Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Измерение 3-мерных распределений цАМФ в живых клетках с использованием 4-мерной (x, y, z и λ) гиперспектральной визуализации и анализа FRET

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61720
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

Summary

Из-за низкого отношения сигнал/шум (SNR) датчиков на основе резонансной передачи энергии (FRET) измерения сигналов цАМФ были сложными, особенно в трех пространственных измерениях. Здесь мы описываем гиперспектральную методологию визуализации и анализа FRET, которая позволяет измерять распределение цАМФ в трех пространственных измерениях.

Abstract

Циклический АМП является вторым мессенджером, который участвует в широком спектре клеточной и физиологической деятельности. Несколько исследований показывают, что сигналы цАМФ разделены и что компартментализация способствует специфичности сигналов в рамках сигнального пути цАМФ. Разработка биосенсоров на основе резонансного переноса энергии (FRET) на основе Fӧrster способствовала способности измерять и визуализировать сигналы цАМФ в клетках. Однако эти измерения часто ограничиваются двумя пространственными измерениями, что может привести к неправильному толкованию данных. На сегодняшний день были проведены лишь очень ограниченные измерения сигналов цАМФ в трех пространственных измерениях (x, y и z) из-за технических ограничений в использовании датчиков FRET, которые по своей природе демонстрируют низкое отношение сигнал/шум (SNR). Кроме того, традиционные подходы к визуализации на основе фильтров часто неэффективны для точного измерения сигналов цАМФ в локализованных субклеточных областях из-за ряда факторов, включая спектральные перекрестные помехи, ограниченную силу сигнала и автофлуоресценцию. Чтобы преодолеть эти ограничения и позволить использовать биосенсоры на основе FRET с несколькими флуорофорами, мы разработали гиперспектральные подходы к визуализации и анализу FRET, которые обеспечивают спектральную специфичность для расчета эффективности FRET и возможность спектрально отделять сигналы FRET от смешивающей автофлуоресценции и / или сигналов от дополнительных флуоресцентных меток. Здесь мы представляем методологию реализации гиперспектральной визуализации FRET, а также необходимость построения соответствующей спектральной библиотеки, которая не является ни недовыборочной, ни передискретированной для выполнения спектрального размешивания. Хотя мы представляем эту методологию для измерения трехмерных распределений цАМФ в легочных микрососудистых эндотелиальных клетках (PMVECs), эта методология может быть использована для изучения пространственных распределений цАМФ в ряде типов клеток.

Introduction

Циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) является вторым мессенджером, участвующим в ключевых клеточных и физиологических процессах, включая деление клеток, приток кальция, транскрипцию генов и трансдукцию сигналов. Растущее количество доказательств свидетельствует о существовании цАМФ-компартментов в клетке, благодаря которым достигается сигнальнаяспецифичность 1,2,3,4,5,6,7. До недавнего времени компартментализация цАМФ выводилась на основе различных физиологических или клеточных эффектов, индуцированных различными агонистами G-связанных рецепторов8,9,10,11. Совсем недавно флуоресцентные зонды на основе FRET предоставили новые подходы для прямого измерения и наблюдения сигналов цАМФ в ячейке12,13,14.

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) — это физическое явление, при котором передача энергии происходит между донорскими и акцепторными молекулами нерадиационным образом, когда молекулы находятся в непосредственнойблизости 15,16. С развитием флуоресцентных индикаторов на основе FRET это физическое явление было использовано в биологических приложениях для изучения белково-белковых взаимодействий17,колокализации белка18,передачи сигналов Ca+2 19,экспрессии генов20,деления клеток21 и циклической нуклеотидной сигнализации. Индикаторы цАМФ на основе FRET обычно состоят из цАМФ-связывающего домена, донорского флуорофора и акцепторного флуорофора22. Например, датчик цАМФ H18812,22, используемый в данной методологии, состоит из цАМФ-связующего домена, полученного из Epac, зажатого между бирюзовыми (донорскими) и венериными (акцепторными) флуорофорами. В базальных условиях (несвязанные) бирюза и Венера находятся в такой ориентации, что между флуорофорами возникает FRET. При связывании цАМФ с связующим доменом происходит конформационное изменение, в результате чего Бирюза и Венера раздвигаются, что приводит к снижению FRET.

Подходы к визуализации на основе FRET предлагают многообещающий инструмент для исследования и визуализации сигналов цАМФ в клетке. Однако современные методы микроскопической визуализации на основе FRET часто лишь частично успешны в достижении достаточной силы сигнала для измерения FRET с субклеточной пространственной четкостью. Это связано с несколькими факторами, включая ограниченную силу сигнала многих репортеров FRET, высокий уровень точности, необходимый для точной количественной оценки изменений эффективности FRET, и наличие смешанных факторов, таких как клеточная автофлуоресценция23,24. Результатом часто является изображение FRET, которое страдает от слабого SNR, что делает визуализацию субклеточных изменений в FRET очень сложной. Кроме того, исследование пространственно локализованных сигналов цАМФ почти исключительно проводилось только в двух пространственных измерениях, а осевое распределение цАМФ редко считалось25. Вероятно, это связано с тем, что низкий SNR препятствует возможности измерения и визуализации градиентов цАМФ в трех пространственных измерениях. Чтобы преодолеть ограничения использования датчиков FRET с низким SNR, мы внедрили гиперспектральные подходы к визуализации и анализу для измерения FRET в отдельных клетках25,26,27.

Подходы к гиперспектральной визуализации были разработаны НАСА для дифференциации наземных объектов, присутствующих на спутниковых снимках28,29. С тех пор эти методы были переведены в поле флуоресцентной микроскопии30,с несколькими коммерческими системами конфокальных микроскопов, предлагающими спектральные детекторы. В традиционной (неспектральной) флуоресцентной визуализации образец возбуждается с помощью полосового фильтра или лазерной линии, а излучение собирается с помощью второго полосового фильтра, часто выбираемого в соответствии с пиковой длиной волны излучения флуорофора (флуорофоров). Напротив, подходы к гиперспектральной визуализации направлены на выборку полного спектрального профиля либо флуоресцентного излучения26,31,32, либо возбуждения33,34 на определенных интервалах длин волн. В наших предыдущих исследованиях мы показали, что гиперспектральные подходы к визуализации и анализу могут предложить улучшенную количественную оценку сигналов FRET в клетках по сравнению с традиционными методами визуализации FRET на основе фильтров26. Здесь мы представляем методологию выполнения 4-мерной (x, y, z и λ) гиперспектральной визуализации и анализа FRET для измерения и визуализации распределений цАМФ в трех пространственных измерениях. Эти подходы позволили визуализировать агонист-индуцированные цАМФ пространственные градиенты в одиночных ячейках25. Интересно, что в зависимости от агониста градиенты цАМФ могут быть очевидны в клетках. Представленная здесь методология использует спектральное размешивание неоднородного фона и клеточной автофлуоресценции для повышения точности измерений FRET. Хотя эта методология демонстрируется в легочных микрососудистых эндотелиальных клетках (PMVEC) с использованием биосенсора цАМФ FRET, методология может быть легко модифицирована для использования с альтернативными репортерами FRET или альтернативными клеточными линиями.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол следует процедурам, утвержденным Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Университетом Южной Алабамы.

