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Biology

Medição de distribuições 3-dimensionales cAMP em células vivas usando imagens e análises hiperespectrais de FRET 4-Dimensional (x, y, z e λ) Hiperespectrais

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61720
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

Summary

Devido à relação sinal-ruído inerente (SNR) de sensores baseados em transferência de energia de ressonância (FRET) Fӧrster, a medição dos sinais cAMP tem sido desafiadora, especialmente em três dimensões espaciais. Aqui, descrevemos uma metodologia hiperespectral de imagem e análise de FRET que permite a medição da distribuição cAMP em três dimensões espaciais.

Abstract

O AMP cíclico é um segundo mensageiro que está envolvido em uma ampla gama de atividades celulares e fisiológicas. Vários estudos sugerem que os sinais de cAMP são compartimentados, e que a compartimentação contribui para a sinalização da especificidade dentro da via de sinalização cAMP. O desenvolvimento de biosensores baseados em transferência de energia de ressonância Fӧrster (FRET) promoveram a capacidade de medir e visualizar sinais cAMP nas células. No entanto, essas medidas são muitas vezes limitadas a duas dimensões espaciais, o que pode resultar em má interpretação dos dados. Até o momento, houve apenas medições muito limitadas de sinais cAMP em três dimensões espaciais (x, y e z), devido às limitações técnicas no uso de sensores FRET que inerentemente exibem baixa relação sinal/ruído (SNR). Além disso, as abordagens tradicionais de imagem baseadas em filtros são muitas vezes ineficazes para a medição precisa de sinais cAMP em regiões subcelulares localizadas devido a uma série de fatores, incluindo crosstalk espectral, força limitada do sinal e autofluorescência. Para superar essas limitações e permitir que os biosensores baseados em FRET sejam usados com fluoroforos múltiplos, desenvolvemos abordagens hiperespectrais de imagem e análise de FRET que fornecem especificidade espectral para calcular a eficiência do FRET e a capacidade de separar espectralmente os sinais FRET de confundir autofluorescência e/ou sinais de rótulos fluorescentes adicionais. Aqui, apresentamos a metodologia de implementação de imagens FRET hiperespectrais, bem como a necessidade de construir uma biblioteca espectral apropriada que não seja subamostra nem supersamplada para realizar descomprturações espectrais. Enquanto apresentamos essa metodologia para medição de distribuições tridimensionais de cAMP em células endoteliais microvasculares pulmonares (PMVECs), essa metodologia poderia ser usada para estudar distribuições espaciais de cAMP em uma gama de tipos celulares.

Introduction

Monofosfato de adenosina cíclica (cAMP) é um segundo mensageiro envolvido em processos celulares e fisiológicos chave, incluindo divisão celular, influxo de cálcio, transcrição genética e transdução de sinais. Um conjunto crescente de evidências sugere a existência de compartimentos cAMP na célula através dos quais a especificidade de sinalização é alcançada1,2,3,4,5,6,7. Até recentemente, a compartimentação cAMP era inferida com base em efeitos fisiológicos ou celulares distintos induzidos por diferentes agonistas receptores acopladosG 8,9,10,11. Mais recentemente, as sondas de imagem de fluorescência baseadas em FRET forneceram novas abordagens para a medição direta e observação de sinais cAMP em uma célula12,13,14.

A transferência de energia de ressonância förster (FRET) é um fenômeno físico no qual ocorre a transferência de energia entre moléculas doadoras e aceitadoras de forma não radiativa quando as moléculas estão próximas15,16. Com o desenvolvimento de indicadores fluorescentes baseados em FRET, esse fenômeno físico tem sido utilizado em aplicações biológicas para estudar interações proteína-proteína17, co-localização proteica18, Ca+2 sinalizando19, expressão genética20,divisão celular21 e sinalização nucleotídea cíclica. Os indicadores cAMP baseados em FRET normalmente consistem em um domínio de vinculação cAMP, um fluoróforo doador e um fluoróforoaceitor 22. Por exemplo, o sensor H188 cAMP12,22 utilizado nesta metodologia consiste em um domínio de ligação cAMP obtido da Epac, sanduíche entre fluoroforos turquesa (doador) e Vênus (aceitador). Em condições basais (sem entrada), Turquesa e Vênus estão em uma orientação de tal forma que o FRET ocorre entre os fluoroforos. Ao vincular o cAMP ao domínio de ligação, ocorre uma alteração conformacional de tal forma que Turquesa e Vênus se afastam, resultando em uma diminuição do FRET.

As abordagens de imagem baseadas em FRET oferecem uma ferramenta promissora para investigar e visualizar sinais cAMP dentro de uma célula. No entanto, as técnicas atuais de imagem microscópica baseadas em FRET são muitas vezes apenas parcialmente bem sucedidas em alcançar força de sinal suficiente para medir o FRET com clareza espacial subcelular. Isso se deve a vários fatores, incluindo a intensidade limitada do sinal de muitos repórteres da FRET, o alto nível de precisão necessário para quantificar com precisão as mudanças na eficiência do FRET e a presença de fatores de confusão, como a autofluorescência celular23,24. O resultado é muitas vezes uma imagem FRET que é atormentada por SNR fraco, tornando muito difícil a visualização de mudanças subcelulares no FRET. Além disso, a investigação de sinais cAMP espacialmente localizados tem sido realizada quase exclusivamente em apenas duas dimensões espaciais e a distribuição axial cAMP raramente foi considerada25. Isso é provável porque o SNR baixo impediu a capacidade de medir e visualizar gradientes cAMP em três dimensões espaciais. Para superar as limitações do uso de sensores FRET com baixo SNR, implementamos abordagens hiperespectrais de imagem e análise para medir o FRET em células únicas25,26,27.

Abordagens de imagem hiperespectral foram desenvolvidas pela NASA para diferenciar objetos terrestres presentes em imagens de satélite28,29. Essas técnicas foram traduzidas para o campo de microscopia de fluorescência30,com vários sistemas comerciais de microscópio confocal oferecendo detectores espectrais. Em imagens tradicionais (não espectrais) de fluorescência, a amostra é animada usando um filtro de passe de banda ou uma linha laser, e a emissão é coletada usando um segundo filtro de passe de banda, muitas vezes selecionado para corresponder ao comprimento de onda de emissão máxima do fluoróforo(s). Em contrapartida, as abordagens de imagem hiperespectral buscam amostrar um perfil espectral completo da emissão de fluorescência26,31,32 ou excitação33,34 em intervalos específicos de comprimento de onda. Em nossos estudos anteriores, mostramos que as abordagens de imagem e análise hiperespectral podem oferecer uma quantificação melhorada dos sinais DE TRAC nas células quando comparadas às técnicas tradicionais de imagem FRET baseadas emfiltros 26. Aqui, apresentamos uma metodologia para a realização de imagens e análises hiperespectrais de FRET hiperdimensionais (x, y, z e λ) para medir e visualizar distribuições cAMP em três dimensões espaciais. Essas abordagens permitiram a visualização de gradientes espaciais cAMP induzidos por agonista em célulasúnicas 25. Curiosamente, dependendo do agonista, gradientes cAMP podem ser aparentes nas células. A metodologia aqui apresentada utiliza o descompreamento espectral de fundo não uniforme e autofluorescência celular para melhorar a precisão das medições de FRET. Embora essa metodologia seja demonstrada em células endoteliais microvasculares pulmonares (PMVECs) utilizando um biosensor CAMP FRET, a metodologia poderia ser facilmente modificada para uso com repórteres fret alternativos ou linhas celulares alternativas.

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Protocol

Este protocolo segue os procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Sul do Alabama.

