallkanalen. På grund av dess närhet till bukspottkörteln kan den påverkas starkt av mikromiljöstörningar inducerade av tumörmassan (figur 1) och därför mer informativ än blod eller urin eller vävnadsbaserad profilering. Flera studier har undersökt potentialen hos bukspottkörteljuice för att identifiera nya biomarkörer för sjukdom med hjälp av olika tillvägagångssätt, inklusive cytologisk analys 13, proteomisk analys utförd med masspektrometri 14,15, bedömning av genetiska och epigenetiska markörer såsom K-ras och p53-mutationer 16,17, förändringar i DNA-metylering18 och miRNA 19 . Tekniskt sett kan bukspottkörteljuice samlas intraoperativt eller med minimalt invasiva procedurer, såsom endoskopisk ultraljud, retrograd kolangio-pankreatografi eller genom endoskopisk insamling av duodenal juicesekretion20. Det är ännu inte klart i vilken utsträckning bukspottskörteljuicekompositionen påverkas av den använda insamlingstekniken. Vi beskriver här det intraoperativa insamlingsförfarandet och visar att bukspottkörteljuice kan utgöra en värdefull källa för PDAC-biomarkörer.
Figur 1: Schematisk representation av pankreasjuice samling. (A) Schematisk representation som visar utsöndringen av bukspottkörteljuice i bukspottkörtelkanalen och dess samling under operationen. Insatsen visar en närbild av tumörmikromiljön: bukspottkörteljuice samlar molekyler som frigörs av tumör- och stromaceller i bukspottkörtelkanalerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Insamlingen av bukspottkörteljuice i genetiska och ortotopiska musmodeller av PDAC skulle uppskattas i perspektivet att utnyttja denna biofluid i prekliniska mekanistiska studier; Denna procedur kan dock vara tekniskt mycket utmanande och är inte genomförbar för enklare modeller som subkutana tumörer. Av denna anledning identifierade vi tumörinterstitiell vätska (TIF) som en alternativ källa till bukspottkörteljuice, för dess liknande egenskap att fungera som en indikator på omgivande störningar. Interstitiell vätska (IF) är den extracellulära vätskan, som finns utanför blod och lymfkärl, som badar vävnadsceller21. IF-kompositionen påverkas av både blodcirkulationen till organet och lokal utsöndring; i själva verket producerar och utsöndrar omgivande celler aktivt proteiner i IF21. Interstitium återspeglar mikromiljöförändringar i omgivande vävnader och kan därför utgöra en värdefull källa för biomarkörupptäckt i flera patologiska sammanhang, såsom tumörer. Den höga koncentrationen av lokalt utsöndrade proteiner i TIF kan användas för att identifiera kandidatmolekyler som ska testas som prognostiska eller diagnostiska biomarkörer i plasma22,23,24. Flera studier har visat att TIF är ett lämpligt prov för proteomiska metoder med hög genomströmning, såsom masspektrometritekniker 23,24,25, samt multiplex ELISA-tillvägagångssätt 26 och mikroRNA-profilering 27.
Flera tillvägagångssätt har föreslagits för isolering av IF i tumörer, som i stort sett kan kategoriseras som in vivo (kapillär ultrafiltrering 28,29,30,31 och mikrodialys 32,33,34,35) och ex vivo-metoder (vävnadscentrifugering 22,36,37,38 och vävnadseluering 39,40,41,42). Dessa tekniker har granskats i detalj43,44. Vid valet av lämplig metod bör hänsyn tas till frågor som analyser och tillämpningar i senare led och den återvunna volymen. Vi använde nyligen detta tillvägagångssätt som ett principbevis för att visa den olika metaboliska aktiviteten hos tumörer från två murina pankreas adenokarcinomcellinjer12. Baserat på litteratur 24,38 valde vi att använda låghastighetscentrifugeringsmetoden för att undvika cellbrott och utspädning från intracellulärt innehåll. Både mängden glukos och laktat i TIF återspeglade de olika glykolytiska egenskaperna hos de två olika cellinjerna. Här beskriver vi i detalj protokollet för de två vanligaste metoderna för isolering av TIF: vävnadscentrifugering och vävnadseluering (figur 2).
Figur 2: Schematisk representation av tumörinterstitiella vätskeisoleringsmetoder. Schematisk illustration av de tekniker som beskrivs i detalj i protokollet, nämligen vävnadscentrifugering (A) och vävnadsel (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
För alla inskrivna patienter samlades perifert blod och bukspottkörteljuice vid operationen enligt protokoll som godkänts av institutionens etiska kommitté. Alla patienter inkluderades i studien efter undertecknat informerat samtycke inklusive insamling av biologiska prover och kliniska data. Studien godkändes av institutionens etiska kommitté (protokollnummer ICH-595, godkännande utfärdat i maj 2009). Förfaranden som involverade möss och deras vård överensstämde med EU:s och institutionernas riktlinjer (protokoll-ID 121/2016-PR).
1. Isolering av bukspottkörteljuice
OBS: Återkallandet av bukspottkörteljuice utförs i samband med ett öppet förfarande för pankreasresektion (t.ex. pankreaticoduodenektomi, total pankreatektomi, distal pankreatektomi) av en equipe av expert pankreaskirurger.
- Val av patient
- Tänk på proceduren någon patient som är planerad för en öppen pankreasresektion.
- Bekräfta inkludering om huvudstorleken på bukspottskörtelkanalen anses tillräcklig för att möjliggöra hämtning av bukspottkörteljuice. Minsta gräns i diameter för den huvudsakliga bukspottkörtelkanalen anses vara 2 mm vid kontrastförstärkt CT-avbildning.
- Preoperativ studie av bukspottkörtelkanalen vid kontrastförstärkt CT-avbildning för att hjälpa till att planera hämtning av bukspottkörteljuice
- Tridimensionellt lokalisera den huvudsakliga bukspottkörtelkanalen i körteln vid nivån på bukspottkörtelhalsen: mät avståndet från den huvudsakliga bukspottkörtelkanalen från den främre, överlägsna och underlägsna bukspottkörtelmarginalen på tvärsnittsglas och koronala och sagittala renderingar. En gång i operationssalen, använd dessa mätningar för att approximera rätt plats där du ska punktera bukspottkörteln för att kannulera Wirsung-kanalen och för att hämta bukspottkörteljuice.
- Beredning av material
- Sterilt material: Öppna det sterila höljet med en 25 G nål och en 3 ml spruta och placera dem i det sterila fältet i samarbete med skrubbsjuksköterskan.
- Osterilt material: Förvara ett 3 ml K2EDTA vakuumprovrör redo till hands i operationssalen för förvaring av vätskan.
- Förberedelse av patienten
- Placera patienten på operationssalens säng. Inducera blandad generell anestesi, med hjälp av Remifentanil, Sevorane och Rocuronium, intubera sedan och börja ventilera patienten. Placera patienten i liggande decubitus med höger arm undangömd mot kroppen och vänster arm bortförd till 90° grader säkrad på en armbräda.
- Desinficera huden i buken på platsen för snittet. Skapa och behåll ett sterilt fält på buken som draperar patienten.
- Kirurgiskt ingrepp
- Utför ett subkostalt snitt och få tillgång till bukhålan. Placera en Rochard bukindragning för organexponering.
- Exponera och mobilisera bukspottkörteln genom Kocher-manövrering, öppning av det gastrokoliska ligamentet, snitt av retroperitonealvävnaden längs bukspottkörtelns överlägsna och underlägsna kant av bukspottkörteln som skapar ett dissektionsplan mellan bukspottkörtelhalsen och överlägsen mesenterisk ven som ligger bakom.
- När bukspottkörteln har mobiliserats och exponerats, fortsätt till bukspottkörteljuiceuttag före sektionering av bukspottskörtelns hals.
- Identifiering och lokalisering av bukspottkörtelkanalen
- Uppskatta placeringen av bukspottkörtelkanalen med hjälp av mätningen som gjorts vid avbildning och palpera sedan den främre ytan av bukspottkörteln för att identifiera dess exakta plats.
- Samling av bukspottkörteljuice
- Håll bukspottkörtelhuvudet och tolvfingertarmen underifrån och lyft det med vänster hand och markera platsen för bukspottkörtelkanalen med den första siffran.
- Ta tag i den högra handen på 3 ml sprutan med 25 G-nålen monterad på.
- Använd höger hand för att sätta in nålen i bukspottkörteln bara distal till vänster tumme. Bestäm penetrationsdjupet och nålens lutningsgrad baserat på preoperativa mätningar och på uppfattningen att ha trängt in i kanalväggen.
- Dra ut saften med sprutan. Om det inte är möjligt att hämta saften, flytta nålen i de fyra riktningarna och försök att kannulera bukspottkörtelkanalen.
- När bukspottkörtelsaften har hämtats, flytta den utanför det sterila fältet och överför den till 3 ml K2EDTA vakuumprovrör. Håll vid 4 °C tills provet överförs till labbet och fortsätt till vidare bearbetning så tidigt som möjligt.
OBS: Volymen av bukspottkörteljuice som kan återvinnas med denna procedur varierar kraftigt, från 0,2 ml till 3 ml enligt vår erfarenhet. Mängden juice som hämtas är mycket beroende av patienten: dimensionen av Wirsung-kanalen och bukspottkörtelns funktionella status (fungerande kontra atrofisk körtel). Enligt vår erfarenhet finns det ingen lämplig som kan användas för att öka mängden pankreasjuice som hämtas.
2. Bearbetning av bukspottkörteljuice
- Centrifugera bukspottkörteljuice vid 400 x g i 10 minuter vid 4 °C för att avlägsna celler eller skräp.
OBS: Bukspottkörteljuice ska vara klar och transparent i färg före centrifugering. Blodförorening under operationen kan ibland uppstå, vilket gör att provet verkar grumligare och rödare i färgen. Överväg att utesluta sådana prover från ytterligare analyser. - Återvinn supernatanten, alikvoten och förvara vid -80 °C tills vidare analyser.
3. Induktion av subkutana tumörer
OBS: De murina Panc02- och DT6606-cellinjerna erhölls från prof. Lorenzo Piemonti (San Raffaele Diabetes Institute, Milano, Italien) respektive prof. Francesco Novelli (Center for Experimental Research and Medical Studies, Torino, Italien), som tidigare beskrivits12.
- Tillväxt av tumörceller
- Kultur Panc02 och DT6606 celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium innehållande 10% foster bovint serum (FBS), 2mM L-glutamin och 1% penicillin-streptomycin antibiotikum.
- Tina frysta celler 1-2 veckor före tumörinjektion, beroende på cellinjens tillväxthastighet.
- Odla celler vid 37 °C med 5%CO2 och 95% luftfuktighet under sterila förhållanden.
- Lossa celler med 0,025% Trypsin/EDTA-lösning i 5 min vid 37 °C när de når 80% sammanflöde och eliminerar trypsin genom centrifugering.
OBS: DT6606 är primära, inte förevigade, celler, härledda från LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre-musen, och bör inte passeras mer än 3 gånger före injektion in vivo för att bibehålla sina ursprungliga egenskaper. Det rekommenderas att tina DT6606-celler 7-10 dagar före injektion.
- Injektion av tumörceller in vivo
- Trypsinisera celler (se steg 3.1.4) och tvätta dem en gång med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Eliminera PBS genom centrifugering och återsuspendera celler i färsk PBS innan du räknar.
- Räkna cellerna och återsuspendera dem i PBS i en koncentration av 0,5-1 x 107 celler / ml för att få en slutlig koncentration på 0,5-1 x 106 celler / 100 μL att injicera i varje mus. Förbered cellerna i överskott. Håll cellerna vid 4 °C eller på is tills proceduren är slut.
- Gruppera djuren (8 veckor gamla honmöss av typen C57BL/6J) i olika burar enligt olika cellinjer eller behandlingar.
- Håll fast djuren manuellt och bedöva dem med en blandning av ketamin (80 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) eller enligt lokalt godkända förfaranden.
- Raka injektionsstället, vanligtvis en flank ovanför ett ben, med en elektrisk rakapparat och rengör försiktigt injektionsstället med alkohol.
- Pipettera upp och ner i cellsuspensionen med en 1 ml spruta, ta bort eventuella luftbubblor genom att flytta kolven upp och ner. Fäst en 25 G nål på sprutan och tryck kolven uppåt tills cellsuspensionen når nålöppningen.
- Nyp flankens hud med platta pincett och sätt försiktigt in nålen vid basen av hudvecket mellan pincettarna utan att punktera bukhålan eller muskulaturen. För att verifiera nålens korrekta position, försök försiktigt att flytta nålspetsen i sidled under huden. Nålen ska röra sig fritt.
- Injicera långsamt 100 μl cellsuspension (innehållande 0,5-1 x 106 celler), kläm fast injektionsstället försiktigt i några sekunder och dra långsamt ut nålen utan rörelse i sidled.
- Sätt tillbaka musen till buret och övervaka återhämtningen från anestesi.
- Kontrollera tumörtillväxten med hjälp av en bromsok i 3-4 veckor. Avliva djuren när tumörer når cirka 0,5-1 cm3 med CO2 eller enligt lokalt godkända förfaranden.
4. Isolering av tumörinterstitiell vätska (TIF)
- Excision av subkutana tumörer
- Blockera djurens lemmar med papperstejp och rengör huden med alkohol. Skär huden öppen på buken för att skilja den från bukhinnan och fortsätt upp till lemmarna. Skär ut tumören som odlas under flankens hud med hjälp av sax, klämmor och så småningom en skalpell.
- Väg tumören och förvara den i ett rent rör på is tills du har isolerat TIF.
- Isolering av TIF genom centrifugering
- Skär tumören i hälften, skölj de två delarna snabbt i PBS och torka dem försiktigt på filterpapper för att ta bort överskott av PBS. Utför dessa steg så snabbt som möjligt för att undvika avdunstning från tumören.
- Överför omedelbart tumören till en 20 μm nyloncellssil fäst ovanpå ett 50 ml koniskt rör.
- Centrifugera röret vid 400 x g i 10 minuter vid 4 °C.
OBS: Denna låghastighetscentrifugering bevarar cellintegriteten och undviker kontaminering av TIF genom intracellulärt fack. Intracellulärt innehållsläckage kan testas i nedströmsapplikationer, till exempel genom att bedöma närvaron av intracellulära hushållningsproteiner, såsom ribosomala proteiner25. - Återställ TIF från botten av röret, alikvotera det så småningom och frys det omedelbart på torris och förvara vid -80 ° C tills vidare analys.
Valfritt: Baserat på den nedströms proteomiska analysen som ska utföras, späd provet i PBS med en proteashämmare cocktail för att undvika nedbrytning av specifika molekyler.
OBS: Beroende på tumörens sammansättning ger i vissa fall mycket små tumörer ingen vätska.
- Isolering av TIF genom eluering
- Skär tumören i små bitar (≈1-3 mm3) med sax eller en skalpell och skölj försiktigt med kall PBS.
OBS: I detta steg är det mycket viktigt att arbeta snabbt och utföra minimal manipulation för att undvika cellskador. - Överför tumörbitarna till ett 1,5 ml rör och tillsätt 500 μL PBS med en proteashämmare cocktail för att undvika nedbrytning av analyter. Inkubera i 1 timme vid 37 °C och 5 %CO2.
- Återställ supernatanten och överför den till ett nytt 1,5 ml rör. Centrifugera vid 1 000 x g i 5 minuter vid 4 °C för att avlägsna eventuella celler från provet.
- Överför supernatanten till ett nytt rör och centrifugera igen vid 2 000 x g i 8 minuter vid 4 °C.
- Överför supernatanten till ett nytt rör och centrifugera igen vid 20 000 x g i 30 minuter vid 4 °C för att avlägsna skräp. Återställ supernatanten. Alikvotera och frys omedelbart TIF-provet på torris och förvara vid -80 °C tills det analyseras ytterligare.
- Skär tumören i små bitar (≈1-3 mm3) med sax eller en skalpell och skölj försiktigt med kall PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi följde proceduren som beskrivs ovan för att erhålla bukspottkörteljuice från patienter med PDAC (n = 31) och andra godartade bukspottkörtelbesvär (icke-PDAC, n = 9), inklusive pankreatit (n = 2), papillär-ampullatumörer (n = 4), neuroendokrina tumörer (n = 2), intraduktal papillär mucinös neoplasi (IPMN; n = 1) 12. Bukspottkörteljuiceproverna utsattes sedan för metabolomisk analys med kärnmagnetisk resonans (1H-NMR)12. Genom att filtrera de breda NMR-signalerna från makromolekyler (t.ex. lipoproteiner, lipider, etc.) kunde vi i detalj uppskatta metaboliter med liten molekylvikt, vilket visas i spektra 1D Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) (figur 3A). Övervakad OPLS-DA-analys visade att den metaboliska profilen som upptäcktes i bukspottkörteljuice kunde skilja mellan PDAC- och icke-PDAC-patienter med en noggrannhet på 82,4% erhållen genom korsvalidering (figur 3B). Intressant nog gav metabolomisk analys utförd på plasmaprover från samma patienter inte samma diskriminativa effekt (noggrannhet på 75,2% erhållen genom korsvalidering) (figur 3C). Dessa resultat indikerar att bukspottkörteljuice är ett proteinrikt prov och lämpligt för omfattande "omics" -analyser. Dessutom tyder den överlägsna diskriminativa kraften hos bukspottkörteljuice jämfört med plasma på att flytta "uppströms" till prover som är mer proximala till tumörstället kan vara en framgångsrik strategi för att identifiera biomarkörer som hjälper till att skilja ut PDAC från andra bukspottkörtelsjukdomar.
Figur 3: Metabolomiskt innehåll i bukspottkörteljuice och plasma. A) 1H-NMR CPMG-spektra av PDAC-prover (n=31, blå) och icke-PDAC-prover (n=9, grönt) som visar uppgifter om metaboliter med liten molekylvikt i bukspottkörteljuicerna. ppm, miljondelar. (B) Poäng för övervakad multivariat OPLS-DA-analys på CPMG-spektra från PDAC-prover från bukspottkörteljuice (blå cirklar) och icke-PDAC-prover (lila trianglar). Analysen separerar de två grupperna (var och en skisserad av ett spindeldiagram), med en noggrannhet på 82,4% erhållen genom korsvalidering. (C) Poäng för övervakad multivariat OPLS-DA-analys på 1D-NOESY-spektra från plasma-PDAC-prover (n = 22, blå cirklar) och icke-PDAC-prover (n = 7, lila trianglar). Noggrannhet på 75,2% erhållen genom korsvalidering. Denna siffra har modifierats från Cortese et al.12 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att visa att TIF-innehållet på ett tillförlitligt sätt återspeglar förändringar i tumörmikromiljön injicerade vi subkutant två cellinjer för bukspottkörtelcancer med motsatt glykolytisk hastighet, Panc02 (mycket glykolytisk) och DT6606 (låg glykolytisk), enligt protokollet som beskrivs ovan. Vi isolerade sedan TIF från de utskurna tumörerna med hjälp av den låghastighetscentrifugeringsmetod som beskrivs ovan (se punkt 4.2). Från tumörer av vikt mellan 0,25-1 g återhämtade vi ett intervall på 5-15 μL TIF, som sedan användes för att kvantifiera koncentrationen av glukos och laktat. TIF från mycket glykolytiska tumörer innehöll mindre glukos och mer laktat jämfört med lågt glykolytiska tumörer (figur 4). Dessa data visar att TIF kan användas som en källa för tumör-härledda metaboliter och förändringar enligt själva tumören.
Figur 4: Glukos- och laktatinnehåll i TIF återspeglar inneboende tumöregenskaper. (A) Glukos- och (B) laktatkoncentration i interstitiell vätska, isolerad med hjälp av vävnadscentrifugeringsmetoden, från Panc02 (mycket glykolytisk, n = 10 i A, n = 9 i B) och DT6606 (lågt glykolytisk, n = 5 i A, n = 4 i B) subkutant implanterade tumörer. Låddiagram ger median, nedre kvartil och övre kvartil vid lådan, och minimum och maximum vid morrhåren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie har vi beskrivit tekniken för att intraoperativt samla bukspottkörteljuice, en i stort sett outforskad vätskebiopsi. Vi har nyligen visat att bukspottkörteljuice kan utnyttjas som en källa till metaboliska markörer för sjukdom12. Metabolomisk analys på andra flytande biopsier, såsom blod 5,6,7, urin8 och saliv9, har visat lovande resultat i diskriminering mellan PDAC och friska försökspersoner eller pankreatit. Bukspottkörteljuice utsöndras emellertid direkt av bukspottkörtelkanalceller, och på grund av dess närhet till tumörstället kan det vara en mer tillförlitlig indikator på förändringarna i den omgivande vävnaden, även i de mycket tidiga stadierna av sjukdomen. Faktum är att medan H-NMR-spektraldata för bukspottkörteljuice uppnådde en diskriminering mellan PDAC-patienter och andra godartade bukspottkörtelsjukdomar, gjorde plasmaprover inte det. Därför, även om det är mindre tillgängligt än andra vätskebiopsier, representerar bukspottkörteljuice en värdefull källa till kliniska biomarkörer och kan hjälpa till att identifiera snabbt utvecklande sjukdomar. Vi har här beskrivit den intraoperativa tekniken för insamling av bukspottkörteljuice; det kan dock också utföras under minimalt invasiva procedurer, i perspektivet att identifiera värdefulla tidiga markörer för sjukdom. Det återstår att fastställa om de olika insamlingsförfarandena påverkar den proteomiska sammansättningen av bukspottkörteljuice.
Medan andra vätskebiopsier är lättillgängliga i PDAC murine-modeller, kan insamlingen av bukspottkörteljuice in vivo vara mycket utmanande om man överväger genetiska eller ortotopiska modeller, och är inte alls genomförbart i subkutana modeller. Därför har vi i detta dokument föreslagit användningen av tumörinterstitiell vätska som ett värdefullt och allmänt tillämpligt alternativ. Faktum är att interstitiell vätskekomposition, på samma sätt som bukspottkörteljuice, påverkas direkt av förändringar i den lokala miljön. Proteomisk profilering på TIF från olika tumörer, såsom hepatocellulär 45,46, njurcell 41, äggstockar 22,47,48 och bröst 42,49 karcinom, har visat uppmuntrande resultat i forskningen för kandidatbiomarkörer. Det finns dock liten överlappning i de identifierade kandidatproteinerna, vilket tyder på att den metod som används för att isolera TIF, tillsammans med den utförda nedströmsanalysen och datainsamlingen, kan påverka de detekterade analyterna. En nyligen genomförd studie om skivepitelcancer som jämförde de två TIF-isoleringsmetoderna som beskrivs här, centrifugering och eluering, observerade en stark konsistens i TIF-kompositionen oberoende av den använda metoden, även om centrifugering gav ett högre innehåll av extracellulära proteiner25.
Båda metoderna som beskrivs här för isolering av TIF, vävnadscentrifugering och vävnadseluering har fördelen att de är tekniskt krävande, snabba och kräver endast grundläggande laboratorieutrustning. Jämfört med andra tillvägagångssätt, såsom mikrodialys och kapillär ultrafiltrering, har centrifugerings- och elueringsteknikerna den inneboende begränsningen att endast vara genomförbara ex vivo. Det är viktigt att ta hänsyn till flera problem när man väljer lämplig metod, såsom experimentets analytiska syfte, den återvunna volymen och cellbrott. Tumörens sammansättning bör också övervägas, eftersom det kan påverka volymen av TIF som återvinns. Vävnadscentrifugering utvecklades ursprungligen för cellfattiga och kollagenrika vävnader såsom hornhinna38; tumörer å andra sidan är vanligtvis vävnader som kännetecknas av hög cellularitet och rik vaskularisering, båda funktioner som ökar hydraulisk ledningsförmåga och bör därför underlätta isoleringen av TIF genom centrifugering. Vissa tumörer, inklusive PDAC, uppvisar emellertid en riklig stromal eller fibrotisk komponent, rik på extracellulära matrisproteiner, såsom kollagener, som tenderar att behålla makromolekyler i vävnaden21.
Vävnadseluering å andra sidan är baserad på passiv diffusion av proteiner från vävnaden till eluatet och har framgångsrikt utnyttjats för en mängd olika tumörer43. Eluering ger återvinning av större volymer, men proteiner kommer att spädas ut. Av denna anledning kanske vävnadselution inte är lämplig för molekyler med mycket lågt överflöd. Dessutom kräver eluering en högre grad av manipulation av tumören, vilket eventuellt resulterar i intracellulärt innehållsläckage i TIF. Detta kan vara irrelevant för upptäckt av biomarkörer men kan införa en bias om syftet är att bestämma lokal produktion av proteiner. Mängden cellbrott bör testas i nedströms applikationer för att välja den lämpligaste metoden enligt tumörtypen. Detta kan utföras på flera sätt, till exempel genom att testa närvaron av hushållningsproteiner, såsom ribosomala proteiner, i TIF25. Ett annat föreslaget tillvägagångssätt är att jämföra koncentrationerna av utvalda extracellulära ämnen, såsom kreatinin eller Na+, i TIF och plasma, som bör vara liknande22. Läckage av intracellulärt innehåll bör också övervägas för centrifugeringsmetoden. Faktum är att det fortfarande inte finns någon allmän överenskommelse om vad som bör betraktas som "låg hastighet" för att undvika cellbrott, möjligen på grund av skillnaderna i tumörkomposition. Vi valde att använda en hastighet på 400 x g , eftersom det har visat sig att ingen utspädning från intracellulärt innehåll sker för g-krafter <42438.
Oavsett tillvägagångssätt representerar TIF en värdefull och allmänt tillämplig källa för att prova tumörmikromiljön. Vi har visat att det rekapitulerar tumör-inneboende egenskaper och kan vara användbart för identifiering av biomarkörer för sjukdom eller terapeutiska mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Roberta Migliore för tekniskt stöd. Forskningen som leder till dessa resultat har fått finansiering från Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) under IG2016-ID.18443-projektet - PI Marchesi Federica. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förberedelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Greiner BioOne | GR616201 | |
| 20 µm nylon cell strainer | pluriSelect | 43-50020-03 | |
| 25G needle | BD Biosciences | 305122 | |
| 3 mL K2EDTA vacutainer | BD Biosciences | 366473 | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309656 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Clamps | Medicon | 06.20.12 | |
| Disposable scalpel | Medicom | 9000-10 | |
| Fetal bovine serum | Microtech | MG10432 | |
| Flat-tipped forceps | Medicon | 06.00.10 | |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | ECB3001D | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 34044100 | |
| RPMI medium | Euroclone | ECB9006L | |
| Scissors | Medicon | 02.04.09 | |
| Trypsin/EDTA 1x | Lonza | BE17-161F | |
| Ultraglutamine 100x | Lonza | BE17-605E/U1 |
References
- Costello, E., Greenhalf, W., Neoptolemos, J. P. New biomarkers and targets in pancreatic cancer and their application to treatment. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (8), 435-444 (2012).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (1), 7-30 (2020).
- Neoptolemos, J. P., et al. Therapeutic developments in pancreatic cancer: current and future perspectives. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (6), 333-348 (2018).
- Sahin, I. H., Askan, G., Hu, Z. I., O'Reilly, E. M. Immunotherapy in pancreatic ductal adenocarcinoma: an emerging entity. Annals of Oncology. 28 (12), 2950-2961 (2017).
- Mayerle, J., et al. Metabolic biomarker signature to differentiate pancreatic ductal adenocarcinoma from chronic pancreatitis. Gut. 67 (1), 128-137 (2018).
- Bathe, O. F., et al. Feasibility of identifying pancreatic cancer based on serum metabolomics. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 20 (1), 140-147 (2011).
- Mayers, J. R., et al. Elevation of circulating branched-chain amino acids is an early event in human pancreatic adenocarcinoma development. Nature Medicine. 20 (10), 1193-1198 (2014).
- Napoli, C., et al. Urine metabolic signature of pancreatic ductal adenocarcinoma by (1)h nuclear magnetic resonance: identification, mapping, and evolution. Journal of Proteome Research. 11 (1), 1274-1283 (2012).
- Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).
- Chen, R., et al. Comparison of pancreas juice proteins from cancer versus pancreatitis using quantitative proteomic analysis. Pancreas. 34 (1), 70-79 (2007).
- Mori, Y., et al. A minimally invasive and simple screening test for detection of pancreatic ductal adenocarcinoma using biomarkers in duodenal juice. Pancreas. 42 (2), 187-192 (2013).
- Cortese, N., et al. Metabolome of Pancreatic Juice Delineates Distinct Clinical Profiles of Pancreatic Cancer and Reveals a Link between Glucose Metabolism and PD-1+ Cells. Cancer Immunology Research. , (2020).
- Tanaka, M., et al. Cytologic Analysis of Pancreatic Juice Increases Specificity of Detection of Malignant IPMN-A Systematic Review. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 17 (11), 2199-2211 (2019).
- Chen, K. T., et al. Potential prognostic biomarkers of pancreatic cancer. Pancreas. 43 (1), 22-27 (2014).
- Tian, M., et al. Proteomic analysis identifies MMP-9, DJ-1 and A1BG as overexpressed proteins in pancreatic juice from pancreatic ductal adenocarcinoma patients. BMC Cancer. 8, 241 (2008).
- Shi, C., et al. Sensitive and quantitative detection of KRAS2 gene mutations in pancreatic duct juice differentiates patients with pancreatic cancer from chronic pancreatitis, potential for early detection. Cancer Biology & Therapy. 7 (3), 353-360 (2008).
- Rogers, C. D., et al. Differentiating pancreatic lesions by microarray and QPCR analysis of pancreatic juice RNAs. Cancer Biology & Therapy. 5 (10), 1383-1389 (2006).
- Matsubayashi, H., et al. DNA methylation alterations in the pancreatic juice of patients with suspected pancreatic disease. Cancer Research. 66 (2), 1208-1217 (2006).
- Cote, G. A., et al. A pilot study to develop a diagnostic test for pancreatic ductal adenocarcinoma based on differential expression of select miRNA in plasma and bile. The American Journal of Gastroenterology. 109 (12), 1942-1952 (2014).
- Yu, J., et al. Digital next-generation sequencing identifies low-abundance mutations in pancreatic juice samples collected from the duodenum of patients with pancreatic cancer and intraductal papillary mucinous neoplasms. Gut. , (2016).
- Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiological Reviews. 92 (3), 1005-1060 (2012).
- Haslene-Hox, H., et al. A new method for isolation of interstitial fluid from human solid tumors applied to proteomic analysis of ovarian carcinoma tissue. PLoS One. 6 (4), 19217 (2011).
- Zhang, J., et al. In-depth proteomic analysis of tissue interstitial fluid for hepatocellular carcinoma serum biomarker discovery. British Journal of Cancer. 117 (11), 1676-1684 (2017).
- Sullivan, M. R., et al. Quantification of microenvironmental metabolites in murine cancers reveals determinants of tumor nutrient availability. Elife. 8, (2019).
- Matas-Nadal, C., et al. Evaluation of Tumor Interstitial Fluid-Extraction Methods for Proteome Analysis: Comparison of Biopsy Elution versus Centrifugation. Journal of Proteome Research. 19 (7), 2598-2605 (2020).
- Espinoza, J. A., et al. Cytokine profiling of tumor interstitial fluid of the breast and its relationship with lymphocyte infiltration and clinicopathological characteristics. Oncoimmunology. 5 (12), 1248015 (2016).
- Halvorsen, A. R., et al. Profiling of microRNAs in tumor interstitial fluid of breast tumors - a novel resource to identify biomarkers for prognostic classification and detection of cancer. Molecular Oncology. 11 (2), 220-234 (2017).
- Yang, S., Huang, C. M. Recent advances in protein profiling of tissues and tissue fluids. Expert Review of Proteomics. 4, 515-529 (2007).
- Huang, C. M., et al. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6 (22), 6107-6116 (2006).
- Leegsma-Vogt, G., Janle, E., Ash, S. R., Venema, K., Korf, J. Utilization of in vivo ultrafiltration in biomedical research and clinical applications. Life Sciences. 73 (16), 2005-2018 (2003).
- Schneiderheinze, J. M., Hogan, B. L. Selective in vivo and in vitro sampling of proteins using miniature ultrafiltration sampling probes. Analytical Chemistry. 68 (21), 3758-3762 (1996).
- Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clinical Applications. 5 (11-12), 636-643 (2011).
- Xu, B. J., et al. Microdialysis combined with proteomics for protein identification in breast tumor microenvironment in vivo. Cancer Microenvironment. 4 (1), 61-71 (2010).
- Bendrik, C., Dabrosin, C. Estradiol increases IL-8 secretion of normal human breast tissue and breast cancer in vivo. The Journal of Immunology. 182 (1), 371-378 (2009).
- Ao, X., Stenken, J. A. Microdialysis sampling of cytokines. Methods. 38 (4), 331-341 (2006).
- Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
- Choi, J., et al. Intraperitoneal immunotherapy for metastatic ovarian carcinoma: Resistance of intratumoral collagen to antibody penetration. Clinical Cancer Research. 12 (6), 1906-1912 (2006).
- Wiig, H., Aukland, K., Tenstad, O. Isolation of interstitial fluid from rat mammary tumors by a centrifugation method. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (1), 416-424 (2003).
- Li, S., Wang, R., Zhang, M., Wang, L., Cheng, S. Proteomic analysis of non-small cell lung cancer tissue interstitial fluids. World Journal of Surgical Oncology. 11, 173 (2013).
- Fijneman, R. J., et al. Proximal fluid proteome profiling of mouse colon tumors reveals biomarkers for early diagnosis of human colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 18 (9), 2613-2624 (2012).
- Teng, P. N., Hood, B. L., Sun, M., Dhir, R., Conrads, T. P. Differential proteomic analysis of renal cell carcinoma tissue interstitial fluid. Journal of Proteome Research. 10 (3), 1333-1342 (2011).
- Turtoi, A., et al. Novel comprehensive approach for accessible biomarker identification and absolute quantification from precious human tissues. Journal of Proteome Research. 10 (7), 3160-3182 (2011).
- Wagner, M., Wiig, H. Tumor Interstitial Fluid Formation, Characterization, and Clinical Implications. Frontiers in Oncology. 5, 115 (2015).
- Haslene-Hox, H., Tenstad, O., Wiig, H. Interstitial fluid-a reflection of the tumor cell microenvironment and secretome. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2336-2346 (2013).
- Hsieh, S. Y., et al. Secreted ERBB3 isoforms are serum markers for early hepatoma in patients with chronic hepatitis and cirrhosis. Journal of Proteome Research. 10, 4715-4724 (2011).
- Sun, W., et al. Characterization of the liver tissue interstitial fluid (TIF) proteome indicates potential for application in liver disease biomarker discovery. Journal of Proteome Research. 9 (2), 1020-1031 (2010).
- Haslene-Hox, H., et al. Increased WD-repeat containing protein 1 in interstitial fluid from ovarian carcinomas shown by comparative proteomic analysis of malignant and healthy gynecological tissue. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2347-2359 (2013).
- Wang, T. H., et al. Stress-induced phosphoprotein 1 as a secreted biomarker for human ovarian cancer promotes cancer cell proliferation. Molecular & Cellular Proteomics. 9, 1873-1884 (2010).
- Gromov, P., et al. Up-regulated proteins in the fluid bathing the tumour cell microenvironment as potential serological markers for early detection of cancer of the breast. Molecular Oncology. 4 (1), 65-89 (2010).