1. Подготовка клеток, образцов и реагентов к визуализации

  1. Выделяют легочные микрососудистые эндотелиальные клетки крыс (PMVECs), как описаноранее 35.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки были выделены и культивированы ядром клеточной культуры в Университете Южной Алабамы, Мобил, штат Алабама, на 100-миллиметровых блюдах для клеточных культур.
  2. Высевят ИВПК на 25 мм круглых стеклянных обшивках и дадут им расти в инкубаторе при 37 °C до тех пор, пока клетки не достигнут не менее 80% конфюсации (не менее 24 часов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки и тип клеток могут варьироваться от исследования к исследованию, и, следовательно, для посева и выращивания клеток следует соблюдать процедуры клеточной культуры, специфичные для клеток. Протокол посева и культивирования клеток, используемый в этих исследованиях, доступен в качестве дополнительной информации в файле под названием «Дополнительная File_Cell культуры и трансфекции».
  3. Трансфектировать PMVEC с помощью биосенсора FRET и инкубировать в течение 48 часов при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол трансфекции PMVEC также описан в дополнительном информационном файле под названием «Дополнительные File_Cell культуры и трансфекции».
  4. В день визуализации нагрейте буфер Тирода до 37 °C на водяной бане.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер Тирода состоит из 145 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 10 мМ глюкозы, 1 мМ MgCl2 и 1 мМ CaCl2
  5. Установите крышку, содержащую трансфектные ячейки, в камеру ячеек и закрепите верхнюю часть монтажной прокладкой для предотвращения утечки.
  6. Протрите нижнюю часть крышки с помощью деликатной салфетки, чтобы очистить лишнюю мякоть или прилипчивые ячейки.
  7. Добавьте 800 мкл рабочего буфера и 4 мкл ядерной метки 5 мМ в камеру ячейки и аккуратно помечайте в течение 5–10 секунд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При добавлении буферных или реагентных растворов к покровным слипам, установленным в камере ячеек, обязательно добавляйте раствор осторожно и сбоку от камеры ячеек, чтобы не выбить адгезивные ячейки. Добавление 4 мкл ядерной метки 5 мМ к 800 мкл буфера создает конечную концентрацию ядерной метки 25 мкМ. Для слабо адгезивных клеток, таких как клетки HEK293, сначала смешайте ядерную метку и буфер во флаконе, а затем добавьте к чехлам, установленным в камере клетки. Это предотвратит подъем клеток с крышки.
  8. Накройте камеру ячейки алюминиевой фольгой для защиты от света и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
  9. Подготовка реагента: Добавьте 1 мкл 50 мМ-м раствора в 199 мкл буфера. Это даст конечную концентрацию форсколина 50 мкМ при добавлении к клеткам, которые были приготовлены с 800 мкл буфера. 1 мкл ДМСО в 199 мкл буфера также должен быть подготовлен для использования в качестве органов управления транспортным средством.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этих исследованиях форсколин используется в качестве активатора аденилилциклазы для стимуляции производства цАМФ. При желании данная методика может быть легко модифицирована, чтобы позволить лечение альтернативными реагентами для стимуляции или ингибирования аденилциклазы, фосфодиэстераз и т.д.

2. Получение изображений

  1. Используйте конфокальный микроскоп, оснащенный спектральным детектором.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы получения изображений, описанные здесь, были разработаны с использованием коммерчески доступной системы микроскопа Nikon A1R. Эти шаги, возможно, потребуется скорректировать при использовании альтернативного спектрального микроскопа. Убедитесь, что все оборудование включено по крайней мере за 30 минут до начала эксперимента, чтобы достичь стабильных условий эксплуатации.
  2. Выберите цель погружения в воду в 60 раз и добавьте каплю воды к цели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации живых клеток с высоким разрешением рекомендуется использовать объектив с высокой числовой диафрагмой. Пожалуйста, обратитесь к Списку материалов для получения информации о цели, используемой в этих исследованиях.
  3. Поместите камеру нагруженной ячейки (из шага 1.7) на ступень микроскопа.
  4. Выберите установленный фильтр DFT (DAPI/FITC/TRITC), настроив ручку фильтра на правой стороне микроскопа.
  5. Работа микроскопа в флуоресцентном широкоугольном режиме с помощью окуляров для выбора поля зрения, содержащего клетки, экспрессирующие датчик цАМФ FRET.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что средняя интенсивность сигнала FRET на донорской или акцепторной пиковой длине волны излучения в выбранной ячейке составляет, по меньшей мере, 100 единиц интенсивности (A.U.) или, по меньшей мере, 4X базового сигнала области без экспрессии клеток. Это можно подтвердить с помощью средства просмотра профилей спектра, доступного в программном обеспечении NIS Elements. При поиске ячейки с хорошим сигналом желательно отбросить чрезмерно яркие клетки (они могут быть скомпрометированы).
  6. Откройте программное обеспечение NIS, переключитесь в конфокальный режим, разблокируйте кнопку лазерной блокировки и нажмите на Live.
  7. Используйте ручку фокусировки, чтобы сфокусироваться на ячейках, глядя на предварительный просмотр на экране.
  8. Настройте параметры устройства, сбора и z-стека в программном обеспечении, как описано ниже.
  9. Настройки сбора:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки камеры и устройства могут быть применены с использованием ранее полученного изображения. Откройте изображение, щелкните правой кнопкой мыши и выберите Повторно использовать настройки камеры.
    1. Откройте меню настроек A1, установите флажки, соответствующие лазерным линиям 405 нм и 561 нм, выберите SD для спектрального детектора, выберите 10 для разрешения и 31 для каналов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Меню настроек A1 отображается в виде небольшого значка шестеренки в левом верхнем углу окна настроек A1 Plus. 405 нм лазер используется для возбуждения донора и 561 нм лазер используется для возбуждения ядерной метки.
    2. Установите диапазон длин волн (410 – 730 нм), выбрав начальные и конечные значения длин волн.
    3. Щелкните значок binning/skip в меню настроек A1 и выберите поле с номером 15, затем нажмите кнопку ОК в меню настроек A1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это для удаления канала длины волны, который соответствует лазеру возбуждения 561 нм (обычно это15-й канал длины волны). Важно не использовать эту полосу длин волн, чтобы избежать искусственно заниженного сигнала, который может создать спектральный артефакт. Сигнал ниже в этой полосе из-за механического пальца, который закрывает детекторный элемент, чтобы защитить его от лазерного повреждения.