1. Preparação de células, amostras e reagentes para imagem

  1. Isolar as células endoteliais microvasculares pulmonares de ratos (PMVECs) como descrito anteriormente35.
    NOTA: As células foram isoladas e cultivadas pelo Núcleo de Cultura Celular da Universidade do Sul do Alabama, Mobile, AL em pratos de cultura celular de 100 mm.
  2. As sementes isolaram os PMVECs em tampas de vidro redondo de 25 mm e as deixam crescer na incubadora a 37 °C até que as células atinjam pelo menos 80% de confluência (pelo menos 24 horas).
    NOTA: Células e tipo celular podem variar de estudo para estudo e, portanto, procedimentos de cultura celular específicos para células devem ser seguidos para sementes e células de cultivo. O protocolo de semeadura e cultivo de células utilizado nesses estudos está disponível como informação suplementar no arquivo denominado "Cultura e Transfecção File_Cell Suplementar".
  3. Transfect PMVECs com um biosensor FRET e incubar por 48 horas a 37 °C.
    NOTA: O protocolo para transfeccionar PMVECs também é descrito no arquivo de informações suplementares chamado "Cultura e Transfecção File_Cell Suplementar".
  4. No dia da imagem, aqueça o tampão de Tyrode a 37 °C em um banho de água.
    NOTA: O buffer de Tyrode é composto por 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM De Glicose, 1 mM MgCl2 e 1 mM CaCl2
  5. Monte um deslizamento contendo células transfeinadas em uma câmara celular e proteja a parte superior com uma junta de montagem para evitar vazamentos.
  6. Limpe a parte inferior da tampa usando uma limpeza de tarefa delicada para limpar qualquer excesso de mídia ou células aderentes.
  7. Adicione 800 μL de tampão de trabalho e 4 μL de etiqueta nuclear de 5 mM à câmara celular e abale suavemente por 5 a 10 segundos.
    NOTA: Ao adicionar soluções de tampão ou reagente a deslizamentos montados na câmara celular, certifique-se de adicionar a solução suavemente e ao lado da câmara celular para não desalojar células aderentes. Adicionar 4 μL de 5 mM de etiqueta nuclear a 800 μL de buffer faz 25 μM de concentração final de rótulo nuclear. Para células frouxamente aderentes, como células HEK293, misture o rótulo nuclear e o buffer em um frasco primeiro e, em seguida, adicione a tampas montadas na câmara celular. Isso evitará tirar as células da tampa.
  8. Cubra a câmara celular com papel alumínio para proteger da luz e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente.
  9. Preparação do reagente: Adicione 1 μL de 50 mM forskolin a 199 μL de tampão. Isso produzirá uma concentração final de forskolin de 50 μM quando adicionado às células que foram preparadas com 800 μL de tampão. 1 μL de DMSO em 199 μL de buffer também deve ser preparado para ser usado como controle de veículo.
    NOTA: Nestes estudos, a forskolina é usada como ativadora de cyclase adenylyl para estimular a produção de cAMP. Se desejar, essa metodologia pode ser facilmente modificada para permitir o tratamento com reagentes alternativos para estimular ou inibir cíclase adenilyl, fosfodiesterases, etc.

2. Aquisição de imagens

  1. Use um microscópio confocal equipado com um detector espectral.
    NOTA: Todas as etapas de aquisição de imagem descritas aqui foram desenvolvidas usando um sistema de microscópio Nikon A1R disponível comercialmente. Essas etapas podem precisar ser ajustadas se usar um microscópio espectral alternativo. Certifique-se de que todos os equipamentos estão ligados pelo menos 30 minutos antes do início do experimento, de modo a atingir condições de funcionamento estáveis.
  2. Selecione o objetivo de imersão em água de 60x e adicione uma gota de água ao objetivo.
    NOTA: Para imagens de células vivas de alta resolução, recomenda-se usar um objetivo de abertura numérica elevada. Consulte a Lista de Materiais para obter informações sobre o objetivo utilizado nestes estudos.
  3. Coloque a câmara celular carregada (a partir da etapa 1.7) no estágio do microscópio.
  4. Selecione o conjunto de filtro DFT (DAPI/FITC/TRITC) afinando o botão do filtro no lado direito do microscópio.
  5. Opere o microscópio no modo widefield de fluorescência usando as oculares para selecionar um campo de visão contendo células expressando o sensor CAMP FRET.
    NOTA: Certifique-se de que a intensidade média do sinal FRET no comprimento de onda de pico de emissão do doador ou aceitador na célula selecionada é de pelo menos 100 unidades de intensidade (A.U.) ou pelo menos 4X o sinal de linha de base de uma região sem células expressas. Isso pode ser confirmado usando o visualizador de perfil de espectro disponível no software NIS Elements. Ao procurar uma célula com bom sinal, é aconselhável descartar células excessivamente brilhantes (elas podem estar comprometidas).
  6. Abra o software NIS, mude para o modo confocal, desbloqueie o botão de intertravamento a laser e clique em Live.
  7. Use o botão de foco para se concentrar nas células olhando para a visualização na tela.
  8. Configure as configurações do dispositivo, aquisição e pilha de z no software, conforme descrito abaixo.
  9. Configurações de aquisição:
    NOTA: As configurações de aquisição de câmeras e dispositivos podem ser aplicadas usando uma imagem adquirida anteriormente. Abra a imagem, clique com o botão direito do mouse e selecione ReuseAr configurações da câmera.
    1. Abra o menu de configurações do A1, verifique as caixas correspondentes a linhas laser de 405 nm e 561 nm, selecione SD para detector espectral, selecione 10 para resolução e 31 para canais.
      NOTA: O menu de configurações do A1 é mostrado como um pequeno ícone de engrenagem no canto superior esquerdo da janela Configurações A1 Plus. Laser de 405 nm é usado para excitação de doadores e laser de 561 nm é usado para excitação de rótulo nuclear.
    2. Defina a faixa de comprimento de onda (410 – 730 nm) selecionando valores de comprimento de onda de início e fim.
    3. Clique no ícone binning/skip no menu configurações A1 e selecione a caixa numerada 15 e clique em OK no menu de configurações A1.
      NOTA: Isto é para remover o canal de comprimento de onda que corresponde ao laser de excitação de 561 nm (este é tipicamente o canal de comprimento deonda de 15º). É importante não usar essa faixa de comprimento de onda para evitar um sinal artificialmente baixo, que pode criar um artefato espectral. O sinal é menor nesta banda por causa do dedo mecânico que cobre o elemento detector para protegê-lo de danos a laser.
    4. Defina as intensidades de laser para 8% e 2% para os lasers de 405 nm e 561 nm, respectivamente, Si Hv (ganho de detector) em 149, e um raio de 2,4 unidades de disco arejado (UA).
      NOTA: As intensidades do laser podem ter que ser ajustadas dependendo da idade do instrumento e da condição dos lasers. Se ajustar as intensidades do laser entre diferentes amostras ou grupos experimentais, é importante manter a mesma proporção de intensidades de laser (por exemplo, 8:2). Além disso, é importante selecionar uma intensidade laser que não seja tão brilhante a ponto de criar fotobleaching rápido. O ganho do detector deve ser ajustado para maximizar a intensidade do sinal, minimizando o ruído do detector. Para esses estudos, foi utilizado um ganho de 149. Um tamanho de pinhole de 2,4 UA foi selecionado como um equilíbrio entre a aquisição de imagens com relação sinal-ruído suficiente (SNR) e a manutenção da secção óptica (confocalidade). Um aumento no tamanho do pinhole aumenta o SNR, mas diminui a confocalidade.
    5. Defina a velocidade de varredura para 0,25 quadros espectrais por segundo, selecione o ícone correspondente à direção de varredura unidirecional, digite 4 para a contagem e defina 1024 x 1024 para o tamanho da varredura.
      NOTA: Os sinais de FRET são fracos e muitas vezes é necessária uma velocidade de varredura lenta. Usando a velocidade de varredura de 0,25, a aquisição de uma pilha z espectral é concluída em ~3 minutos. A velocidade de varredura pode ser aumentada ou diminuída dependendo dos fluoroforos utilizados. Por exemplo, para fluoroforos mais brilhantes como eGFP, pode-se usar uma velocidade de varredura mais rápida (2 quadros/segundo). O número inserido sob contagem corresponde a um valor médio de quadro de 4, o que ajuda na redução de ruído durante a aquisição de imagem. Para amostras muito estáveis e onde o tempo não é uma restrição, valores de média mais elevados (até 16) podem ser usados para obter imagens com SNR melhorado.
  10. Defina parâmetros de aquisição de pilhas z:
    NOTA: Os valores inseridos nas etapas 2.10 podem precisar ser ajustados para acomodar alterações na ligação ou concentração de rótulos fluorescentes, tipo de rótulo, número de rótulos utilizados, linha celular e outras alterações na preparação da amostra que podem afetar a densidade de rotulagem celular e/ou autofluorescência celular. Ao ajustar os parâmetros de aquisição, deve-se tomar cuidado para obter um SNR suficiente, minimizando o fotobleaching. Além disso, ao configurar um ensaio espectral de FRET, deve-se tomar cuidado para garantir que os parâmetros funcionem bem em todos os grupos de tratamento. É aconselhável executar um teste de cada grupo de tratamento com as configurações de parâmetros propostas para garantir que o SNR seja suficiente e que a fotobleaching seja minimizada.
    1. Abra a janela de aquisição da ND clicando em ver → controle de aquisição → aquisição da ND.
    2. Digite o caminho/destino e um nome de arquivo para salvar o arquivo ND na janela pop-up.
    3. Verifique a caixa correspondente à série Z.
    4. Clique ao vivo na janela Configurações A1 Plus. Isso abrirá uma janela de visualização ao vivo.
    5. Ajuste o botão de foco no microscópio para selecionar a parte superior da célula e clique em Topo na janela de aquisição ND para definir a posição atual como a parte superior.
      NOTA: Sugere-se que se concentre ligeiramente acima da parte superior da célula para garantir que toda a célula seja amostrada na série z.
    6. Ajuste o botão de foco no microscópio para selecionar a parte inferior da célula e clique em Inferior na janela de aquisição ND para definir a posição atual como a parte inferior.
      NOTA: Concentre-se ligeiramente abaixo da parte inferior da célula para garantir que toda a célula seja amostrada.
    7. Digite 1 μm para o tamanho da etapa, selecione a parte superior inferior para a direção z-scan e clique em executar na janela ND Acquisition para adquirir uma pilha z.
      NOTA: O tamanho da etapa determina o número de fatias z que serão adquiridas dependendo dos locais superiores e inferiores (ou seja, a distância percorrida). Um tamanho de passo de 1 μm foi selecionado como um compromisso entre velocidade de imagem, amostragem de eixo z e fotobleaching. O uso do diâmetro do orifício confocal de 2,4 UA e o objetivo de imersão de água de 60x resultou em espessura de seção óptica de 1,73 μm. Assim, um tamanho de passo de 1 μm está ligeiramente abaixo dos critérios de amostragem de Nyquist, mas este é um compromisso que foi feito para reduzir o tempo necessário para adquirir uma pilha z. Para amostras muito estáveis, para as quais a velocidade não é crítica, uma etapa menor do eixo Z e possivelmente um diâmetro menor do pinóculo conferiocal podem ser usados para aumentar a resolução do eixo Z. A parte superior deve produzir resultados semelhantes e pode ser usada para avaliar quaisquer efeitos de fotobleaching que possam ocorrer durante a varredura z.
  11. Configure o Sistema de Foco Perfeito (PFS) se disponível:
    NOTA: O PFS permite que o sistema compense flutuações na profundidade focal durante a aquisição de imagens. As etapas a seguir podem ser usadas para configurar pfs, e essas etapas podem variar ligeiramente dependendo da versão do Nikon A1R e da versão dos Elementos NIS usados.
    1. Destaque o modo simétrico definido pelo ícone de alcance na janela de aquisição ND.
    2. Ligue o botão PFS na face frontal do microscópio (certifique-se de que o botão do espelhodicróico localizado na seção abaixo do estágio da amostra esteja 'in').
    3. Redefina a parte superior (gire no sentido anti-horário) e inferior (gire no sentido horário) usando o botão na face frontal do controlador de deslocamento PFS.
    4. Defina uma relativa z-position/z-profundidade clicando em 'relativo' na janela de aquisição ND.
    5. Clique na memória na face frontal do microscópio para que o software memorize a profundidade z relativa.
  12. Depois que a aquisição da pilha z estiver completa, adicione suavemente o reagente desejado (forskolin ou controle do veículo) usando uma pipeta e espere por 10 minutos.
    NOTA: Adicione o reagente muito suavemente para não perturbar as células ou mover a posição da câmara celular dentro do estágio XY do microscópio; é útil verificar em uma visão ou imagem ao vivo subsequente que o campo de visão não mudou durante a adição de reagente. O tempo de espera de 10 minutos é para que o tratamento de forskolin faça efeito. Se um tratamento alternativo for usado, o tempo de espera pode precisar ser ajustado.
  13. Após 10 minutos, altere o nome do arquivo e clique em executar na janela de aquisição ND.
  14. Repetição dos passos 2.11 – 2.13, conforme descrito acima, para pelo menos 5 deslizamentos de cobertura, de modo a obter resultados suficientes para análise estatística (n=5 para cada grupo de tratamento – forskolin e controle do veículo).
  15. Prepare amostras e amostras em branco para construir a biblioteca espectral e adquirir imagens espectrais usando configurações de aquisição semelhantes, conforme descrito nas etapas 2.9 e 2.10.

3. Análise de imagem

NOTA: Essas imagens serão usadas para construir uma biblioteca espectral contendo o espectro puro de todos os membros finais individuais presentes no estudo. Os membros finais na biblioteca espectral podem variar de estudo para estudo se diferentes fluoroforos forem usados. Um procedimento detalhado para construir a biblioteca espectral é fornecido em um arquivo de informações suplementares chamado "Biblioteca de File_Spectral Suplementar". Aqui, descrevemos dados de exportação para .tiff arquivos, descomprência espectral linear, medidas de eficiência de FRET, reconstrução tridimensional e estimativa dos níveis de cAMP. A análise de imagens pode ser realizada usando diferentes plataformas de análise de imagem e programação, como ImageJ, Python, MATLAB ou CellProfiler. Nesses estudos, foram utilizados scripts MATLAB.

  1. Dados de imagem de exportação:
    1. Crie novas pastas com o mesmo nome de arquivo correspondente às imagens espectrais da pilha z adquiridas nas etapas 2.13 e 2.14.
      NOTA: As seguintes etapas descritas para exportar dados são específicas para nis elements ar versão 4.30.01. Essas etapas podem variar ligeiramente dependendo da versão do software.
    2. Clique em Arquivo, que abrirá uma janela de arquivo. Navegue e selecione o arquivo de imagem espectral adquirido na etapa 2.12 e clique em Abrir.
    3. Uma vez que o arquivo seja carregado, clique em Arquivar→ documento ND de importação/exportação→ exportação.
    4. Na janela pop-up: navegue e selecione a pasta criada na etapa 3.1.1, selecione TIF (Tagged Image Format, formato de imagem marcada) para tipo arquivo e selecione imagem Mono para cada canal e Mantenha a profundidade de bits.
      NOTA: O prefixo do arquivo será pré-gerado; alterar esse valor por conveniência. A ordem do Índice mudará dependendo dos canais selecionados e deverá exibir "z, c" para indexação de acordo com o local de z-slice primeiro e o número da banda de comprimento de onda em segundo lugar. Certifique-se de que as caixas correspondentes para aplicar LUTs ou Inserir sobreposições ou nomes de pontos de uso não sejam eleitas.
    5. Clique em Exportar os arquivos de tiff para uma pasta de destino como arquivos de tiff individuais.
    6. Repetir passos 3.1.2 – 3.1.5 para exportar arquivos de imagem espectrais adquiridos na etapa 2.13.
  2. Descomprturação espectral linear:
    1. Abra o software de programação.
      NOTA: O script de programação desenvolvido sob medida para desmixar imagens espectrais brutas é fornecido no site da Universidade do Sul do Alabama BioImaging e BioSystems, sob a guia Recursos (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html).
    2. Abra o arquivo rotulado de "Linear Unmixing.m" e clique no botão executar na barra de ferramentas do editor.
    3. Navegue e selecione a pasta que contém a sequência de arquivos *.tif exportada gerada pelo software NIS Elements.
    4. Clique em OK para continuar, que abrirá uma nova janela chamada Wavelength e Z-Slice.
    5. Copie o nome do arquivo do primeiro arquivo (sem z-slice e número do canal) na pasta selecionada na etapa 3.2.4 e cole-a na primeira etapa da caixa de diálogo rotulada "Enter the Image Name".
    6. Digite o número de canais na segunda etapa intitulada "Digite o número de bandas de comprimento de onda", número de fatias z na terceira etapa rotulada "Digite o número de fatias Z" e clique em OK.
      NOTA: O número de faixas de comprimento de onda pode mudar se forem feitas alterações nas configurações de aquisição, como ajustar a faixa de comprimento de onda ou o tamanho do passo do comprimento de onda. O número de fatias Z também pode mudar dependendo da altura da célula.
    7. Navegue e selecione o arquivo de comprimento de onda chamado "Wavelength.mat" na janela pop-up rotulada "Selecione o arquivo de informações de comprimento de onda" e clique em abrir.
    8. Navegue e selecione o arquivo "Library.mat" na nova janela pop-up rotulada "Selecione o arquivo da biblioteca espectral", clique em abrir e aguarde até que o descompreamento das fatias seja concluído.
      NOTA: O arquivo Library.mat é um arquivo que contém espectros puros para cada fluoróforo de membro final, juntamente com autofluorescência celular e assinaturas espectrais de fundo. Neste caso, os fluoroforos de fim incluem Turquesa, Vênus e DRAQ5. As assinaturas espectrais de fundo incluem autofluorescência celular ou matricial, fluorescência de deslizamento e difração de deslizamento. O arquivo Wavelength.mat é um arquivo que contém informações do canal de comprimento de onda usado para adquirir a imagem espectral. Um arquivo de biblioteca de exemplo e arquivo de comprimento de onda estão disponíveis no site bioimagem e biossistemas (veja a nota em 3.2.1). Para obter mais informações sobre como gerar biblioteca espectral e arquivos de comprimento de onda, consulte o arquivo de informações suplementares chamado "Biblioteca de File_Spectral Suplementar". Imagens não misturadas correspondentes a cada fatia z serão salvas na pasta chamada "Unmixed" criada durante o processo de descomprturação dentro da pasta que foi selecionada na etapa 3.2.3.
  3. Cálculo de eficiência do FRET:
    1. Abra o script de programação chamado "multiFRRCF.m" e clique em executar.
      NOTA: Este arquivo de programação está disponível no site da Universidade do Sul do Alabama Bioimagem e Biossistemas (ver nota abaixo do passo 3.2.1).
    2. Digite o número de ensaios experimentais para analisar na caixa de diálogo pop-up chamada "quantas pastas para reslice" e clique em OK.
      NOTA: Os dados de imagem de cada experimento devem ser salvos em uma pasta de imagem não misturada separada. Esta etapa simplesmente permite que o código de análise loop sobre muitas pastas como uma etapa de economia de tempo.
    3. Navegue e selecione as pastas não misturadas e clique em OK.
      NOTA: O número de vezes que a janela "Procurar pasta" é aberto depende do número inserido na caixa de diálogo "Quantas pastas para reslice" na etapa anterior. Navegue e selecione as pastas uma após a outra.
    4. Na nova janela pop-up, insira as seguintes informações nas respectivas caixas: o fator de escala é 12.4, limiar é 5.6, X, Y, e Z Frequency são 5, 5 e 1, respectivamente, e o algoritmo de alisamento é gaussiano.
      NOTA: O fator de escala é um valor em pixels/μm e será usado para dimensionar a amostragem de direção Z à da direção XY. O fator de escala é obtido a partir do tamanho do pixel da imagem, que geralmente é fornecido como metadados na imagem para a maioria dos sistemas de microscópio confocal. Por exemplo, se a imagem for adquirida com espaçamento de 0,08 μm/pixel, o fator de escala deve ser de 12,5 pixels/μm. O valor do limiar será usado para limiar das imagens e gerar uma máscara binária da célula. Criamos uma lista de valores ótimos com base na intensidade do doador de imagem+aceitador. Use 4,5 como valor de limiar se a imagem tiver um doador brilhante+intensidade aceitadora e baixo fundo, um valor entre 5,6 a 6,5 para imagens com apenas intensidade moderada de doador+aceitador e/ou fundo superior, e um valor de 7,5 e acima para imagens com intensidade doador+aceitante inferior ao fundo. O valor da frequência corresponde ao intervalo, em número de pixels, no qual o fatiamento é realizado nas etapas subsequentes. Por exemplo, se a profundidade Z da célula for de 17 μm com um tamanho de passo de 1 μm e um fator de escala de 12,5 pixels/μm for usado na direção XY, então a profundidade do conjunto de dados de imagem tridimensional será resamada em 212 pixels (sentido Z). Com base no valor de frequência Z inserido (por exemplo, 1 pixel), o conjunto de dados de imagem tridimensional será re fatiado a partir da parte superior do conjunto de dados de imagem e, em seguida, movendo-se em incrementos de 1 pixel para baixo. Isso resulta em 212 imagens relíquias. Se um intervalo de valor de frequência maior fosse inserido para a Frequência Z, então menos imagens relíquias seriam geradas. As imagens relíquias são salvas em etapas subsequentes.
    5. Clique em executar e esperar até que todas as medidas e relicações do FRET sejam realizadas.
      NOTA: Uma pasta separada é criada dentro do diretório pai para o qual imagens de eficiência FRET em escala de cinza relíquias e imagens coloridas (um colormap aplicado) são salvas imagens de eficiência do FRET. Por exemplo, todas as imagens FRET em escala de cinza e colormap reliced na direção X (plano YZ) são salvas em uma pasta chamada "Resliced_XFRET".
    6. Repita a análise com configurações semelhantes para todos os experimentos – tratamentos antes e depois de forskolin e controles do veículo.
      NOTA: As etapas mencionadas na seção 3.3 descrevem os valores a serem inserindo para o script de programação de análise fret personalizado para gerar dados de imagem FRET tridimensionais. No entanto, este script executa várias operações durante a execução, incluindo: carregando dados de imagem, criando pilhas de imagens, suavização, cálculos de eficiência de FRET, criação e aplicação de uma máscara de borda celular, reconstrução de imagem tridimensional, relicência de imagens tridimensionais em intervalos especificados (frequências), aplicando um colormap para visualizar alterações de FRET e salvar os dados de imagem relíquias para o mesmo diretório. Detalhes adicionais foram incluídos como comentários no roteiro do programa.

4. Mapeando a eficiência do FRET para os níveis de cAMP

  1. Abra o arquivo de programação chamado 'Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m' e clique em executar na janela principal.
    NOTA: O arquivo está disponível no site bioimaging e biosystems (ver nota abaixo de 3.2.1). Este arquivo lê imagens de eficiência FRET em escala de cinza e as converte em níveis cAMP com base em uma curva característica. Esta curva característica usa uma relação cAMP-para-FRET documentada na literatura15,36 que é descrita pela equação de Hill (a terceira equação mostrada abaixo). No entanto, Kd da sonda em células intactas é difícil de estimar e assumimos que era 1 μM em nossos cálculos. Assim, os resultados são mostrados em função de Kd. (i.e., [cAMP] = x* Kd). Equações usadas para medir a eficiência do FRET e mapear os níveis de FRET para cAMP são mostradas abaixo:
    Equation 1
    Onde E é a eficiência FRET, e umaparente e daparente são intensidades de pixels não misturadas de imagens aceitadoras e doadoras, respectivamente.
    Qa e Qd são rendimentos quânticos de aceitador e doador. Note que Qa e Qd cancelam quando a equação para kλ é incorporada na equação de eficiência fret, kλ é um fator de correção:
    Equation 2
    Equation 3 e Equation 4 são coeficientes de extinção de doador e aceitador no comprimento de onda de excitação do doador, i (405nm).
    Equation 5
    E é eficiência FRET e KD = Dissociação constante = 1 μM.
  2. Navegue e selecione a primeira imagem FRET em escala cinza (salva na etapa 3.3.5) e clique em OK.
  3. Abra as imagens FRET/cAMP para inspecionar a distribuição de sinais cAMP em três dimensões.

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Representative Results

Este protocolo descreve o uso de abordagens hiperespectrais de imagem e análise de FRET para medir gradientes cAMP em três dimensões espaciais em células vivas. Existem várias etapas fundamentais envolvidas na geração desses resultados, para as quais é necessária uma atenção cuidadosa ao analisar e quantificar os dados. Essas etapas-chave incluem a construção de uma biblioteca espectral apropriada, descompramento espectral de fundo, limiar para identificar bordas celulares e cálculos de eficiência do FRET. A Figura 1 ilustra o fluxo esquemático de todas as etapas envolvidas na medição da eficiência do FRET e dos níveis de cAMP em células vivas. Quando realizadas corretamente, essas etapas de imagem e análise permitirão a medição da eficiência do FRET e a estimativa de gradientes espaciais cAMP em 3 dimensões em uma célula, ao mesmo tempo em que contabilizam sinais de fundo não uniformes.