    4. Установите интенсивность лазера на 8% и 2% для лазеров 405 нм и 561 нм соответственно, Si Hv (усиление детектора) на уровне 149 и радиус точечного отверстия 2,4 воздушных дисковых единиц (AU).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность лазера, возможно, придется регулировать в зависимости от возраста прибора и состояния лазеров. При регулировке интенсивности лазера между различными образцами или экспериментальными группами важно поддерживать одинаковое соотношение интенсивностей лазера (например, 8:2). Кроме того, важно выбрать интенсивность лазера, которая не настолько яркая, чтобы создать быстрое фотоотбеливание. Коэффициент усиления детектора должен быть отрегулирован таким образом, чтобы максимизировать интенсивность сигнала при минимизации шума детектора. Для этих исследований был использован коэффициент усиления в 149. Размер точечного отверстия 2,4 а.е. был выбран в качестве баланса между получением изображений с достаточным отношением сигнал/шум (SNR) и поддержанием оптического сечения (конфокальность). Увеличение размера точечного отверстия увеличивает SNR, но уменьшает конфокальность.
    5. Установите скорость сканирования на 0,25 спектральных кадров в секунду, выберите значок, соответствующий однонаправленному для направления сканирования, введите 4 для счетчика и установите 1024 x 1024 для размера сканирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сигналы FRET слабые, и часто требуется медленная скорость сканирования. При использовании скорости сканирования 0,25 получение спектрального z-стека завершается за ~3 минуты. Скорость сканирования может быть увеличена или уменьшена в зависимости от используемых флуорофоров. Например, для более ярких флуорофоров, таких как eGFP, можно использовать более высокую скорость сканирования (2 кадра в секунду). Число, введенное под счетчиком, соответствует значению усреднения кадра 4, что помогает в снижении шума при получении изображения. Для очень стабильных образцов и там, где время не является ограничением, более высокие значения усреднения (до 16) могут быть использованы для получения изображений с улучшенным SNR.
  10. Определите параметры сбора z-стека:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения, введенные на этапах 2.10, возможно, потребуется скорректировать с учетом изменений в связывании или концентрации флуоресцентных этикеток, типе этикетки, количестве используемых этикеток, клеточной линии и других изменениях в пробоподготовке, которые могут повлиять на плотность маркировки клеток и/или клеточную автофлуоресценцию. При корректировке параметров захвата следует проявлять осторожность для достижения достаточного SNR при минимизации фотоотбеливания. Кроме того, при настройке спектрального анализа FRET следует позаботиться о том, чтобы параметры хорошо работали во всех группах лечения. Желательно провести испытание каждой группы лечения с предложенными настройками параметров, чтобы убедиться, что SNR является достаточным и фотоотбеливание сведено к минимуму.
    1. Откройте окно сбора ND, щелкнув Просмотр → управление получением → сбором ND.
    2. Введите путь/место назначения и имя файла, чтобы сохранить ND-файл во всплывающем окне.
    3. Установите флажок, соответствующий z-серии.
    4. Нажмите на live в окне настроек A1 Plus. Откроется окно просмотра в реальном времени.
    5. Отрегулируйте ручку фокусировки на микроскопе, чтобы выбрать верхнюю часть ячейки, и нажмите кнопку «Сверху» в окне сбора ND, чтобы установить текущее положение в качестве верхней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется фокусироваться немного выше верхней части ячейки, чтобы гарантировать, что вся ячейка отобрана в серии z.
    6. Отрегулируйте ручку фокусировки на микроскопе, чтобы выбрать нижнюю часть ячейки, и нажмите «Снизу» в окне сбора ND, чтобы установить текущую позицию в качестве нижней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сосредоточьтесь немного ниже нижней части ячейки, чтобы убедиться, что вся клетка отобрана.
    7. Введите 1 мкм для размера шага, выберите сверху вниз для направления z-сканирования и нажмите кнопку «Выполнить» в окне ND Acquisition, чтобы получить z-стек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер шага определяет количество z-срезов, которые будут получены в зависимости от верхнего и нижнего расположения (т.е. пройденного расстояния). Размер шага 1 мкм был выбран в качестве компромисса между скоростью изображения, выборкой по оси Z и фотоотбеливанием. Использование конфокального диаметра точечного отверстия 2,4 а.е. и 60-кратного водоиммерного объектива привело к толщине оптического сечения 1,73 мкм. Следовательно, размер шага 1 мкм немного ниже критериев выборки Найквиста, но это компромисс, который был сделан для сокращения времени, необходимого для получения z-стека. Для очень стабильных образцов, для которых скорость не является критической, для увеличения разрешения по оси z может использоваться меньший шаг оси Z и, возможно, меньший диаметр конфокального отверстия. Нижняя часть должна давать аналогичные результаты и может использоваться для оценки любых эффектов фотоотбеливания, которые могут возникнуть во время сканирования z.
  11. Настройте систему идеальной фокусировки (PFS), если она доступна:
    ПРИМЕЧАНИЕ: PFS позволяет системе компенсировать колебания глубины фокуса во время получения изображения. Для настройки PFS могут быть использованы следующие шаги, и эти шаги могут незначительно отличаться в зависимости от версии Nikon A1R и используемой версии NIS Elements.
    1. Выделите симметричный режим, определенный значком диапазона в окне сбора ND.
    2. Включите кнопку PFS на передней панели микроскопа (убедитесь, что дихроичная зеркальная ручка, расположенная на секции под стадией образца, находится «в»).
    3. Переопределите верхнюю часть (повернуть против часовой стрелки) и нижнюю (повернуть по часовой стрелке) с помощью ручки на передней грани контроллера смещения PFS.
    4. Определите относительную z-позицию/z-глубину, щелкнув «относительная» в окне получения ND.
    5. Щелкните память на передней грани микроскопа, чтобы программное обеспечение запомнить относительную z-глубину.
  12. После того, как сбор z-стека будет завершен, аккуратно добавьте желаемый реагент (forskolin или vehicle control) с помощью пипетки и подождите 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте реагент очень осторожно, чтобы не нарушать клетки или не перемещать положение клеточной камеры в пределах стадии XY микроскопа; полезно проверить в последующем просмотре в реальном времени или изображении, что поле зрения не сместилось во время добавления реагента. 10-минутное время ожидания - это время для того, чтобы лечение курсолином вступить в силу. Если используется альтернативное лечение, время ожидания, возможно, потребуется скорректировать.
  13. Через 10 минут измените имя файла и нажмите кнопку Выполнить в окне получения ND.
  14. Повторите этапы 2.11 – 2.13, как описано выше, по меньшей мере для 5 обложек, чтобы получить достаточные результаты для статистического анализа (n = 5 для каждой группы обработки – форсколина и контроля транспортного средства).
  15. Подготовьте образцы и образцы заготовок для построения спектральной библиотеки и получения спектральных изображений с использованием параметров сбора, аналогичных описанным в шагах 2.9 и 2.10.

3. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти изображения будут использоваться для построения спектральной библиотеки, содержащей чистые спектры всех отдельных конечных элементов, присутствующих в исследовании. Конечные элементы в спектральной библиотеке могут варьироваться от исследования к исследованию, если используются разные флуорофоры. Подробная процедура построения спектральной библиотеки приведена в дополнительном информационном файле под названием «Дополнительная File_Spectral библиотека». Здесь мы описываем экспорт данных в файлы .tiff, линейное спектральное размешивание, измерения эффективности FRET, трехмерную реконструкцию и оценку уровней cAMP. Анализ изображений может быть выполнен с использованием различных платформ анализа изображений и программирования, таких как ImageJ, Python, MATLAB или CellProfiler. В этих исследованиях использовались скрипты MATLAB.

  1. Экспорт данных изображения:
    1. Создайте новые папки с тем же именем файла, соответствующим спектральным изображениям z-стека, полученным на шагах 2.13 и 2.14.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги, описанные для экспорта данных, специфичны для NIS Elements AR версии 4.30.01. Эти шаги могут незначительно отличаться в зависимости от версии программного обеспечения.
    2. Щелкните Файл, который откроет окно файла. Найдите и выберите файл спектрального изображения, полученный на шаге 2.12, и нажмите кнопку Открыть.
    3. После загрузки файла щелкните Файл→ Импорт/Экспорт→ Экспорт документа ND.
    4. Во всплывающем окне: найдите и выберите папку, созданную на шаге 3.1.1, выберите Формат изображения с тегами (TIF) для типа файла, затем выберите Моно изображение для каждого канала и Сохранить битовую глубину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Префикс файла будет предварительно сгенерирован; измените это значение для удобства. Порядок индексов будет меняться в зависимости от выбранных каналов и должен отображать "z, c" для индексации в соответствии с местоположением z-среза первым и номером полосы волн второй. Убедитесь, что поля, соответствующие параметрам Применить LUT или Вставить наложения или Использовать имена точек, не выбраны.
    5. Нажмите кнопку Экспорт, чтобы экспортировать файлы tiff в папку назначения в виде отдельных файлов TIFF.
    6. Повторите шаги 3.1.2 – 3.1.5 для экспорта файлов спектральных изображений, полученных на шаге 2.13.
  2. Линейное спектральное размешивание:
    1. Откройте программное обеспечение для программирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Специально разработанный программный скрипт для разминожения необработанных спектральных изображений предоставляется на веб-сайте BioImaging and BioSystems Университета Южной Алабамы во вкладке Ресурсы (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html).
    2. Откройте файл с надписью «Линейное размешивание.m» и нажмите кнопку «Выполнить» на панели инструментов редактора.
    3. Найдите и выберите папку, содержащую экспортированную последовательность файлов *.tif, сгенерированную программным обеспечением NIS Elements.
    4. Нажмите ok, чтобы продолжить, что откроет новое окно под названием Wavelength and Z-Slice.
    5. Скопируйте имя первого файла (без z-slice и номера канала) в папку, выбранную на шаге 3.2.4, и вставьте его в первый шаг диалогового окна с надписью «Введите имя изображения».
    6. Введите количество каналов на втором шаге с надписью «Введите количество полос длин волн», количество z-срезов на третьем шаге с надписью «Введите количество Z-срезов» и нажмите OK.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество полос длин волн может изменяться при внесении изменений в настройки сбора, такие как корректировка диапазона длин волн или размера шага длины волны. Количество Z-срезов также может изменяться в зависимости от высоты ячейки.
    7. Просмотрите и выберите файл длины волны под названием «Wavelength.mat» во всплывающем окне с надписью «Выберите файл информации о длине волны» и нажмите «Открыть».
    8. Найдите и выберите файл «Library.mat» в новом всплывающем окне с надписью «Выберите файл спектральной библиотеки», нажмите «Открыть» и дождитесь завершения размешивания фрагментов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Файл Library.mat представляет собой файл, содержащий чистые спектры для каждого флуорофора концевого элемента вместе с автофлуоресценцией клеток и фоновыми спектральными сигнатурами. В этом случае к флуорофорам эндмембера относятся бирюза, венера и DRAQ5. Фоновые спектральные сигнатуры включают клеточную или матричную автофлуоресценцию, покровную флуоресценцию и покровную дифракцию. Файл Wavelength.mat - это файл, содержащий информацию о канале длин волны, используемую для получения спектрального изображения. Пример файла библиотеки и файла длины волны доступен на веб-сайте Bioimaging and Biosystems (см. примечание к разделу 3.2.1). Для получения дополнительной информации о том, как создавать спектральную библиотеку и файлы длин волн, обратитесь к файлу дополнительной информации под названием «Дополнительная библиотека File_Spectral». Несмешанные изображения, соответствующие каждому z-фрагменту, будут сохранены в папку с именем «Unmixed», созданную в процессе разминирования в папке, выбранной на шаге 3.2.3.
  3. Расчет эффективности FRET:
    1. Откройте сценарий программирования под названием «multiFRRCF.m» и нажмите кнопку «Выполнить».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот файл программирования доступен на веб-сайте Университета Южной Алабамы по биовизуализации и биосистемам (см. примечание к шагу 3.2.1).
    2. Введите количество экспериментальных испытаний для анализа во всплывающем диалоговом окне под названием «Сколько папок следует перелизировать» и нажмите кнопку «ОК».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данные изображений из каждого эксперимента должны быть сохранены в отдельной папке несмешаемых изображений. Этот шаг просто позволяет коду анализа зацикливаться на многих папках в качестве шага экономии времени.
    3. Найдите и выберите несмешанные папки и нажмите кнопку ОК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество раз, когда открывается всплывающее окно «Обзор папки», зависит от числа, введенного в диалоговом окне «Сколько папок для перелицензов» на предыдущем шаге. Найдите и выберите папки одну за другой.
    4. В новом всплывающем окне введите следующую информацию в соответствующие поля: коэффициент масштабирования составляет 12,4, порог 5,6, X, Y и частота Z — 5, 5 и 1 соответственно, а алгоритм сглаживания — гауссовский.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент масштабирования представляет собой значение в пикселях/мкм и будет использоваться для масштабирования выборки в Z-направлении до направления XY. Коэффициент масштабирования получается из размера пикселя изображения, который обычно предоставляется в качестве метаданных в изображении для большинства систем конфокальных микроскопов. Например, если изображение получено с интервалом 0,08 мкм/пиксель, коэффициент масштабирования должен составлять 12,5 пикселя/мкм. Пороговое значение будет использоваться для порогового значения изображений и создания двоичной маски ячейки. Мы создали список оптимальных значений на основе интенсивности донора изображения + акцептора. Используйте 4,5 в качестве порогового значения, если изображение имеет яркую интенсивность донор+акцептор и низкий фон, значение от 5,6 до 6,5 для изображений с умеренной интенсивностью донор+акцептор и/или более высокий фон и значение 7,5 и выше для изображений с интенсивностью донор+акцептор, которая ниже фона. Значение частоты соответствует интервалу, в количестве пикселей, на котором выполняется нарезка на последующих этапах. Например, если Z-глубина ячейки составляет 17 мкм при размере шага 1 мкм и в направлении XY используется коэффициент масштабирования 12,5 пикселей/мкм, то глубина набора данных 3-мерного изображения будет ресамплитирована на 212 пикселей (направление Z). На основе введенного значения частоты Z (например, 1 пиксель) набор данных 3-мерного изображения будет повторно разрезан, начиная с верхней части набора данных изображения, а затем с шагом 1 пиксель вниз. В результате получается 212 перерезых изображений. Если бы для частоты Z был введен больший интервал значений частоты, то было бы сгенерировано меньше перерезых изображений. Перерезки изображений сохраняются на последующих этапах.
    5. Нажмите кнопку Выполнить и подождите, пока не будут выполнены все измерения и перелицензирование FRET.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В родительском каталоге создается отдельная папка, в которую сохраняются релистрированные изображения эффективности FRET в оттенках серого и цветные (примененная цветовая карта) изображения эффективности FRET. Например, все изображения FRET в градациях серого и цветовой карты, перекрашенные в направлении X (плоскость YZ), сохраняются в папку под названием «Resliced_XFRET».
    6. Повторите анализ с аналогичными настройками для всех экспериментов – до и после обработки курсфорсколина и управления транспортным средством.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги, упомянутые в разделе 3.3, описывают значения, вводимые для пользовательского программного скрипта анализа FRET для генерации 3-мерных данных изображения FRET. Однако этот скрипт выполняет несколько операций во время выполнения, в том числе: загрузка данных изображения, создание стеков изображений, сглаживание, расчеты эффективности FRET, создание и применение маски границы ячейки, 3-мерная реконструкция изображения, перерезка 3-мерных изображений через заданные интервалы (частоты), применение цветовой карты для визуализации изменений FRET и сохранение перерезых данных изображения в том же каталоге. Дополнительные сведения были включены в качестве комментариев в сценарий программы.

4. Сопоставление эффективности ЛАД с уровнями цАМФ

  1. Откройте файл программирования с именем 'Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m' и нажмите кнопку «Запустить» в главном окне.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Файл доступен на веб-сайте BioImaging and BioSystems (см. примечание к разделу 3.2.1). Этот файл считывает изображения эффективности FRET в градациях серого и преобразует их в уровни cAMP на основе характеристической кривой. Эта характеристическая кривая использует отношение цАМФ-к-ФРЕТ, задокументировано в литературе15,36, которое описывается уравнением Хилла (третье уравнение, показанное ниже). Однако Kd зонда в неповрежденных ячейках трудно оценить, и мы предположили, что он составляет 1 мкМ в наших расчетах. Следовательно, результаты показаны как функция Kd. (т.е. [цАМФ] = x* Kd). Уравнения, используемые для измерения эффективности FRET и сопоставления FRET с уровнями cAMP, показаны ниже:
    Equation 1
    Где E — эффективность FRET, а кажущаяся иd-явная — несмешанные интенсивности пикселей акцепторных и донорских изображений соответственно.
    Qa и Qd являются квантовыми выходами акцептора и донора. Обратите внимание, что Qa и Qd отменяются, когда уравнение для kλ включено в уравнение эффективности FRET, kλ является поправочный коэффициент:
    Equation 2
    Equation 3 и Equation 4 являются коэффициентами вымирания донора и акцептора на длине волны возбуждения донора, i (405 нм).
    Equation 5
    E — эффективность ФРЕТа, а KD = константа диссоциации = 1 мкМ.
  2. Найдите и выберите первое изображение FRET в области оттенка серого (сохраненное на шаге 3.3.5) и нажмите кнопку ОК.
  3. Откройте изображения FRET/cAMP, чтобы проверить распределение сигналов cAMP в трех измерениях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот протокол описывает использование гиперспектральных подходов к визуализации и анализу FRET для измерения градиентов цАМФ в трех пространственных измерениях в живых клетках. Существует несколько ключевых шагов, связанных с получением этих результатов, для которых требуется тщательное внимание при анализе и количественной оценке данных. Эти ключевые шаги включают в себя построение соответствующей спектральной библиотеки, фоновое спектральное размешивание, пороговое значение для идентификации границ ячеек и расчеты эффективности FRET. Рисунок 1 иллюстрирует схематический поток всех этапов, участвующих в измерении эффективности FRET и уровней цАМФ в живых клетках. При правильном выполнении эти этапы визуализации и анализа позволят измерить эффективность FRET и оценить пространственные градиенты цАМФ в 3 измерениях в ячейке, учитывая при этом неоднородные фоновые сигналы.

На рисунке 2 показаны 3-мерные виды ложноцветных необработанных гиперспектральных данных изображения, полученных с помощью конфокального микроскопа Nikon A1R в исходных условиях(рисунок 2A)и через 10 минут после(рисунок 2B)лечения курсколином. Обратите внимание, что аналогичные параметры детектора и системы использовались для получения стеков изображений до и после обработки для поддержания согласованности для количественного анализа. Также обратите внимание, что изменения в FRET не очевидны на этом изображении, так как это чисто визуализация необработанных данных, перед расчетом эффективности FRET.

Спектральная библиотека с чистыми спектрами всех конечных элементов необходима для дальнейшего анализа необработанных данных спектральных изображений. Создание соответствующей спектральной библиотеки является одним из ключевых шагов для обеспечения соответствующих измерений эффективности FRET. На рисунке 3 показано построение спектральной библиотеки, содержащей чистые спектры конечных элементов (в этих текущих исследованиях конечными мачками являются бирюза, Венера и DRAQ5). Для измерения эффективности FRET важно получить спектры бирюзы и Венеры с использованием образца со стехиометрией 1:1. Здесь мы представили подход, при котором акцепторный флуорофор полностью фотоструктурируется, что позволяет получить спектральные сигнатуры донора и акцептора со стехиометрией1:1 (рисунок 3A-F). Кроме того, линейные степенные соотношения между лазерами(дополнительный рисунок 1)были применены для расчета спектра акцептора с интенсивностью, которую можно было бы ожидать, если бы он был возбужден с использованием донорского лазера возбуждения, в данном случае 405 нм для бирюзы(рисунок 3G). Это гарантирует, что несмешанные сигналы донора и акцептора сопоставимы по абсолютной интенсивности при возбуждении FRET с помощью одной лазерной линии 405 нм. Неперетефированные клетки, помеченные ядерным красителем DRAQ5(рисунок 3H),использовались для получения чистого спектра DRAQ5(рисунок 3I). Объединив спектры донора, бирюзового(рисунок 3F),акцептора, Венеры(рисунок 3G)и DRAQ5(рисунок 3I),была создана 3-компонентная библиотека(рисунок 3J).

Сигналы от источников, отличных от флуоресцентных этикеток, также могут присутствовать в образце. Чтобы объяснить это, три различные спектральные сигнатуры с пиками, которые происходят при 424 нм, 504 нм и 574 нм, были идентифицированы в немаркированных клеточных образцах. Мы считаем, что эти спектральные сигнатуры соответствуют отражению покрова и клеточной матрице или клеточной автофлуоресценции. На рисунке 4 показаны источники этих трех фоновых спектральных сигнатур. Важно отметить, что эти сигналы распределены неравномерно внутри выборки и, следовательно, не могут быть просто вычтены. Однако добавление спектральных сигнатур этих сигналов в спектральную библиотеку и использование линейного размешивания для разделения сигналов представляет собой подход к удалению этих смешанных сигналов от сигналов донора и акцептора до расчета эффективности FRET. Для достижения этой цели три фоновые спектральные сигнатуры были добавлены в 3-компонентную спектральную библиотеку, сформировав новую 6-компонентную библиотеку, состоящую из донорской (бирюзовой), акцепторной (Венера), DRAQ5 и трех фоновых спектральных сигнатур.

Был написан пользовательский сценарий программирования для разминожения данных спектрального изображения в отдельные конечные части, и был написан отдельный сценарий для выполнения последующих расчетов эффективности FRET. Линейное спектральное размешивание (проиллюстрировано на рисунке 5)выполняли с использованием 6-компонентной спектральной библиотеки. Размешивание выполняли для каждого среза в осевом стеке изображений, также называемом z-стеком (см. 3-мерную визуализацию необработанных данных спектрального изображения на рисунке 5А). Это привело к отдельным несмешанным изображениям для каждого конечного мембера, для каждого z-среза в z-стеке(рисунок 5C–E,фоновые несмешанные изображения не показаны). При желании несмешанные сигналы могут быть ложно окрашены для визуализации с различным цветом, назначенным каждому несмешанным сигналу(рисунок 5F-H).

На рисунке 6 показаны этапы расчетов эффективности ФРТ, а также этапы сопоставления эффективности ФРТ с уровнями цАМФ. Изображение эффективности FRET было сгенерировано с использованием сглаженных несмешаемых изображений донора и акцептора. Изображение двоичной маски было получено с использованием несмешаемых донорских, акцепторных и ядерных изображений. Маска была применена к изображению эффективности FRET для удаления вкладов из пикселей за пределами ячейки. Хотя несмешанные изображения из одиночных z-срезов использовались для иллюстрированной демонстрации измерений эффективности FRET, эти расчеты выполнялись на каждом срезе в 3-мерном стеке изображений. Затем набор данных 3-мерного изображения FRET был перестроен в три ортогональные плоскости для визуализации пространственных градиентов сигналов цАМФ в разных направлениях.

Визуализация вызванных агонистами изменений эффективности FRET и уровней цАМФ
Описанные выше этапы обеспечивают метод расчета эффективности FRET и уровней цАМФ на емпле гиперспектральных данных изображения в трех пространственных измерениях. Эти этапы могут быть применены к клеточным препаратам до и после лечения соединениями, которые вызывают реакцию цАМФ, такими как форсколин. Здесь мы приводим пример использования этого подхода для наблюдения за изменениями в распределении FRET и цАМФ в PMVEC после обработки 50 мкМ форсколина. Рисунок 7 иллюстрирует изменения эффективности FRET и уровней цАМФ в различных плоских срезах XY (z-срезы), от апикальных до базальных, что позволяет сравнивать исходные условия (до лечения курсолином) и 10-минутную постобработку. В этом иллюстративном примере эффективность ФРТ снижалась (колонки 1 и 3 на рисунке 7)при обработке форсколином, что коррелировало с повышением уровней цАМФ (колонки 2 и 4 на рисунке 7). Наблюдалось минимальное пространственное изменение цАМФ в пределах одной плоскости XY. Однако наблюдались осевые (от апикально-базальных) пространственные градиенты цАМФ, что можно предположить, отметив, что апикальный срез имеет более глубокий красный цвет (указывающий на более высокие уровни цАМФ через таблицу поиска цвета, которая была применена), чем базальный срез после обработки форсколина (колонка 4 на рисунке 7). Осевые распределения FRET или cAMP часто могут быть лучше визуализированы с использованием изображений, полученных из двух ортогональных пространственных плоскостей: на рисунке 8 изображена эффективность FRET и уровни cAMP в плоскости YZ на исходном уровне (столбцы 1 и 2) и через 10 минут после обработки форсколина (столбцы 3 и 4), в то время как на дополнительном рисунке 2 показаны изменения эффективности FRET и уровня цАМФ в плоскости XZ. Эти результаты демонстрируют возможность измерения FRET и оценки уровней цАМФ на основе 3-мерных гиперспектральных данных изображения, а также демонстрируют важность визуализации осевого распределения FRET или cAMP. Хотя это выходит за рамки данной методологической работы, возможно, что осевые пространственные распределения циклических нуклеотидов способствуют специфичности в циклических нуклеотидных сигнальных путях.

При выполнении методов, описанных выше, важно тщательно проверять точность шагов и запускать соответствующие экспериментальные и транспортные средства управления, чтобы убедиться, что изменения в FRET (и соответствующем цАМФ) обусловлены фактическими изменениями в сигналах донора и акцептора и не являются артефактами визуализации. Например, важные шаги, которые следует рассмотреть, включают:

Использование соответствующей спектральной библиотеки, содержащей все необходимые спектральные компоненты
Как уже упоминалось, может быть значительный вклад фоновых сигналов от клеточной автофлуоресценции, осажденной матрицы или отраженного света от покровного листа (возбуждение-излучение, пропускающее кровь). На рисунке 9 представлен пример набора данных, иллюстрирующий, что фоновый сигнал сохранялся в изображениях, когда для разминирования спектральных данных использовалась 3-компонентная библиотека (Turquoise, Venus и DRAQ5). Напротив, фоновый сигнал был эффективно удален при использовании более полной (и подходящей) 6-компонентной спектральной библиотеки.

Использование оптимального порогового значения для создания маски ячейки
Во многих экспериментах, которые мы проводили, интенсивность фонового сигнала составляет примерно 50-60% от интенсивности сигнала FRET, которая присутствует в необработанных данных спектрального изображения (т. Е. При визуализации необработанных данных спектрального изображения пик сигнала FRET всего в 2 раза выше, чем у окружающего фонового сигнала). Таким образом, отделение фонового сигнала от сигнала переднего плана с использованием порогового значения для получения двоичной маски является чувствительным шагом и должно быть тщательно выполнено во избежание анализа артефактов. На рисунке 10 показано влияние различных пороговых значений, применяемых для сегментации ячейки для создания двоичной маски ячейки. Низкое пороговое значение может включать фоновый сигнал как часть экспрессивной ячейки. С другой стороны, чрезмерно высокое пороговое значение может препятствовать измерению FRET в низко экспрессивных клетках или областях клетки с низким донорским + акцепторным сигналом (либо очень тонкие части клетки, либо части, которые могут иметь более низкую региональную концентрацию зонда FRET).