A Figura 2 retrata visões tridimensionais de dados de imagem hiperespectral crus de cor falsa adquiridos usando um microscópio confocal Nikon A1R em condições de linha de base(Figura 2A) e 10 minutos depois(Figura 2B) tratamento de forskolin. Observe que parâmetros semelhantes de detector e sistema foram utilizados para adquirir pilhas de imagens antes e depois do tratamento para manter a consistência para análise quantitativa. Observe também que as mudanças no FRET não são óbvias nesta imagem, pois esta é puramente uma visualização de dados brutos, antes de calcular a eficiência do FRET.

Uma biblioteca espectral com espectro puro de todos os membros finais é necessária para analisar ainda mais os dados de imagem espectral brutos. A construção de uma biblioteca espectral apropriada é uma das principais etapas para garantir as medidas adequadas da eficiência do FRET. A Figura 3 demonstra a construção de uma biblioteca espectral contendo o espectro puro dos membros finais (nestes estudos atuais, os membros finais são Turquesa, Vênus e DRAQ5). Para medir a eficiência do FRET, é importante obter os espectros de Turquesa e Vênus usando uma amostra com estequiometria 1:1. Aqui, fornecemos uma abordagem onde o fluorohore aceitor é completamente foto-destruído, permitindo que assinaturas espectrais do doador e aceitador com 1:1 estequiometria sejam obtidas(Figura 3A-F). Além disso, foram aplicadas relações de potência linear entre os lasers(Figura Suplementar 1)para calcular o espectro aceitador com uma intensidade que seria esperada se estivesse animado com o laser de excitação do doador, neste caso 405 nm para Turquesa (Figura 3G). Isso garante que os sinais de doador e aceitação não misturados sejam comparáveis em intensidade absoluta quando o FRET estiver animado com uma única linha laser de 405 nm. Células não transfectadas rotuladas com o corante nuclear, DRAQ5 (Figura 3H) foram utilizadas para obter o espectro puro de DRAQ5 (Figura 3I). Combinando os espectros do doador, Turquesa (Figura 3F), aceitador, Vênus(Figura 3G)e DRAQ5(Figura 3I),foi criada uma biblioteca de 3 componentes(Figura 3J).

Sinais de fontes diferentes dos rótulos fluorescentes também podem estar presentes em uma amostra. Para isso, três diferentes assinaturas espectrais com picos que ocorrem a 424 nm, 504 nm e 574 nm foram identificadas em amostras celulares não rotuladas. Acreditamos que essas assinaturas espectrais correspondem à reflectância de deslizamento e matriz celular ou autofluorescência celular. A Figura 4 retrata as fontes dessas três assinaturas espectrais de fundo. É importante notar que esses sinais são distribuídos não uniformemente dentro da amostra e, portanto, não podem simplesmente ser subtraídos. No entanto, adicionar as assinaturas espectrais desses sinais à biblioteca espectral e usar o descompramento linear para separar os sinais apresenta uma abordagem para remover esses sinais de confusão dos sinais de doador e aceitador antes do cálculo da eficiência do FRET. Para isso, as três assinaturas espectrais de fundo foram adicionadas à biblioteca espectral de 3 componentes, formando uma nova biblioteca de 6 componentes composta por doador (Turquesa), aceitador (Vênus), DRAQ5 e três assinaturas espectrais de fundo.

Um script de programação personalizado foi escrito para desmixar os dados de imagem espectral em membros finais individuais, e um script separado foi escrito para realizar cálculos subsequentes de eficiência do FRET. O desmcompramento espectral linear (ilustrado na Figura 5) foi realizado utilizando-se a biblioteca espectral de 6 componentes. A desmixagem foi realizada para cada fatia na pilha de imagens axiais, também referida como z-stack (refere-se à visualização tridimensional de dados de imagem espectral bruta na Figura 5A). Isso resultou em imagens não misturadas separadas para cada membro final, para cada fatia z na pilha z (Figura 5C-E, imagens não misturadas de fundo não são mostradas). Se desejar, os sinais não misturados podem ser de cor falsa para visualização com uma cor diferente atribuída a cada sinal não misturado(Figura 5F-H).

A Figura 6 ilustra as etapas envolvidas nos cálculos de eficiência do FRET, bem como as etapas para mapear a eficiência do FRET aos níveis de cAMP. Uma imagem de eficiência fret foi gerada usando imagens de doador e aceitador não misturados. Uma imagem de máscara binária foi obtida usando doador, aceitador e imagens nucleares não misturadas. A máscara foi aplicada à imagem de eficiência do FRET para remover contribuições de pixels fora da célula. Embora imagens não misturadas de fatias z únicas tenham sido usadas para a demonstração pictórica de medidas de eficiência do FRET, esses cálculos foram realizados em cada fatia dentro da pilha de imagens tridimensionais. O conjunto de dados de imagem FRET tridimensional foi então relicado em três planos ortogonais para visualizar gradientes espaciais de sinais cAMP em diferentes direções.

Visualizando alterações induzidas por agonistas na eficiência do FRET e nos níveis de cAMP
As etapas descritas acima fornecem um método para calcular a eficiência do FRET e os níveis de cAMP a partir de dados de imagem hiperespectral em três dimensões espaciais. Essas etapas podem ser aplicadas às preparações celulares antes e depois do tratamento com compostos que provocam uma resposta cAMP, como forskolin. Aqui, fornecemos um exemplo de uso dessa abordagem para observar alterações na distribuição de FRET e cAMP em PMVECs após o tratamento com forskolin de 50 μM. A Figura 7 ilustra as mudanças na eficiência do FRET e nos níveis de cAMP em diferentes fatias de plano XY (fatias de z), de apical a basal, permitindo a comparação das condições da linha de base (antes do tratamento de forskolin) e 10 minutos pós-tratamento. Neste exemplo ilustrativo, a eficiência do FRET diminuiu (colunas 1 e 3 na Figura 7) em relação ao tratamento de forskolin, correlacionando-se a um aumento nos níveis de cAMP (colunas 2 e 4 na Figura 7). Observou-se variação espacial mínima de cAMP dentro de um único plano XY. No entanto, foram observados gradientes espaciais axiais (apical-a-basal) cAMP, como se pode supor, observando que a fatia apical tem uma cor vermelha mais profunda (indicando níveis mais altos de cAMP através da tabela de pesquisa de cores que foi aplicada) do que a fatia basal após o tratamento de forskolin (coluna 4 na Figura 7). As distribuições Axial FRET ou cAMP podem muitas vezes ser melhor visualizadas usando imagens obtidas dos dois planos espaciais ortogonais: A Figura 8 retrata a eficiência do FRET e os níveis de cAMP no plano YZ na linha de base (colunas 1 e 2) e 10 minutos após o tratamento de forskolin (colunas 3 e 4), enquanto a Figura Suplementar 2etra que retrata a eficiência do FRET e as alterações de nível de CAMP no plano XZ. Esses resultados demonstram a viabilidade de medir os níveis de FRET e estimar os níveis de CAMP a partir de dados de imagem hiperespectral tridimensional e também demonstram a importância de visualizar distribuições axiais de FRET ou cAMP. Embora além do escopo deste artigo metodológico, pode ser que as distribuições espaciais axiais de nucleotídeos cíclicos contribuam para a especificidade dentro das vias de sinalização nucleotídeos cíclicas.

Ao executar os métodos descritos acima, é importante verificar meticulosamente a precisão das etapas e executar controles experimentais e de veículos adequados para garantir que as alterações no FRET (e cAMP correspondente) sejam devido a mudanças reais nos sinais de doadores e aceitadores e não sejam artefatos de imagem. Por exemplo, passos importantes a considerar incluem:

Usando uma biblioteca espectral apropriada que contém todos os componentes espectrais necessários
Como mencionado, pode haver uma contribuição significativa de sinais de fundo da autofluorescência celular, matriz depositada ou luz refletida do deslizamento de cobertura (sangramento de emissão de excitação). A Figura 9 representa um exemplo de conjunto de dados ilustrando que o sinal de fundo foi retido dentro das imagens quando uma biblioteca de 3 componentes (Turquesa, Vênus e DRAQ5) foi usada para desmutilizar os dados espectrais. Em contraste, o sinal de fundo foi efetivamente removido quando uma biblioteca espectral mais completa (e apropriada) de 6 componentes foi usada.