Выбор трансфекто инфицированной клетки с интенсивностью сигнала донор+акцептор ≥ фонового сигнала
На рисунке 11 показан пример набора данных, в котором эффективность FRET и соответствующие уровни измерялись на основе несмешанных изображений, полученных с использованием 6-компонентной спектральной библиотеки для линейного спектрального размешивания. Несмотря на использование 6-компонентной библиотеки для разминения данных спектральных изображений и выбор высокого порога для создания границы ячейки и ядерной маски, изображения эффективности FRET по-прежнему были склонны к высокому фоновому шумовому сигналу вблизи базальной стороны ячейки. При этом наличие фонового шума было обусловлено выделением ячейки, которая лишь слабо экспрессировала зонд FRET, а уровень сигнала донор+акцептор был примерно равен силе фонового сигнала даже после размешивания. Таким образом, в дополнение к применению сложных этапов анализа, описанных выше, также важно выбрать ячейку с достаточной экспрессией зонда FRET и, соответственно, достаточным сигналом FRET (донорский и акцепторный сигналы, по крайней мере, равным или превышающим шумовой сигнал) во время захвата, чтобы обеспечить высококачественные результаты.

Figure 1
Рисунок 1: Блок-схема, изображающая этапы, участвующие в измерениях эффективности и уровня FRET в трех пространственных измерениях с использованием гиперспектральной визуализации и анализа FRET. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: 3-мерная визуализация клетки, экспрессиирающей репортер цАМФ FRET (зеленый) и ядра из клетки и окружающих невыражающих клеток (красный). Необработанные данные спектрального изображения, полученные с помощью спектрального конфокального микроскопа Nikon A1R, были ложно окрашены в соответствии с длиной волны и визуализированы в 3 измерениях с использованием программного обеспечения NIS Elements. А) 3-мерные данные изображения на исходном уровне и В) через 10 минут после лечения 50 мкМ курсолина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Построение спектральной библиотеки, содержащей чистые спектры флуоресцентных меток в исследовании (называемых полем дистанционного зондирования конечными устройствами). А) Ложное цветное изображение клеток, экспрессирующих биосенсор FRET, приобретенных при возбуждении 405 нм (возбуждении донора). B) Спектр, соответствующий сигналу FRET: 4 различные области интереса (ROI) были нарисованы на изображении A, показанном красным, желтым, синим и зеленым прямоугольниками. Была экспортирована средняя интенсивность на каждой длине волны для каждой выбранной окупаемой окупаемости инвестиций. Средняя интенсивность этих 4 ROI была построена на каждой длине волны излучения. Пики излучения спектра соответствуют как донорским (бирюзовым), так и акцепторным (Венера) флуорофорам. В) Ложное цветное изображение клеток, экспрессирующих биосенсор FRET, полученное при возбуждении 488 нм (акцепторное возбуждение). D) Средний спектр был оценен, как объясняется в B, из нескольких ROI в C (те же регионы, что и в A) с пиком излучения, обусловленным только акцептором. Д) Ложное цветное изображение клеток, экспрессирующих биосенсор FRET, полученное при возбуждении 405 нм после фоторазрушения акцепторного флуорофора облучением 514 нм. F) Средний спектр был оценен, как объясняется в B, из нескольких ROI в E (те же регионы, что и A), причем пик выбросов был обусловлен только донором. Обратите внимание, что интенсивность донора увеличивается в F по сравнению с исходным сигналом FRET, что указывает на то, что после фотоотбеливания акцептора возбуждение донора приводит к прямому излучению донора. G) Акцепторный спектр, как и следовало ожидать, если бы он был получен с использованием возбуждения 405 нм. Это было оценено с использованием фактов, что лазеры возбуждения 405 нм и 488 нм имеют линейный отклик, который можно охарактеризовать с помощью спектрометра и интегрировающей сферы(дополнительный рисунок 1)и коэффициента вымирания Венеры, зависящего от длины волны. Следовательно, спектр Венеры, полученный при возбуждении 488 нм, может быть преобразован в спектр Венеры, что можно было бы ожидать, если бы он был получен при возбуждении 405 нм H) Ложное изображение клеток, помеченных ядерной меткой DRAQ5. I) Средний спектр из нескольких областей, представляющих интерес в H. J) Результирующая спектральная библиотека, содержащая нормализованные чистые спектры донора и DRAQ5 и спектр акцептора с коррекцией длины волны возбуждения. Обратите внимание, что спектры Бирюзы и Венеры были нормализованы до максимального значения комбинированных спектральных данных Бирюзы + Венеры, в то время как DRAQ5 был просто нормализован до единицы при значении пиковой длины волны излучения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Фоновые спектральные сигнатуры были идентифицированы и включены в спектральную библиотеку для учета фоновых флуоресцентных сигналов во время процесса размешивания. A, B) При характеристике образца заготовки (непомеченного покровного листа) наблюдались две фоновые флуоресцентные спектральные сигнатуры. Эти спектральные сигнатуры были названы на основе их пиковых длин волн — одна при 424 нм (от флуоресценции покрова), а другая при 504 нм (вероятно, от отражения или обратного рассеяния). C) Третья фоновая спектральная сигнатура наблюдалась с пиковой длиной волны излучения 574 нм, когда анализировались немаркированные клетки, потенциально от клеточной автофлуоресценции или флуоресценции базовой матрицы. D) Фоновые спектры, извлеченные из изображений A, B и C. Эти три фоновых спектра были добавлены в существующую 3-компонентную библиотеку(рисунок 3J)для разработки 6-компонентной спектральной библиотеки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Линейное спектральное размешивание с использованием 6-компонентной спектральной библиотеки, которая учитывает фоновые сигналы. A) Необработанные данные спектрального изображения, полученные в виде осевого z-стека. Б) 6-компонентная спектральная библиотека, используемая для линейного разменьшенного необработанных спектральных данных. C, D и E) Несмешанные изображения DRAQ5, Бирюзы и Венеры в масштабах шкалы грея соответственно получены в результате линейного спектрального размешивания. F, G и H) Ложные цветные несмешанные изображения DRAQ5, Бирюзы и Венеры соответственно. Также были рассчитаны несмешанные изображения фоновых сигналов (данные здесь не показаны, так как для этой методологии представляют интерес только флуоресцентные метки – см. Фиг.4 в Annamdevula, et al. для примеров несмешанных фоновых сигналов25). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Блок-схема, изображающая этапы, участвующие в вычислении уровней FRET и cAMP на только на скошенных данных спектрального изображения. А) Репрезентативное несмешанный образ донора, Бирюзовый. Б) Репрезентативное несмешанный образ акцептора, Венеры. C) Репрезентативное несмешанные изображения ядер, DRAQ5. D) Двоичная маска клетки генерируется путем порогового значения несмешаемого донора + акцептора суммарного изображения. Д) Порог применяется к ядерному изображению для создания бинарной маски ядра. F) Эффективность FRET с точки зрения пикселей была рассчитана по несмешанным изображениям донора и акцептора. G) Из границы ячейки и ядерных масок была создана составная двоичная маска. H) Замаскированное изображение эффективности FRET: композитная маска клетки была применена к изображению эффективности FRET для исключения неспецифических сигналов FRET вне клетки и внутри ядра. I) Цветовая карта была применена к маскированной изображению эффективности FRET для лучшей визуализации пространственных изменений в FRET. J) Изображение уровней цАМФ, которое было оценено по изображению эффективности FRET. K) Цветовая карта была применена для лучшей визуализации пространственных изменений в цАМФ. Цветовые панели, показанные на правой стороне, использовались для визуализации эффективности FRET (верхняя панель) и уровней cAMP (нижняя панель). Изображения, показанные на этом рисунке, представляют один единственный осевой z-срез, но операция анализа, описанная на этом рисунке, выполняется на всем осевом z-стеке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Эффективность ФРЕТа, индуцированная Форсколином, и пространственные градиенты цАМФ, визуализированные в PMVEC. Изображения плоскости XY были получены путем перерезки 3-мерных реконструированных данных изображения FRET и cAMP в осевом (Z) направлении от апикальной к базальной стороне ячейки. Показаны пять смежных фрагментов XY. Колонки 1 и 3 представляют эффективность FRET на исходном уровне и через 10 минут после обработки 50 мкМ-форсколина, соответственно. Колонки 2 и 4 указывают уровни на исходном уровне и через 10 минут после лечения курсолином. Цветовые панели использовались для связи изменений в цветовой карте с эффективностью FRET (сверху) и уровнями cAMP (внизу). Белые линии, показанные на изображениях в колонке 2 и колонке 4, используются для создания профиля интенсивности (профиля сканирования линии) сигналов цАМФ через эту выбранную линию. График профиля интенсивности, полученный из среднего среза ячейки на исходном уровне (синий профиль) и после обработки форсколина (зеленый профиль), демонстрирует пространственное распределение сигналов цАМФ по линии сканирования. Шкала указывает на 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Эффективность ФРЕТа, индуцированная Форсколином, и пространственные градиенты цАМФ, визуализированные в осевом направлении. Плоские изображения YZ были сгенерированы путем перерезки 3-мерных реконструированных данных изображения FRET и cAMP в боковом (X) направлении (слева на правую сторону ячейки). Колонки 1 и 3 представляют эффективность FRET на исходном уровне и через 10 минут после лечения 50 мкМ курсолина, соответственно. Колонки 2 и 4 представляют уровни цАМФ на исходном уровне и через 10 минут после лечения курсолином. Цветовые панели справа использовались для связи изменений в цветовой карте с эффективностью FRET (вверху) и уровнями cAMP (внизу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Сравнение эффективности использования 3-компонентной или 6-компонентной спектральной библиотеки для расчета изображений уровней FRET и cAMP. Неспецифические фоновые сигналы наблюдались на изображениях, рассчитанных с использованием 3-компонентной библиотеки, которая не учитывала фоновые спектральные сигнатуры. Это было особенно верно для изображений вблизи базальной стороны клетки после лечения 50 мкМ курсолином (колонка 2). Напротив, артефакты фонового сигнала были эффективно удалены при использовании 6-компонентной библиотеки, которая включала фоновые спектральные сигнатуры, улучшая способность сегментировать ячейку и анализировать сигналы FRET и cAMP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 10
Рисунок 10: Артефакты анализа изображений могут быть введены, если не выбрано соответствующее пороговое значение для очерчиния границ ячейки и ядра. Для создания маски с тремя различными пороговыми значениями использовались несмешанные изображения донора и акцептора: 0,35 (столбцы 1 как 2), 0,65 (столбцы 3 и 4) и 0,9 (столбцы 5 и 6). В столбцах 1, 3 и 5 показана эффективность FRET на исходном уровне. Колонки 2, 4 и 6 показывают эффективность FRET через 10 минут после лечения 50 мкМ курсолина. Выбор слишком низкого порога приводил к тому, что части фона или внеклеточной области включались в ячейку для анализа, в то время как выбор слишком высокого порога приводил к потере части ячейки (см. апикальный срез в столбцах 4-5 по сравнению со столбцами 3-4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 11
Рисунок 11: Артефакты фонового сигнала могут сохраняться даже после разминания фона и выбора соответствующего порога при создании двоичной маски. В колонке 1 показаны репрезентативные апикальные, средние и базальные срезы на исходном уровне, а в колонке 2 показаны те же самые через 10 минут после обработки 50 мкМ форсколина. Несмотря на использование 6-компонентной библиотеки для размешивания, которая учитывала фоновые сигналы, и использование более высокого порога 0,85 для генерации двоичных масок, фоновые области все еще были идентифицированы как часть клетки, особенно после лечения форсколином. Если это происходит, возможным объяснением может быть то, что для визуализации была выбрана клетка со слабой экспрессией репортера FRET. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Измерения интенсивности лазерной линии в функции настройки лазера в программном обеспечении. Волоконно-связанный спектрометр и интегрируемая сфера были откалиброваны в прослеживаемую NIST лампу для измерения интенсивности лазера как для лазерной линии 405 нм, так и для лазерной линии 488 нм. А) Общее количество фотонов, измеренных на стадии микроскопа, соответствующее различным интенсивностям лазера 405 нм. Б) Общее количество фотонов, измеренных на ступени микроскопа, соответствующее различной интенсивности лазера 488 нм. Линейный отклик в интенсивности лазера наблюдался для обоих лазеров, измеренных на стадии микроскопа. Линейная линия тренда была подогнать, и уравнение линии тренда для каждой лазерной линии использовалось для расчета спектра акцептора, который можно было бы ожидать при возбуждении лазерной линией 405 нм (донорское возбуждение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.