Usando um valor de limiar ideal para gerar uma máscara celular
Em muitos dos experimentos que realizamos, a intensidade do sinal de fundo é de aproximadamente 50-60% da intensidade do sinal FRET que está presente dentro dos dados de imagem espectral brutos (ou seja, ao visualizar dados de imagem espectral não processados o pico do sinal FRET é apenas ~2X maior do que o do sinal de fundo circundante). Assim, a separação do sinal de fundo do sinal em primeiro plano usando um valor limiar para obter uma máscara binária é um passo sensível e deve ser cuidadosamente realizada para evitar a análise de artefatos. A Figura 10 ilustra o efeito de diferentes valores limiares aplicados para a segmentação celular para criar uma máscara binária da célula. Um valor de limiar baixo pode incluir sinal de fundo como parte da célula expressa. Por outro lado, um valor limiar excessivamente alto pode impedir a medição do FRET em células ou regiões de baixa expressão de uma célula com baixo sinal doador+aceitador (porções muito finas da célula ou porções que podem ter uma menor concentração regional da sonda FRET).

Selecionar uma célula transfeinada com intensidade de sinal doador+acceptor ≥ sinal de fundo
A Figura 11 ilustra um conjunto de dados de exemplo onde a eficiência do FRET e os níveis correspondentes foram medidos a partir de imagens não misturadas obtidas usando uma biblioteca espectral de 6 componentes para descomprência espectral linear. Apesar de usar a biblioteca de 6 componentes para descomprto dados de imagem espectral e selecionar um alto limiar para criar a borda celular e a máscara nuclear, as imagens de eficiência do FRET ainda eram propensas a um sinal de ruído de fundo alto perto do lado basal da célula. Neste caso, a presença de ruído de fundo deveu-se à seleção de uma célula que estava apenas expressando fracamente a sonda FRET, e a força do sinal doador+acceptor foi aproximadamente igual à força do sinal de fundo, mesmo após a desmixagem. Assim, além de aplicar as sofisticadas etapas de análise descritas acima, também é importante selecionar uma célula com expressão suficiente da sonda FRET e sinal FRET correspondentemente suficiente (sinal de doador e aceitador pelo menos igual ou acima do sinal de ruído) durante a aquisição, a fim de garantir resultados de alta qualidade.

Figure 1
Figura 1: Fluxograma representando as etapas envolvidas na eficiência do FRET e medidas de nível em três dimensões espaciais utilizando imagens e análises de FRET hiperespectrais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Uma visualização tridimensional de uma célula expressando o repórter cAMP FRET (verde) e núcleos da célula e células não expressas circundantes (vermelho). Os dados de imagem espectral bruto adquiridos usando um microscópio confocal espectral Nikon A1R foram falsos coloridos de acordo com o comprimento de onda e visualizados em 3 dimensões usando o software NIS Elements. A) Dados de imagem tridimensionais na linha de base e B) 10 minutos após o tratamento de forskolina de 50 μM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Construção de uma biblioteca espectral contendo o espectro puro de rótulos fluorescentes no estudo (referido como membros finais pelo campo de sensoriamento remoto). A) Uma imagem de cor falsa de células expressando o biosensor FRET adquirido a 405 nm excitação (excitação do doador). B) Espectro correspondente ao sinal FRET: 4 regiões diferentes de interesse (ROIs) foram desenhadas na imagem A mostrada por retângulos vermelhos, amarelos, azuis e verdes. Foi exportada intensidade média em cada comprimento de onda para cada ROI selecionado. A intensidade média desses 4 ROIs foi traçada em cada comprimento de onda de emissão. Os picos de emissão do espectro correspondem tanto ao doador (Turquesa) quanto aos fluoroforos que aceitadores (Vênus). C) Uma imagem de cor falsa de células expressando o biosensor FRET adquirido a 488 nm excitação (excitação aceitante). D) O espectro médio foi estimado como explicado em B a partir de vários ROIs em C (as mesmas regiões de A) com pico de emissão devido apenas ao aceitador. E) Uma imagem de cor falsa de células expressando o biosensor FRET adquirido a 405 nm excitação após foto-destruição do fluoróforo aceitor por irradiação de 514 nm. F) O espectro médio foi estimado como explicado em B a partir de vários ROIs em E (as mesmas regiões de A) com pico de emissão devido apenas ao doador. NOTE que a intensidade do doador é aumentada em F quando comparada com a do sinal FRET original, indicando que após o fotobleaching do aceitor, a excitação do doador está levando à emissão direta de doadores. G) O espectro de aceitação como seria esperado se obtido usando excitação de 405 nm. Isso foi estimado utilizando os fatos de que os lasers de excitação de 405 nm e 488 nm têm uma resposta linear que pode ser caracterizada usando um espectrômetro e uma esfera de integração(Figura Suplementar 1) e o coeficiente de extinção dependente do comprimento de onda de Vênus. Assim, o espectro de Vênus obtido a 488 nm de excitação pode ser convertido no espectro de Vênus que seria esperado se obtido a 405 nm excitação H) Uma imagem de cor falsa de células rotuladas com o rótulo nuclear, DRAQ5. I) O espectro médio de várias regiões de interesse em H. J) A biblioteca espectral resultante contendo os espectros puros normalizados do doador e DRAQ5 e o comprimento de onda de excitação do aceitador. Observe que os espectros turquesa e vênus foram normalizados ao valor máximo dos dados espectrais combinados turquesa + Vênus, enquanto o DRAQ5 foi simplesmente normalizado para a unidade ao valor do comprimento de onda de emissão máxima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: As assinaturas espectrais de fundo foram identificadas e incluídas na biblioteca espectral para contabilizar sinais de fluorescência de fundo durante o processo de desmixamento. A, B) Duas assinaturas espectrais de fluorescência de fundo foram observadas ao caracterizar uma amostra em branco (deslizamento não rotulado). Essas assinaturas espectrais foram nomeadas com base em seus comprimentos de onda de pico – um a 424 nm (de fluorescência de deslizamento de cobertura) e o outro a 504 nm (provavelmente por reflectância ou dispersão traseira). C) Observou-se uma terceira assinatura espectral de fundo com um comprimento de onda de emissão máxima de 574 nm quando foram analisadas células não rotuladas, potencialmente a partir de autofluorescência celular ou fluorescência da matriz subjacente. D) Espectros de fundo extraídos das imagens A, B e C. Estes três espectros de fundo foram adicionados à biblioteca de 3 componentes existente (Figura 3J) para desenvolver uma biblioteca espectral de 6 componentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Descompração espectral linear usando uma biblioteca espectral de 6 componentes que contabiliza sinais de fundo. A) Dados de imagem espectral brutos adquiridos como uma pilha z axial. B) Biblioteca espectral de 6 componentes usada para desmixar linearmente dados espectrais brutos. C, D e E) Imagens não misturadas de escala cinza de DRAQ5, Turquesa e Vênus, respectivamente, resultaram de descompração espectral linear. F, G e H) Falsas imagens coloridas não misturadas de DRAQ5, Turquesa e Vênus, respectivamente. Imagens não misturadas de sinais de fundo também foram calculadas (dados não mostrados aqui como apenas os rótulos fluorescentes são de interesse para esta metodologia – referem-se à Figura 4 em Annamdevula, etc. para exemplos de sinais de fundo não misturados25). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Fluxograma representando as etapas envolvidas no cálculo dos níveis de FRET e cAMP a partir de dados de imagem espectral não misturados. A) Imagem representativa descomprida do doador, Turquesa. B) Imagem representativa não misturada do aceitador, Vênus. C) Imagem não misturada representativa dos núcleos, DRAQ5. D) A máscara de célula binária é gerada por limiar de imagem resumida de doador/aceitador não misturada. E) Um limiar é aplicado à imagem nuclear para criar uma máscara binária do núcleo. F) A eficiência do FRET foi calculada a partir de imagens doador e aceitadoras não misturadas. G) Uma máscara binária composta foi criada a partir de fronteiras celulares e máscaras nucleares. H) Imagem de eficiência fret mascarada: máscara celular composta foi aplicada à imagem de eficiência do FRET para excluir sinais fret não específicos fora da célula e dentro do núcleo. I) Um mapa colorido foi aplicado à imagem mascarada de eficiência do FRET para melhor visualizar as mudanças espaciais no FRET. J) A imagem de níveis de cAMP estimada a partir da imagem de eficiência do FRET. K) O Colormap foi aplicado para melhor visualizar as alterações espaciais no cAMP. As barras coloridas mostradas no lado direito foram usadas para visualizar a eficiência do FRET (painel superior) e os níveis cAMP (painel inferior). As imagens mostradas nesta figura são representativas de uma única fatia z axial, mas a operação de análise descrita nesta figura é realizada em toda a pilha z axial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Eficiência fret induzida por forskolina e gradientes espaciais cAMP visualizados em PMVECs. As imagens de plano XY foram geradas pela relicência de dados de imagem de FRET reconstruídos tridimensionais e cAMP na direção axial (Z) do apical para o lado basal da célula. Cinco fatias XY contíguas são mostradas. As colunas 1 e 3 representam a eficiência do FRET na linha de base e 10 minutos após o tratamento com 50 μM forskolin, respectivamente. As colunas 2 e 4 indicam os níveis na linha de base e 10 minutos após o tratamento de forskolin. As barras coloridas foram usadas para relacionar alterações no colormap à eficiência DO FRET (superior) e nos níveis de cAMP (inferior). Linhas brancas mostradas em imagens na coluna 2 e coluna 4 são usadas para gerar o perfil de intensidade (perfil de varredura de linha) dos sinais cAMP nesta linha selecionada. O gráfico de perfil de intensidade obtido a partir da fatia média da célula na linha de base (perfil azul) e após o tratamento de forskolin (perfil verde) demonstra a distribuição espacial dos sinais cAMP em toda a varredura da linha. A barra de escala indica 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Eficiência fret induzida por forskolina e gradientes espaciais cAMP visualizados na direção axial. As imagens do plano YZ foram geradas pela relicação de dados de imagem fret reconstruídos tridimensionais e cAMP na direção lateral (X) (do lado esquerdo para o lado direito da célula). As colunas 1 e 3 representam a eficiência do FRET na linha de base e em 10 minutos após o tratamento de forskolina de 50 μM, respectivamente. As colunas 2 e 4 representam os níveis de cAMP na linha de base e em 10 minutos após o tratamento de forskolin. As barras coloridas à direita foram usadas para relacionar alterações no colormap para os níveis de eficiência FRET (superior) e cAMP (inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Uma comparação da eficácia de utilizar uma biblioteca espectral de 3 componentes ou uma biblioteca espectral de 6 componentes para calcular imagens de níveis de FRET e cAMP. Sinais de fundo não específicos foram observados em imagens calculadas por meio de uma biblioteca de 3 componentes, que não contavam com assinaturas espectrais de fundo. Isso foi especialmente verdadeiro para imagens próximas ao lado basal da célula após 50 μM de tratamento de forskolin (coluna 2). Em contraste, os artefatos de sinal de fundo foram efetivamente removidos ao usar uma biblioteca de 6 componentes que incluía assinaturas espectrais de fundo, melhorando a capacidade de segmentar a célula e analisar sinais FRET e cAMP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10: Artefatos de análise de imagem podem ser introduzidos se um valor de limiar apropriado não for selecionado para delinear as bordas celulares e nucleares. Foram utilizadas imagens de doadores e aceitadores não misturados para criar uma máscara com três valores de limiar diferentes: 0,35 (colunas 1 as 2), 0,65 (colunas 3 e 4) e 0,9 (colunas 5 e 6). As colunas 1, 3 e 5 exibem a eficiência do FRET na linha de base. As colunas 2, 4 e 6 exibem a eficiência do FRET em 10 minutos após o tratamento de forskolina de 50 μM. Selecionar um limiar muito baixo resultou em porções do fundo, ou região extracelular, sendo incluído com a célula para análise, ao mesmo tempo em que a seleção de um limiar muito alto resultou na perda de parte da célula (veja a fatia apical nas colunas 4-5 quando comparada às colunas 3-4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 11
Figura 11: Os artefatos de sinal de fundo ainda podem persistir mesmo após o descompramento de fundo e a seleção de um limiar apropriado durante a criação de uma máscara binária. A coluna 1 mostra fatias representativas apical, média e basal na linha de base e a coluna 2 mostra o mesmo em 10 minutos após o tratamento de forskolin de 50 μM. Apesar de usar uma biblioteca de 6 componentes para desmcomprir que contava com sinais de fundo e utilizar um limiar mais alto de 0,85 para geração de máscaras binárias, as regiões de fundo ainda eram identificadas como sendo parte da célula, especialmente após o tratamento com forskolin. Se isso ocorrer, uma possível explicação pode ser que uma célula com expressão fraca do repórter FRET foi selecionada para imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Medições da intensidade da linha laser em função da configuração a laser no software. Um espectrômetro acoplado de fibra e uma esfera de integração foram calibrados para uma lâmpada rastreável NIST para medir a intensidade do laser tanto para a linha laser de 405 nm quanto para a linha laser de 488 nm. A) Número total de fótons medidos no estágio do microscópio correspondente a diferentes intensidades de laser do laser de 405 nm. B) Número total de fótons medidos no estágio do microscópio correspondente a diferentes intensidades de laser de laser de 488 nm. A resposta linear na intensidade do laser foi observada tanto para os lasers como medidos no estágio do microscópio. Uma linha de tendência linear foi encaixada e a equação de tendência para cada linha laser foi usada para calcular o espectro aceitável que seria esperado se animado com a linha laser de 405nm (excitação do doador). Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 2: Eficiência fret induzida por forskolina e gradientes espaciais cAMP visualizados na direção axial. As imagens do plano XZ foram geradas pela relicação de dados de imagem de FRET reconstruídos tridimensionais e cAMP na direção lateral (Y) (da frente para trás da célula). As colunas 1 e 3 representam a eficiência do FRET na linha de base e em 10 minutos após o tratamento de forskolina de 50 μM, respectivamente. As colunas 2 e 4 representam os níveis de cAMP na linha de base e em 10 minutos após o tratamento de forskolin. As barras de cor à direita foram usadas para relacionar alterações no colormap para os níveis de eficiência FRET (superior) e cAMP (inferior). Semelhante aos resultados mostrados para os planos YZ(Figura 8),gradientes espaciais apical a basais em eficiência FRET e níveis de cAMP podem ser visualizados como mudanças de cor de cima para baixo de uma única fatia YZ, tanto em condições de linha de base (qualquer fatia dada nas colunas 1-2) quanto após 50 μM tratamento de forskolin (colunas 3-4). Clique aqui para baixar este número.

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Discussion

O desenvolvimento de biosensores FRET permitiu a medição e visualização de sinais nucleotídeos cíclicos em células únicas, e há grande promessa de visualização de eventos de sinalização subcelular13,22,37,38. No entanto, o uso de biosensores FRET apresenta várias limitações, incluindo as características de baixo sinal-ruído de muitos repórteres fret à base de proteína fluorescente e a fraca transfecção ou eficiência de expressão dos repórteres da FRET (isso pode ser especialmente desafiador em certas linhas celulares, como PMVECs)23,24. A imagem de proteínas fluorescentes fracamente expressas, combinada com cálculos de FRET ratiométricos, muitas vezes resulta em um alto grau de incerteza ou flutuação na eficiência calculada do FRET. Em um esforço para melhorar a confiabilidade das medições de FRET, nós e outros já demonstramos anteriormente o uso de imagens e análises hiperespectrais para medir sinais de FRET e reduzir o crosstalk ou sangrar através de sinais de fluorescência entre rótulos fluorescentes e efeitos de autofluorescência26,31,32,39. Devido a limitações na força do sinal, esses estudos espectrais de FRET foram limitados a duas dimensões espaciais (X e Y) até muito recentemente. Assim, eles forneceram uma visão de fatia única das alterações de FRET dentro de uma célula.

Em estudos recentes, notamos que os níveis de FRET (e os níveis correspondentes de cAMP) pareciam ser distribuídos espacialmente não apenas no plano XY, mas também nos aviões XZ e YZ25. A abordagem hiperespectral de imagem FRET descrita aqui amplia nossa capacidade de visualizar e medir as alterações de FRET e nucleotídeo ccílico (cAMP) em três dimensões espaciais, abrindo novas possibilidades para avaliar a compartimentação de sinais. Esta abordagem de imagem e análise hiperespectral 4-dimensional (X, Y, Z e λ) permite a medição e visualização de gradientes cAMP em três dimensões espaciais, enquanto contabiliza sinais de fundo não uniformes. Aqui, demonstramos como implementar essa abordagem através do exemplo de gradientes espaciais cAMP induzidos por forskolina. Nos dados de imagem pós-tratamento, os gradientes espaciais cAMP podem ser observados do lado apical ao basal da célula (Figura 7 e Figura 8). O cAMP produzido após o tratamento com forskolin não parecia atingir junções células-células(Figura 7 e Figura 8).

Ao utilizar a metodologia aqui descrita, foi importante explicar diferentes fontes de dados e sinais de autofluorescência para permitir a estimativa precisa da eficiência do FRET. O descompramento linear fornece um caminho potencial para a contabilização de espectros de fundo únicos, se suas assinaturas forem diferentes das sondas fluorescentes de interesse. Em particular, o descompreamento linear é mais adequado para separar sinais de fundo e autofluorescência do que a subtração de fundo padrão. 40,41,42 No exemplo mostrado aqui, três diferentes assinaturas espectrais foram medidas e atribuídas um nome com base no comprimento de onda de emissão máxima da assinatura: o espectro de fundo de 424 nm (possivelmente da fluorescência de deslizamento de cobertura), o espectro de fundo de 504 nm (provavelmente devido à luz refletida ou espalhada por costas) e o espectro de fundo de 574 nm (possivelmente devido à autofluorescência da matriz celular ou celular). Para ilustrar os efeitos de não prestar contas dessas assinaturas, duas bibliotecas espectrais foram criadas e imagens não misturadas foram comparadas. Primeiro, uma biblioteca espectral contendo apenas os rótulos fluorescentes na amostra, Turquesa, Vênus e DRAQ5, foi criada e rotulada como biblioteca de 3 componentes. Em segundo lugar, uma biblioteca espectral que continha adicionalmente as três assinaturas espectrais de fundo foi criada e rotulada como biblioteca de 6 componentes. Como mostrado acima, o descompra com a biblioteca de 6 componentes (descompramento de fundo) permitiu a remoção de sinais de fundo, enquanto o descompramento com a biblioteca de 3 componentes não(Figura 9). Em trabalhos anteriores, mostramos que o erro quadrado médio raiz (RMSE) associado ao descompração linear é diminuído ao usar uma biblioteca espectral que explica tanto os rótulos fluorescentes quanto as assinaturas de fundo. Deve-se notar que a distribuição axial da fluorescência de fundo é muitas vezes não uniforme e, portanto, uma simples subtração de fundo não funcionará para corrigir os dados da imagem. Assim, a abordagem espectral de desmcompra é necessária para fornecer uma remoção precisa de fundo e medições de FRET confiáveis.

É importante otimizar os parâmetros do sistema para selecionar as melhores configurações de sistema e câmera possíveis ao adquirir imagens espectrais. O objetivo geral deve ser otimizar o SNR, minimizando o tempo de aquisição e impedindo o fotobleaching. 43 Assim, ao otimizar um sistema de imagem, muitas vezes é necessário um compromisso entre resoluções espaciais, temporais e espectrais. Nestes estudos, foram selecionados valores ideais para as configurações do sistema e da câmera, incluindo tamanho do pinhole, potência do laser, velocidade de varredura, tamanho da varredura e média de quadros, conforme descrito na seção de protocolo. Utilizando essas configurações, a amostragem espacial de 80 nm/pixel, amostragem temporal de ~3 minutos por z-stack espectral (~10 segundos/imagem XY) e amostragem espectral de intervalo de 10 nm é alcançada com fotobleaching insignificante ou mínimo.

Para garantir estimativas precisas da eficiência do FRET, é necessário medir espectros doadores e aceitadores como seria de esperar com estequiometria 1:1 e comprimentos de onda de excitação idênticos(Figura 3). Os espectros turquesa e vênus foram normalizados em relação ao comprimento de onda de emissão de pico turquesa. A eficiência da FRET estimada por meio desta biblioteca espectral produziu valores semelhantes aos relatados na literatura12,22. Normalmente, os espectros de membros finais na biblioteca são normalizados para a unidade. No entanto, para calcular com precisão a eficiência do FRET, o espectro de aceitação deve ser adquirido com relação ao espectro do doador (ou seja, na concentração equimolar ou 1:1 e referenciado ao mesmo comprimento de onda de excitação). Além do uso de uma biblioteca devidamente construída, várias etapas estão envolvidas na estimativa adequada da eficiência da FRET e na prevenção de artefatos de análise. Estes incluem a seleção de uma célula expressa com intensidade de sinal adequada(Figura 11),suavização de imagens não misturadas antes de estimar a eficiência do FRET (o desfoque gaussiano foi aplicado neste exemplo), utilizando um valor de limiar adequado para criar a máscara (Figura 10), e estimativa de um fator de correção usando coeficientes de extinção de doador e aceitador (Biblioteca de File_Spectral Suplementar). Quando essas etapas são seguidas, as distribuições tridimensionais da eficiência do FRET e dos níveis subjacentes de cAMP podem ser visualizadas com precisão em células únicas.

Os sinais de cAMP localizados foram estimados em dimensões de 2 níveis espaciais usando biosensores FRET13,37. No entanto, direcionar sondas FRET para compartimentos subcelulares específicos (por exemplo, membrana plasmática ou balsas lipídicas) normalmente resulta em uma maior concentração local da sonda. Isso pode resultar em artefatos de medição introduzidos devido ao FRET intermolecular ou bimolecular. Além disso, os resultados apresentados aqui e em Annamdevula et.al., 2018, Citometria A25 demonstram a importância das medições tridimensionais de FRET de sondas solúveis ou direcionadas.

Apesar da importância de medir os sinais de CAMP em três dimensões espaciais, também há limitações para essa abordagem. A limitação mais restritiva são os longos tempos de aquisição necessários – aproximadamente 3 minutos por pilha z espectral. Esta taxa de aquisição impede o uso desta abordagem para detectar qualquer outra coisa que não seja quase – distribuições cAMP de estado constante em células. Dito isto, os resultados apresentados demonstram a importância de incluir medidas tridimensionais de estado estável (x, y, z) cAMP como complementos críticos às medidas padrão 2-dimensional (x, y). No futuro, será interessante incorporar proteínas rotuladas e estruturas celulares no design experimental. A escolha cuidadosa dos fluoroforos utilizados para rotular proteínas (e/ou estruturas) permitiria avaliar as distribuições tridimensionais das proteínas rotuladas e do FRET sem perda adicional da velocidade de aquisição. Isso, por sua vez, permitiria a medição de sinais cAMP localizados e sinais cAMP próximos às proteínas rotuladas em três dimensões espaciais, oferecendo assim um importante complemento experimental às sondas cAMP direcionadas e expandindo ainda mais a utilidade de medições hiperespectrais de distribuições cAMP tridimensionais em células vivas.

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Disclosures

Os Drs. Leavesley e Rich revelam interesse financeiro em uma empresa iniciante, SpectraCyte, LLC, que foi formada para comercializar tecnologias de imagem espectral. No entanto, todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados utilizando produtos comercialmente disponíveis não associados à SpectraCyte, LLC.

Acknowledgments

Os autores gostariam de reconhecer o Dr. Kees Jalink (Instituto de Câncer dos Países Baixos e o Centro de Microscopia Avançada van Leeuwenhoek, Amsterdã, Holanda) por nos fornecer o biosensor H188 cAMP FRET e Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) para ajuda técnica na redução do tempo de tempo que leva para executar nossos scripts de programação desenvolvidos sob medida.

Os autores gostariam de reconhecer as fontes de financiamento: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attofluor Cell Chamber Invitrogen A7816 Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution Thermo Scientific 62252 Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F6178 Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin Sigma F3917 Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink Gift Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J image.net Free download Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural Invitrogen 23017-015 Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit Invitrogen L3000-015 Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB Mathworks R2019a Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope Nikon Instruments Nikon A1R Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Software dongle used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama Isolated from Rat pulmonary microvasculature PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides Clay Adams 3010 Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media Invitrogen P36961 If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056 Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer Made in-house Made in-house Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate Corning 3506 Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips Fisher Scientific 12545102 Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 water immersion and commonly used objective for cells

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References

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Biologia Edição 164 AMP Cíclico espacial FRET hiperespectral microscopia FRET espectral
Medição de distribuições 3-dimensionales cAMP em células vivas usando imagens e análises hiperespectrais de FRET 4-Dimensional (x, y, z e λ) Hiperespectrais
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Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, … More

Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, H., Griswold, J. R., Britain, A. L., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and λ) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis. J. Vis. Exp. (164), e61720, doi:10.3791/61720 (2020).

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