Дополнительный рисунок 2: Эффективность FRET, индуцированная Форсколином, и пространственные градиенты цАМФ, визуализированные в осевом направлении. Изображения плоскости XZ генерировались путем перерезки 3-мерных реконструированных данных изображения FRET и cAMP в боковом (Y) направлении (от передней к задней части ячейки). Колонки 1 и 3 представляют эффективность FRET на исходном уровне и через 10 минут после лечения 50 мкМ курсолина, соответственно. Колонки 2 и 4 представляют уровни цАМФ на исходном уровне и через 10 минут после лечения курсолином. Цветовые полосы справа использовались для связи изменений в цветовой карте с эффективностью FRET (вверху) и уровнями cAMP (внизу). Подобно результатам, показанным для плоскостей YZ(рисунок 8),апикальные и базальные пространственные градиенты эффективности FRET и уровней цАМФ могут быть визуализированы как изменения цвета сверху вниз одного среза YZ, как в исходных условиях (любой заданный срез в столбцах 1-2), так и после обработки 50 мкМ forskolin (столбцы 3-4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.

Дополнительные файлы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти файлы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Разработка биосенсоров FRET позволила измерять и визуализировать циклические нуклеотидные сигналы в отдельных клетках, и существует большая перспектива для визуализации субклеточных сигнальных событий13,22,37,38. Однако использование биосенсоров FRET имеет несколько ограничений, включая низкие характеристики сигнал-шум многих флуоресцентных репортеров FRET на основе белка и слабую эффективность трансфекции или экспрессии репортеров FRET (это может быть особенно сложно в некоторых клеточных линиях, таких как PMVEC)23,24. Визуализация слабо выраженных флуоресцентных белков в сочетании с ратиометрическими расчетами FRET часто приводит к высокой степени неопределенности или флуктуации расчетной эффективности FRET. Стремясь повысить надежность измерений FRET, мы и другие ранее продемонстрировали использование гиперспектральной визуализации и анализа для измерения сигналов FRET и уменьшения перекрестных помех или кровотечения через флуоресцентные сигналы между флуоресцентными метками и эффектами автофлуоресценции26,31,32,39. Из-за ограничений в силе сигнала эти спектральные исследования FRET были ограничены двумя (X и Y) пространственными измерениями до самого недавнего времени. Следовательно, они обеспечили односрезовый вид изменений FRET в клетке.

В недавних исследованиях мы отметили, что FRET (и соответствующие уровни цАМФ), по-видимому, пространственно распределены не только в плоскости XY, но и по плоскостям XZ и YZ25. Описанный здесь гиперспектральный подход к визуализации FRET расширяет нашу способность визуализировать и измерять изменения FRET и циклических нуклеотидов (cAMP) в трех пространственных измерениях, открывая новые возможности для оценки компартментализации сигнала. Этот 4-мерный (X, Y, Z и λ) гиперспектральный подход к визуализации и анализу позволяет измерять и визуализировать градиенты цАМФ в трех пространственных измерениях с учетом неоднородных фоновых сигналов. Здесь мы продемонстрировали, как реализовать этот подход на примере пространственных градиентов цАМФ, индуцированных forskolin. В данных изображения после обработки пространственные градиенты цАМФ можно наблюдать от апикальной до базальной стороны ячейки(рис. 7 и рисунок 8). ЦАМФ, полученный при лечении форсколином, по-видимому, не достигал клеточно-клеточных соединений(рисунок 7 и рисунок 8).

При использовании методологии, описанной здесь, было важно учитывать различные источники фоновых и автофлуоресцентных сигналов, чтобы можно было точно оценить эффективность FRET. Линейное размешивание обеспечивает потенциальный путь для учета уникальных фоновых спектров, если их сигнатуры отличаются от флуоресцентных зондов, представляющих интерес. В частности, линейное размешивание лучше подходит для разделения фоновых и автофлуоресцентных сигналов, чем стандартное фоновое вычитание. 40,41,42 В примере, показанном здесь, были измерены три различные спектральные сигнатуры и им было присвоено имя, основанное на длине волны пикового излучения сигнатуры: фоновый спектр 424 нм (возможно, от флуоресценции покровного листа), фоновый спектр 504 нм (вероятно, из-за отраженного или обратно рассеянного света) и фоновый спектр 574 нм (возможно, из-за автофлуоресценции ячейки или клеточной матрицы). Чтобы проиллюстрировать последствия неспособности учесть эти сигнатуры, были созданы две спектральные библиотеки и сопоставлены несмешанные изображения. Во-первых, была создана спектральная библиотека, содержащая только флуоресцентные метки в образце, Turquoise, Venus и DRAQ5, и помечена 3-компонентной библиотекой. Во-вторых, была создана спектральная библиотека, которая дополнительно содержала три фоновые спектральные сигнатуры и помечена 6-компонентной библиотекой. Как показано выше, разминание с 6-компонентной библиотекой (background unmixing) позволяло удалять фоновые сигналы, тогда как разминание с 3-компонентной библиотекой этого не делало(рисунок 9). В предыдущей работе мы показали, что среднеквадратичная ошибка (RMSE), связанная с линейным размешиванием, уменьшается при использовании спектральной библиотеки, которая учитывает как флуоресцентные метки, так и фоновые сигнатуры. Следует отметить, что осевое распределение фоновой флуоресценции часто неравномерно и, следовательно, простое вычитание фона не будет работать для коррекции данных изображения. Таким образом, спектральный подход к размешиванием необходим для обеспечения точного удаления фона и надежных измерений FRET.

Важно оптимизировать параметры системы, чтобы выбрать наилучшие настройки системы и камеры при получении спектральных изображений. Общая цель должна заключаться в оптимизации SNR при минимизации времени сбора и предотвращении фотоотбеливания. 43 Таким образом, при оптимизации системы визуализации часто требуется компромисс между пространственным, временным и спектральным разрешениями. В этих исследованиях были выбраны оптимальные значения для настроек системы и камеры, включая размер точечного отверстия, мощность лазера, скорость сканирования, размер сканирования и усреднение кадра, как описано в разделе протокола. Используя эти настройки, пространственная выборка 80 нм / пиксель, временная выборка ~ 3 минуты на спектральный z-стек (~ 10 секунд / изображение XY) и спектральная выборка с интервалом 10 нм достигается с незначительным или минимальным фотоотбеливанием.

Чтобы обеспечить точные оценки эффективности FRET, необходимо измерить донорский и акцепторный спектры, как это можно было бы ожидать со стехиометрией 1:1 и идентичными длинами волн возбуждения(рисунок 3). Бирюзовый и Венеринский спектры были нормализованы относительно длины волны бирюзового пикового излучения. Эффективность FRET, которая была оценена с использованием этой спектральной библиотеки, дала значения, аналогичные тем, о которых сообщалось влитературе12,22. Как правило, спектры конечных элементов в библиотеке нормализуются до единицы. Однако для точного расчета эффективности FRET акцепторный спектр должен быть приобретен по отношению к донорскому спектру (т.е. при эквимолярной концентрации или стехиометрии 1:1 и со ссылкой на ту же длину волны возбуждения). В дополнение к использованию правильно построенной библиотеки, несколько шагов связаны с соответствующей оценкой эффективности FRET и избеганием артефактов анализа. К ним относятся выбор экспрессирующей ячейки с адекватной интенсивностьюсигнала (рисунок 11),сглаживание несмешаемых изображений перед оценкой эффективности FRET (в этом примере было применено размытие Гаусса), использование соответствующего порогового значения для создания маски(рисунок 10)и оценка поправочного коэффициента с использованием коэффициентов вымирания донора и акцептора (Дополнительная File_Spectral Library). При выполнении этих шагов 3-мерные распределения эффективности FRET и базовых уровней цАМФ могут быть точно визуализированы в отдельных ячейках.

Локализованные сигналы цАМФ были оценены в 2-пространственных измерениях с использованием целевых биосенсоров FRET13,37. Однако нацеливание зондов FRET на конкретные субклеточные компартменты (например, плазматическую мембрану или липидные плоты) обычно приводит к увеличению локальной концентрации зонда. Это может привести к измерению артефактов, введенных из-за межмолекулярного или бимолекулярного FRET. Кроме того, результаты, представленные здесь и в Annamdevula et.al., 2018, Cytometry A25, демонстрируют важность 3-мерных измерений FRET с растворимых или целевых зондов.

Несмотря на важность измерения сигналов цАМФ в трех пространственных измерениях, этот подход также имеет свои ограничения. Наиболее ограничительным ограничением является длительное время сбора данных – примерно 3 минуты на спектральный z-стек. Такая скорость сбора исключает использование этого подхода для обнаружения чего-либо, кроме квази-устойчивых распределений цАМФ в клетках. Тем не менее, представленные результаты демонстрируют важность включения квази-стационарных 3-мерных (x, y, z) измерений цАМФ в качестве критических дополнений к стандартным 2-мерным (x, y) измерениям. В будущем будет интересно включить меченые белки и клеточные структуры в экспериментальный дизайн. Тщательный выбор флуорофоров, используемых для маркировки белков (и/или структур), позволит оценить 3-мерное распределение меченых белков и FRET без дополнительной потери скорости приобретения. Это, в свою очередь, позволит измерять локализованные сигналы цАМФ и сигналы цАМФ вблизи меченых белков в трех пространственных измерениях, тем самым предлагая важное экспериментальное дополнение к целевым цАМФ-зондам и еще больше расширяя полезность гиперспектральных измерений 3-мерных распределений цАМФ в живых клетках.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Доктора Ливсли и Рич раскрывают финансовую заинтересованность в начинаючей компании SpectraCyte, LLC, которая была создана для коммерциализации технологий спектральной визуализации. Однако все процедуры, описанные в этом протоколе, проводились с использованием коммерчески доступных продуктов, не связанных с SpectraCyte, LLC.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Кейса Джалинка (Нидерландский институт рака и Центр передовой микроскопии ван Левенгука, Амстердам, Нидерланды) за предоставление нам биосенсора H188 cAMP FRET и Кенни Тринха (Инженерный колледж Университета Южной Алабамы) за техническую помощь в сокращении времени, занимаемого для запуска наших специально разработанных программных сценариев.

Авторы хотели бы отметить источники финансирования: Американская кардиологическая ассоциация (16PRE27130004), Национальный научный фонд; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attofluor Cell Chamber Invitrogen A7816 Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution Thermo Scientific 62252 Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F6178 Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin Sigma F3917 Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink Gift Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J image.net Free download Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural Invitrogen 23017-015 Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit Invitrogen L3000-015 Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB Mathworks R2019a Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope Nikon Instruments Nikon A1R Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Software dongle used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama Isolated from Rat pulmonary microvasculature PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides Clay Adams 3010 Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media Invitrogen P36961 If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056 Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer Made in-house Made in-house Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate Corning 3506 Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips Fisher Scientific 12545102 Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 water immersion and commonly used objective for cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
  2. Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
  3. Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
  4. Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
  5. Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
  6. Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
  7. Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
  8. Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
  9. Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
  10. Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
  11. Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
  12. Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
  13. Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
  14. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
  15. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science's STKE. 2006, (2006).
  16. Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
  17. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
  18. Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
  19. Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
  20. Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
  21. Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
  22. Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
  23. Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
  24. Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
  25. Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  26. Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
  27. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
  28. Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
  29. Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
  30. Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
  31. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
  32. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
  33. Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
  34. Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
  35. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
  36. Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
  37. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
  38. Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
  39. Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
  40. Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
  41. Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
  42. West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
  43. Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).

Tags

Биология Выпуск 164 Циклический АМФ пространственный FRET гиперспектральный микроскопия спектральный FRET
Измерение 3-мерных распределений цАМФ в живых клетках с использованием 4-мерной (x, y, z и λ) гиперспектральной визуализации и анализа FRET
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, … More

Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, H., Griswold, J. R., Britain, A. L., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and λ) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis. J. Vis. Exp. (164), e61720, doi:10.3791/61720 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter