Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Meting van 3-dimensionale cAMP-distributies in levende cellen met behulp van 4-dimensionale (x, y, z en λ) hyperspectrale FRET-beeldvorming en -analyse

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61720
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

Summary

Vanwege de inherente lage signaal-ruisverhouding (SNR) van Fӧrster resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde sensoren, is het meten van cAMP-signalen een uitdaging geweest, vooral in drie ruimtelijke dimensies. Hier beschrijven we een hyperspectrale FRET-beeldvormings- en analysemethodologie die het mogelijk maakt om de cAMP-verdeling in drie ruimtelijke dimensies te meten.

Abstract

Cyclisch AMP is een tweede boodschapper die betrokken is bij een breed scala aan cellulaire en fysiologische activiteiten. Verschillende studies suggereren dat cAMP-signalen gecompartimenteerd zijn en dat compartimentering bijdraagt aan signaleringsspecificiteit binnen de cAMP-signaleringsroute. De ontwikkeling van op Fӧrster resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde biosensoren heeft het vermogen bevorderd om cAMP-signalen in cellen te meten en te visualiseren. Deze metingen zijn echter vaak beperkt tot twee ruimtelijke dimensies, wat kan resulteren in een verkeerde interpretatie van gegevens. Tot op heden zijn er slechts zeer beperkte metingen van cAMP-signalen in drie ruimtelijke dimensies (x, y en z) geweest, vanwege de technische beperkingen bij het gebruik van FRET-sensoren die inherent een lage signaal-ruisverhouding (SNR) vertonen. Bovendien zijn traditionele filtergebaseerde beeldvormingsbenaderingen vaak niet effectief voor nauwkeurige meting van cAMP-signalen in gelokaliseerde subcellulaire gebieden vanwege een reeks factoren, waaronder spectrale overspraak, beperkte signaalsterkte en autofluorescentie. Om deze beperkingen te overwinnen en fret-gebaseerde biosensoren te kunnen gebruiken met meerdere fluoroforen, hebben we hyperspectrale FRET-beeldvormings- en analysebenaderingen ontwikkeld die spectrale specificiteit bieden voor het berekenen van FRET-efficiëntie en de mogelijkheid om FRET-signalen spectraal te scheiden van verstorende autofluorescentie en / of signalen van extra fluorescerende labels. Hier presenteren we de methodologie voor het implementeren van hyperspectrale FRET-beeldvorming, evenals de noodzaak om een geschikte spectrale bibliotheek te construeren die niet ondersampled of oversampled is om spectrale ontmenging uit te voeren. Terwijl we deze methodologie presenteren voor het meten van driedimensionale cAMP-verdelingen in pulmonale microvasculaire endotheelcellen (PMVECs), kan deze methodologie worden gebruikt om ruimtelijke verdelingen van cAMP in een reeks celtypen te bestuderen.

Introduction

Cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) is een tweede boodschapper die betrokken is bij belangrijke cellulaire en fysiologische processen, waaronder celdeling, calciuminstroom, gentranscriptie en signaaltransductie. Een groeiend aantal bewijzen suggereert het bestaan van cAMP-compartimenten in de cel waardoor signaleringsspecificiteit wordt bereikt1,2,3,4,5,6,7. Tot voor kort werd cAMP-compartimentering afgeleid op basis van verschillende fysiologische of cellulaire effecten geïnduceerd door verschillende G-gekoppelde receptoragonisten8,9,10,11. Meer recent hebben fret-gebaseerde fluorescentiebeeldvormingssondes nieuwe benaderingen geboden voor de directe meting en observatie van cAMP-signalen in een cel12,13,14.

Förster resonantie energieoverdracht (FRET) is een fysisch fenomeen waarbij energieoverdracht plaatsvindt tussen donor- en acceptormoleculen op een niet-stralingsve manier wanneer de moleculen zich in de nabijheid bevinden15,16. Met de ontwikkeling van FRET-gebaseerde fluorescerende indicatoren is dit fysische fenomeen gebruikt in biologische toepassingen om eiwit-eiwitinteracties17,eiwitcolokalisatie18,Ca+2-signalering 19,genexpressie20,celdeling21 en cyclische nucleotidesignalering te bestuderen. FRET-gebaseerde cAMP-indicatoren bestaan doorgaans uit een cAMP-bindingsdomein, een donorfluoofoor en een acceptorfluoofoor22. De H188 cAMP-sensor12,22 die in deze methodologie wordt gebruikt, bestaat bijvoorbeeld uit een cAMP-bindingsdomein verkregen van Epac, ingeklemd tussen Turquoise (donor) en Venus (acceptor) fluoroforen. Bij basale omstandigheden (ongebonden) bevinden Turkoois en Venus zich in een zodanige oriëntatie dat FRET optreedt tussen de fluoroforen. Bij binding van cAMP aan het bindingsdomein treedt een conformatieverandering op die zodanig dat Turquoise en Venus uit elkaar bewegen, wat resulteert in een afname van FRET.

FRET-gebaseerde beeldvormingsbenaderingen bieden een veelbelovend hulpmiddel voor het onderzoeken en visualiseren van cAMP-signalen in een cel. De huidige op FRET gebaseerde microscopische beeldvormingstechnieken zijn echter vaak slechts gedeeltelijk succesvol in het bereiken van voldoende signaalsterkte om FRET met subcellulaire ruimtelijke helderheid te meten. Dit komt door verschillende factoren, waaronder de beperkte signaalsterkte van veel FRET-verslaggevers, de hoge mate van precisie die nodig is om veranderingen in FRET-efficiëntie nauwkeurig te kwantificeren en de aanwezigheid van verstorende factoren, zoals cellulaire autofluorescentie23,24. Het resultaat is vaak een FRET-beeld dat wordt geplaagd door zwakke SNR, waardoor visualisatie van subcellulaire veranderingen in FRET erg moeilijk is. Bovendien is onderzoek naar ruimtelijk gelokaliseerde cAMP-signalen bijna uitsluitend uitgevoerd in slechts twee ruimtelijke dimensies en is de axiale cAMP-verdeling zelden beschouwd25. Dit komt waarschijnlijk omdat een lage SNR de mogelijkheid belemmerde om cAMP-gradiënten in drie ruimtelijke dimensies te meten en te visualiseren. Om beperkingen van het gebruik van FRET-sensoren met een lage SNR te overwinnen, hebben we hyperspectrale beeldvormings- en analysebenaderingen geïmplementeerd om FRET in afzonderlijke cellen te meten25,26,27.

Hyperspectrale beeldvormingsbenaderingen werden ontwikkeld door NASA om terrestrische objecten te onderscheiden die aanwezig zijn in satellietbeelden28,29. Deze technieken zijn sindsdien vertaald naar het fluorescentiemicroscopieveld30, met verschillende commerciële confocale microscoopsystemen die spectrale detectoren aanbieden. In traditionele (niet-spectrale) fluorescentiebeeldvorming wordt het monster geëxciteerd met behulp van een banddoorlaatfilter of een laserlijn en wordt de emissie verzameld met behulp van een tweede banddoorlaatfilter, vaak geselecteerd om overeen te komen met de piekemissiegolflengte van de fluorofoor (en). Hyperspectrale beeldvormingsbenaderingen daarentegen proberen een volledig spectraal profiel te bemonsteren van ofwel de fluorescentie-emissie26,31,32 of excitatie33,34 op specifieke golflengte-intervallen. In onze eerdere studies toonden we aan dat hyperspectrale beeldvormings- en analysebenaderingen een verbeterde kwantificering van FRET-signalen in cellen kunnen bieden in vergelijking met traditionele filtergebaseerde FRET-beeldvormingstechnieken26. Hier presenteren we een methodologie voor het uitvoeren van 4-dimensionale (x, y, z en λ) hyperspectrale FRET-beeldvorming en -analyse om cAMP-verdelingen in drie ruimtelijke dimensies te meten en te visualiseren. Deze benaderingen hebben visualisatie van agonist-geïnduceerde cAMP ruimtelijke gradiënten in afzonderlijke cellen mogelijkgemaakt 25. Interessant is dat, afhankelijk van de agonist, cAMP-gradiënten zichtbaar kunnen zijn in cellen. De hier gepresenteerde methodologie maakt gebruik van spectrale ontmenging van niet-uniforme achtergrond en cellulaire autofluorescentie om de nauwkeurigheid van de FRET-metingen te verbeteren. Hoewel deze methodologie wordt gedemonstreerd in pulmonale microvasculaire endotheelcellen (PMVECs) met behulp van een cAMP FRET-biosensor, kan de methodologie gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met alternatieve FRET-reporters of alternatieve cellijnen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit protocol volgt procedures die zijn goedgekeurd door de University of South Alabama Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Voorbereiding van cellen, monsters en reagens voor beeldvorming

  1. Isoleer pulmonale microvasculaire endotheelcellen van ratten (PMVEC's) zoals eerder beschreven35.
    OPMERKING: Cellen werden geïsoleerd en gekweekt door de Cell Culture Core aan de Universiteit van South Alabama, Mobile, AL op 100 mm celkweekschalen.
  2. Zaad geïsoleerde PMVEC's op 25 mm ronde glazen dekplaatjes en laat ze in de incubator groeien bij 37 °C totdat de cellen ten minste 80% confluentie bereiken (ten minste 24 uur).
    OPMERKING: Cellen en celtype kunnen variëren van studie tot studie en daarom moeten celspecifieke celkweekprocedures worden gevolgd om cellen te zaaien en te laten groeien. Het celzaai- en kweekprotocol dat in deze studies wordt gebruikt, is beschikbaar als aanvullende informatie in het bestand met de naam "Supplemental File_Cell Culture and Transfection".
  3. Transfecteer PMVECs met een FRET biosensor en incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C.
    OPMERKING: Het protocol voor het transfecteren van PMVECs wordt ook beschreven in het aanvullende informatiebestand met de naam "Supplemental File_Cell Culture and Transfection".
  4. Op de dag van de beeldvorming, warm Tyrode's buffer op tot 37 °C in een waterbad.
    OPMERKING: Tyrode's buffer bestaat uit 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose, 1 mM MgCl2 en 1 mM CaCl2
  5. Monteer een afdekblad met getransfecteerde cellen in een celkamer en bevestig de bovenkant met een montagepakking om lekken te voorkomen.
  6. Veeg de onderkant van de deklip schoon met een delicaat taakdoekje om overtollige media of hechtende cellen schoon te maken.
  7. Voeg 800 μL werkbuffer en 4 μL 5 mM nucleair label toe aan de celkamer en laat zachtjes schommelen gedurende 5 - 10 seconden.
    OPMERKING: Wanneer u buffer- of reagensoplossingen toevoegt aan coverslips die in de celkamer zijn gemonteerd, moet u ervoor zorgen dat u de oplossing voorzichtig en aan de zijkant van de celkamer toevoegt om aanhangbare cellen niet los te maken. Het toevoegen van 4 μL van 5 mM nucleair label aan 800 μL buffer maakt 25 μM eindconcentratie van nucleair label. Voor losjes hechtende cellen zoals HEK293-cellen, meng nucleair label en buffer eerst in een injectieflacon en voeg vervolgens toe aan coverslips die in de celkamer zijn gemonteerd. Dit voorkomt dat de cellen van de coverslip worden getild.
  8. Bedek de celkamer met aluminiumfolie ter bescherming tegen licht en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  9. Reagensvoorbereiding: Voeg 1 μL van 50 mM forskolin toe aan 199 μL buffer. Dit zal een uiteindelijke concentratie van forskoline van 50 μM opleveren wanneer het wordt toegevoegd aan cellen die zijn bereid met 800 μL buffer. 1 μL DMSO in 199 μL buffer moet ook worden voorbereid om te worden gebruikt als controlemiddel.
    OPMERKING: In deze studies wordt forskolin gebruikt als een adenylcyclase activator om de cAMP-productie te stimuleren. Indien gewenst kan deze methodologie eenvoudig worden aangepast om behandeling met alternatieve reagentia mogelijk te maken voor het stimuleren of remmen van adenylcyclase, fosfodiësterasen, enz.

2. Beeldverwerving

  1. Gebruik een confocale microscoop uitgerust met een spectrale detector.
    OPMERKING: Alle hier beschreven stappen voor beeldacquisitie zijn ontwikkeld met behulp van een in de handel verkrijgbaar Nikon A1R-microscoopsysteem. Deze stappen moeten mogelijk worden aangepast als een alternatieve spectrale microscoop wordt gebruikt. Zorg ervoor dat alle apparatuur ten minste 30 minuten voor het begin van het experiment is ingeschakeld om stabiele bedrijfsomstandigheden te bereiken.
  2. Selecteer de doelstelling 60x onderdompeling in water en voeg een druppel water toe aan het doel.
    OPMERKING: Voor live-cell imaging met hoge resolutie wordt aanbevolen om een hoog numeriek diafragma objectief te gebruiken. Raadpleeg de lijst met materialen voor informatie over het doel dat in deze onderzoeken wordt gebruikt.
  3. Plaats de geladen celkamer (vanaf stap 1.7) op het microscoopstadium.
  4. Selecteer de DFT (DAPI/FITC/TRITC) filterset door de filterknop aan de rechterkant van de microscoop af te stemmen.
  5. Bedien de microscoop in fluorescentie widefield-modus met behulp van de oculairs om een gezichtsveld te selecteren dat cellen bevat die de cAMP FRET-sensor tot expressie brengen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de gemiddelde intensiteit van het FRET-signaal op de donor- of acceptoremissiepiekgolflengte in de geselecteerde cel ten minste 100 intensiteitseenheden (A.U.) of ten minste 4x het basissignaal van een gebied zonder tot expressie brengende cellen is. Dit kan worden bevestigd met behulp van de spectrumprofielviewer die beschikbaar is in NIS Elements-software. Bij het zoeken naar een cel met een goed signaal, is het raadzaam om te heldere cellen weg te gooien (ze kunnen worden aangetast).
  6. Open NIS-software, schakel over naar de confocale modus, ontgrendel de laservergrendelingsknop en klik op Live.
  7. Gebruik de focusknop om scherp te stellen op de cellen door naar het voorbeeld op het scherm te kijken.
  8. Configureer apparaat-, acquisitie- en z-stack-instellingen in de software, zoals hieronder wordt beschreven.
  9. Acquisitie-instellingen:
    OPMERKING: Instellingen voor camera- en apparaatacquisitie kunnen worden toegepast met behulp van een eerder verkregen afbeelding. Open de afbeelding, klik met de rechtermuisknop en selecteer Camera-instellingen opnieuw gebruiken.
    1. Open het instellingenmenu van de A1, vink de vakjes aan die overeenkomen met laserlijnen van 405 nm en 561 nm, selecteer SD voor spectrale detector, selecteer 10 voor resolutie en 31 voor kanalen.
      OPMERKING: Het instellingenmenu van A1 wordt weergegeven als een klein tandwielpictogram in de linkerbovenhoek van het venster A1 Plus-instellingen. 405 nm laser wordt gebruikt voor donor excitatie en 561 nm laser wordt gebruikt voor nucleaire label excitatie.
    2. Stel het golflengtebereik (410 – 730 nm) in door begin- en eindgolflengtewaarden te selecteren.
    3. Klik op het binning/skip-pictogram in het A1-instellingenmenu, selecteer het vakje met nummer 15 en klik vervolgens op OK in het A1-instellingenmenu.
      OPMERKING: Dit is om het golflengtekanaal te verwijderen dat overeenkomt met de 561 nm excitatielaser (dit is meestal het15e golflengtekanaal). Het is belangrijk om deze golflengteband niet te gebruiken om een kunstmatig laag signaal te vermijden, wat een spectraal artefact kan creëren. Het signaal is lager in deze band vanwege de mechanische vinger die het detectorelement bedekt om het te beschermen tegen laserschade.
    4. Stel de laserintensiteiten in op respectievelijk 8% en 2% voor de 405 nm en 561 nm lasers, Si Hv (detector gain) op 149 en een pinhole radius van 2,4 airy disk units (AU).
      OPMERKING: Laserintensiteiten moeten mogelijk worden aangepast, afhankelijk van de leeftijd van het instrument en de toestand van de lasers. Bij het aanpassen van laserintensiteiten tussen verschillende monsters of experimentele groepen, is het belangrijk om dezelfde verhouding van laserintensiteiten te behouden (bijv. 8: 2). Bovendien is het belangrijk om een laserintensiteit te selecteren die niet zo helder is dat er snel fotobleeken ontstaat. De detectorversterkte moet worden aangepast om de signaalintensiteit te maximaliseren en tegelijkertijd de detectorruis te minimaliseren. Voor deze studies werd een winst van 149 gebruikt. Een pinhole-grootte van 2,4 AE werd gekozen als balans tussen het verkrijgen van beelden met voldoende signaal-ruisverhouding (SNR) en het handhaven van optische sectioning (confocaliteit). Een toename van de pinhole-grootte verhoogt de SNR, maar vermindert de confocaliteit.
    5. Stel de scansnelheid in op 0,25 spectrale frames per seconde, selecteer het pictogram dat overeenkomt met unidirectioneel voor scanrichting, voer 4 in voor het aantal en stel 1024 x 1024 in voor scangrootte.
      OPMERKING: FRET-signalen zijn zwak en een lage scansnelheid is vaak vereist. Met behulp van een scansnelheid van 0,25 wordt de acquisitie van een spectrale z-stack in ~ 3 minuten voltooid. De scansnelheid kan worden verhoogd of verlaagd, afhankelijk van de gebruikte fluoroforen. Voor helderdere fluoroforen zoals eGFP kan bijvoorbeeld een hogere scansnelheid (2 frames/seconde) worden gebruikt. Het getal dat onder telling wordt ingevoerd, komt overeen met een framegemiddelde waarde van 4, wat helpt bij ruisonderdrukking tijdens beeldacquisitie. Voor zeer stabiele monsters en waar tijd geen beperking is, kunnen hogere gemiddelde waarden (tot 16) worden gebruikt om beelden met verbeterde SNR te verkrijgen.
  10. Definieer z-stack acquisitieparameters:
    OPMERKING: De waarden die in stap 2.10 zijn ingevoerd, moeten mogelijk worden aangepast om rekening te houden met veranderingen in fluorescerende labelbinding of -concentratie, type etiket, aantal gebruikte labels, cellijn en andere veranderingen in de monstervoorbereiding die van invloed kunnen zijn op de celetiketteringsdichtheid en/of cellulaire autofluorescentie. Bij het aanpassen van acquisitieparameters moet ervoor worden gezorgd dat een voldoende SNR wordt bereikt terwijl fotobleaching wordt geminimaliseerd. Bovendien moet er bij het configureren van een spectrale FRET-test voor worden gezorgd dat de parameters goed werken in alle behandelingsgroepen. Het is raadzaam om een proef uit te voeren van elke behandelingsgroep met de voorgestelde parameterinstellingen om ervoor te zorgen dat SNR voldoende is en fotobleaching wordt geminimaliseerd.
    1. Open het ND-acquisitievenster door te klikken op → acquisitiecontrole → ND-acquisitiebekijken.
    2. Voer het pad/de bestemming en een bestandsnaam in om het ND-bestand op te slaan in het pop-upvenster.
    3. Vink het vakje aan dat overeenkomt met de z-serie.
    4. Klik op live in het venster A1 Plus-instellingen. Dit opent een live kijkvenster.
    5. Pas de scherpstelknop op de microscoop aan om de bovenkant van de cel te selecteren en klik op Boven in het ND-acquisitievenster om de huidige positie als boven in te stellen.
      OPMERKING: Er wordt voorgesteld om iets boven de bovenkant van de cel scherp te stellen om ervoor te zorgen dat alle cellen in de z-reeks worden bemonsterd.
    6. Pas de focusknop op de microscoop aan om de onderkant van de cel te selecteren en klik op Onder in het ND-acquisitievenster om de huidige positie als de onderkant in te stellen.
      OPMERKING: Stel iets onder de onderkant van de cel scherp om ervoor te zorgen dat alle cellen worden bemonsterd.
    7. Voer 1 μm in voor stapgrootte, selecteer boven-onder voor de z-scanrichting en klik op uitvoeren op het ND Acquisition-venster om een z-stack te verkrijgen.
      OPMERKING: Stapgrootte bepaalt het aantal z-slices dat wordt verkregen, afhankelijk van de bovenste en onderste locaties (d.w.z. de afgelegde afstand). Een stapgrootte van 1 μm werd gekozen als compromis tussen beeldvormingssnelheid, z-asbemonstering en fotobleaching. Het gebruik van de confocale gaatjesdiameter van 2,4 AE en de 60x waterdompelingsdoelstelling resulteerde in een optische sectiedikte van 1,73 μm. Vandaar dat een stapgrootte van 1 μm iets onder de Nyquist-bemonsteringscriteria ligt, maar dit is een compromis dat is gesloten om de tijd die nodig is om een z-stack te verkrijgen te verkorten. Voor zeer stabiele monsters, waarvoor snelheid niet kritisch is, kan een kleinere z-asstap en mogelijk een kleinere confocale gaatjesdiameter worden gebruikt om de z-asresolutie te verhogen. Bottom-top moet vergelijkbare resultaten opleveren en kan worden gebruikt om eventuele effecten van fotobleaching te evalueren die tijdens de z-scan kunnen optreden.
  11. Stel het Perfect Focus System (PFS) in, indien beschikbaar:
    OPMERKING: PFS stelt het systeem in staat om schommelingen in de scherptediepte tijdens beeldacquisitie te compenseren. De volgende stappen kunnen worden gebruikt om PFS in te stellen en deze stappen kunnen enigszins variëren, afhankelijk van de versie van de Nikon A1R en de gebruikte versie van NIS Elements.
    1. Markeer de symmetrische modus die wordt gedefinieerd door het bereikpictogram in het ND-acquisitievenster.
    2. Schakel de PFS-knop op de voorkant van de microscoop in (zorg ervoor dat de dichroïsche spiegelknop op het gedeelte onder de monstertrap 'in' is).
    3. Herdefinieer de bovenkant (draai tegen de klok in) en de onderkant (draai met de klok mee) met behulp van de knop aan de voorkant van de PFS-offsetcontroller.
    4. Definieer een relatieve z-positie/z-diepte door op 'relatief' te klikken in het ND-acquisitievenster.
    5. Klik op het geheugen op de voorkant van de microscoop zodat de software de relatieve z-diepte onthoudt.
  12. Nadat de z-stack acquisitie is voltooid, voegt u voorzichtig het gewenste reagens (forskolin of voertuigbesturing) toe met behulp van een pipet en wacht u 10 minuten.
    OPMERKING: Voeg het reagens heel voorzichtig toe om de cellen niet te verstoren of de positie van de celkamer in de microscoop XY-fase te verplaatsen; het is handig om in een volgende live view of afbeelding te controleren of het gezichtsveld niet is verschoven tijdens het toevoegen van reagens. De wachttijd van 10 minuten is voor de forskolin-behandeling om van kracht te worden. Als een alternatieve behandeling wordt gebruikt, moet de wachttijd mogelijk worden aangepast.
  13. Wijzig na 10 minuten de bestandsnaam en klik op uitvoeren in het ND-acquisitievenster.
  14. Herhaal stap 2.11 – 2.13 zoals hierboven beschreven voor ten minste 5 coverslips om voldoende resultaten te bereiken voor statistische analyse (n=5 voor elke behandelingsgroep – forskoline en voertuigcontrole).
  15. Bereid monsters en proef blanco's voor om de spectrale bibliotheek te construeren en spectrale beelden te verkrijgen met behulp van vergelijkbare acquisitie-instellingen zoals beschreven in stap 2.9 en 2.10.

3. Beeldanalyse

OPMERKING: Deze afbeeldingen zullen worden gebruikt om een spectrale bibliotheek te construeren die de zuivere spectra van alle individuele eindleden die in de studie aanwezig zijn, bevat. De eindleden in de spectrale bibliotheek kunnen variëren van studie tot studie als verschillende fluoroforen worden gebruikt. Een gedetailleerde procedure om de spectrale bibliotheek te construeren wordt verstrekt in een aanvullend informatiebestand met de naam "Supplemental File_Spectral Library". Hier beschrijven we het exporteren van gegevens naar .tiff bestanden, lineaire spectrale ontmenging, FRET-efficiëntiemetingen, driedimensionale reconstructie en schatting van cAMP-niveaus. Beeldanalyse kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende beeldanalyse- en programmeerplatforms zoals ImageJ, Python, MATLAB of CellProfiler. In deze studies werden MATLAB-scripts gebruikt.

  1. Afbeeldingsgegevens exporteren:
    1. Maak nieuwe mappen met dezelfde bestandsnaam die overeenkomt met de spectrale z-stack-afbeeldingen die zijn verkregen in stap 2.13 en 2.14.
      OPMERKING: De volgende stappen voor het exporteren van gegevens zijn specifiek voor NIS Elements AR versie 4.30.01. Deze stappen kunnen enigszins variëren, afhankelijk van de versie van de software.
    2. Klik op Bestand, waarmee een bestandsvenster wordt geopend. Blader en selecteer het spectrale afbeeldingsbestand dat is verkregen in stap 2.12 en klik op Openen.
    3. Zodra het bestand is geladen, klikt u op Bestand→ importeren/exporteren→ ND-document exporteren.
    4. In het pop-upvenster: blader en selecteer de map die is gemaakt in stap 3.1.1, selecteer Tagged Image Format (TIF) voor Bestandstype, selecteer vervolgens Mono-afbeelding voor elk kanaal en Houd bitdiepte.
      OPMERKING: Het bestandsvoorvoegsel wordt vooraf gegenereerd; wijzig deze waarde voor het gemak. De indexvolgorde verandert afhankelijk van de kanalen die zijn geselecteerd en moet "z, c" weergeven voor indexering op basis van de locatie van het z-segment eerst en het golflengtebandnummer seconde. Zorg ervoor dat de vakken die overeenkomen met LUTs toepassen of Overlays invoegen of Puntnamen gebruiken, niet zijn geselecteerd.
    5. Klik op Exporteren om de tiff-bestanden als afzonderlijke tiff-bestanden naar een doelmap te exporteren.
    6. Herhaal stap 3.1.2 – 3.1.5 om spectrale beeldbestanden te exporteren die in stap 2.13 zijn verkregen.
  2. Lineaire spectrale ontmenging:
    1. Open de programmeersoftware.
      OPMERKING: Aangepast ontwikkeld programmeerscript om onbewerkte spectrale afbeeldingen te ontmengen, is te zien op de website van de University of South Alabama BioImaging and BioSystems, onder het tabblad Resources (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html).
    2. Open het bestand met het label "Lineair mengen.m" en klik op de knop Uitvoeren in de werkbalk van de editor.
    3. Blader en selecteer de map met de geëxporteerde *.tif bestandsreeks die is gegenereerd door de NIS Elements-software.
    4. Klik op OK om door te gaan, waarna een nieuw venster wordt geopend met de naam Golflengte en Z-Slice.
    5. Kopieer de bestandsnaam van het eerste bestand (zonder z-slice en kanaalnummer) in de map die is geselecteerd in stap 3.2.4 en plak deze in de eerste stap van het dialoogvenster met het label "Voer de afbeeldingsnaam in".
    6. Voer het aantal kanalen in de tweede stap in met het label "Voer het aantal golflengtebanden in", het aantal z-segmenten in de derde stap met het label "Voer het aantal Z-segmenten in" en klik op OK.
      OPMERKING: Het aantal golflengtebanden kan veranderen als er wijzigingen worden aangebracht in de acquisitie-instellingen, zoals het aanpassen van het golflengtebereik of de golflengtestapgrootte. Het aantal Z-segmenten kan ook veranderen afhankelijk van de hoogte van de cel.
    7. Blader en selecteer het golflengtebestand met de naam "Wavelength.mat" in het pop-upvenster met het label "Selecteer het golflengte-informatiebestand" en klik op openen.
    8. Blader en selecteer het bestand "Library.mat" in het nieuwe pop-upvenster met het label "Selecteer het spectrale bibliotheekbestand", klik op Openen en wacht tot het mengen van de segmenten is voltooid.
      OPMERKING: Library.mat-bestand is een bestand met zuivere spectra voor elk eindlid fluorofoor, samen met celautofluorescentie en achtergrondspectrale handtekeningen. In dit geval omvatten eindlidfluooforen Turkoois, Venus en DRAQ5. Achtergrondspectrale signaturen omvatten cellulaire of matrixautofluorescentie, coverslipfluorescentie en coverslipdiffractie. Wavelength.mat-bestand is een bestand met golflengtekanaalinformatie dat wordt gebruikt om het spectrale beeld te verkrijgen. Een voorbeeld bibliotheekbestand en golflengtebestand zijn beschikbaar op de website van Bioimaging and Biosystems (zie de opmerking onder 3.2.1). Voor meer informatie over het genereren van spectrale bibliotheek- en golflengtebestanden raadpleegt u het aanvullende informatiebestand met de naam "Aanvullende File_Spectral bibliotheek". Ongemengde afbeeldingen die overeenkomen met elk z-segment worden opgeslagen in de map met de naam "Unmixed" die is gemaakt tijdens het ontmengingsproces in de map die is geselecteerd in stap 3.2.3.
  3. FRET Efficiency Berekening:
    1. Open het programmeerscript genaamd "multiFRRCF.m" en klik op uitvoeren.
      OPMERKING: Dit programmeerbestand is beschikbaar op de website van de University of South Alabama Bioimaging and Biosystems (zie opmerking onder stap 3.2.1).
    2. Voer het aantal experimentele proeven in dat u wilt analyseren in het pop-upvenster met de naam "hoeveel mappen moeten worden gereliced" en klik op OK.
      OPMERKING: Afbeeldingsgegevens van elk experiment moeten worden opgeslagen in een aparte niet-gemengde afbeeldingsmap. Met deze stap kan de analysecode eenvoudigweg over veel mappen worden herhaald als een tijdbesparende stap.
    3. Blader en selecteer de niet-gemengde map(en) en klik op OK.
      OPMERKING: Het aantal keren dat het pop-upvenster "Bladeren naar map" wordt geopend, is afhankelijk van het aantal dat is ingevoerd in het dialoogvenster "Hoeveel mappen moeten worden aangepast" in de vorige stap. Blader en selecteer de mappen achter elkaar.
    4. Voer in het nieuwe pop-upvenster de volgende informatie in de respectieve vakken in: schaalfactor is 12,4, Drempel is 5,6, X, Y en Z Frequentie zijn respectievelijk 5, 5 en 1, en het afvlakalgoritme is Gaussisch.
      OPMERKING: De schaalfactor is een waarde in pixels/μm en wordt gebruikt om de Z-richtingsbemonstering te schalen naar die van de XY-richting. De schaalfactor wordt verkregen uit de grootte van de afbeeldingspixel, die meestal wordt verstrekt als metagegevens in de afbeelding voor de meeste confocale microscoopsystemen. Als de afbeelding bijvoorbeeld wordt verkregen met een afstand van 0,08 μm/pixel, moet de schaalfactor 12,5 pixels/μm zijn. Drempelwaarde wordt gebruikt om de afbeeldingen te drempelwaarden en een binair masker van de cel te genereren. We hebben een lijst met optimale waarden gemaakt op basis van de intensiteit van de beelddonor+acceptor. Gebruik 4,5 als drempelwaarde als de afbeelding een heldere donor+acceptorintensiteit en een lage achtergrond heeft, een waarde tussen 5,6 en 6,5 voor afbeeldingen met een matige donor+acceptorintensiteit en/of een hogere achtergrond, en een waarde van 7,5 en hoger voor afbeeldingen met een donor+acceptor-intensiteit die lager is dan de achtergrond. De frequentiewaarde komt overeen met het interval, in aantal pixels, waarbij het snijden in de volgende stappen wordt uitgevoerd. Als de Z-diepte van de cel bijvoorbeeld 17 μm is met een stapgrootte van 1 μm en een schaalfactor van 12,5 pixels/μm wordt gebruikt in de XY-richting, wordt de diepte van de 3-dimensionale afbeeldingsdataset opnieuw bemonsterd op 212 pixels (Z-richting). Op basis van de ingevoerde Z-frequentiewaarde (bijvoorbeeld 1 pixel), wordt de 3-dimensionale afbeeldingsgegevensset opnieuw gesegmenteerd, beginnend boven aan de afbeeldingsgegevensset en vervolgens in stappen van 1 pixel naar beneden. Dit resulteert in 212 resliced afbeeldingen. Als een groter frequentiewaarde-interval zou worden ingevoerd voor Z-frequentie, zouden er minder afbeeldingen met aangepaste inhoud worden gegenereerd. Afbeeldingen met een resliced worden in de volgende stappen opgeslagen.
    5. Klik op uitvoeren en wacht tot alle FRET-metingen en reslicing zijn uitgevoerd.
      OPMERKING: Er wordt een aparte map gemaakt in de bovenliggende map waarin fret-efficiëntieafbeeldingen met aangepaste grijswaarden en gekleurde (een toegepaste colormap) FRET-efficiëntieafbeeldingen worden opgeslagen. Alle FRET-afbeeldingen met grijswaarden en colormaps die in de X-richting (YZ-vlak) zijn opgenomen, worden bijvoorbeeld opgeslagen in een map met de naam "Resliced_XFRET".
    6. Herhaal de analyse met vergelijkbare instellingen voor alle experimenten - voor en na forskolinebehandelingen en voertuigcontroles.
      OPMERKING: De stappen die in paragraaf 3.3 worden genoemd, beschrijven de waarden die moeten worden ingevoerd voor het aangepaste FRET-analyseprogrammeringsscript om 3-dimensionale FRET-afbeeldingsgegevens te genereren. Dit script voert echter verschillende bewerkingen uit tijdens het uitvoeren, waaronder: het laden van afbeeldingsgegevens, het maken van afbeeldingsstapels, vloeiend maken, FRET-efficiëntieberekeningen, het maken en toepassen van een celrandmasker, 3-dimensionale beeldreconstructie, het resliceren van 3-dimensionale afbeeldingen met opgegeven intervallen (frequenties), het toepassen van een kleurenkaart voor het visualiseren van FRET-wijzigingen en het opslaan van de gereliceerde afbeeldingsgegevens in dezelfde map. Aanvullende details zijn opgenomen als opmerkingen in het programmascript.

4. Fret-efficiëntie in kaart brengen naar cAMP-niveaus

  1. Open het programmeerbestand met de naam 'Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m' en klik op uitvoeren in het hoofdvenster.
    OPMERKING: Het bestand is beschikbaar op de website van BioImaging en BioSystems (zie opmerking onder 3.2.1). Dit bestand leest grijswaarden FRET-efficiëntieafbeeldingen en converteert deze naar cAMP-niveaus op basis van een karakteristieke curve. Deze karakteristieke curve maakt gebruik van een cAMP-naar-FRET-relatie gedocumenteerd in literatuur15,36 die wordt beschreven door de Hill-vergelijking (de derde vergelijking hieronder). Kd van de sonde in intacte cellen is echter moeilijk in te schatten en we zijn er in onze berekeningen van uitgegaan dat het 1 μM is. Vandaar dat de resultaten worden weergegeven als een functie van Kd. (d.w.z. [cAMP] = x* Kd). Vergelijkingen die worden gebruikt om de FRET-efficiëntie te meten en FRET aan cAMP-niveaus toe te brengen, worden hieronder weergegeven:
    Equation 1
    Waarbij E de FRET-efficiëntie is, en eenschijnbare en dschijnbare zijn ongemengde pixelintensiteiten van respectievelijk acceptor- en donorafbeeldingen.
    Qa en Qd zijn kwantumopbrengsten van acceptor en donor. Merk op dat Qa en Qd opheffen wanneer de vergelijking voor kλ is opgenomen in de FRET-efficiëntievergelijking, kλ een correctiefactor is:
    Equation 2
    Equation 3 en Equation 4 zijn extinctiecoëfficiënten van donor en acceptor op de donor excitatie golflengte, i (405nm).
    Equation 5
    E is FRET-efficiëntie en KD = Dissociatieconstante = 1 μM.
  2. Navigeer en selecteer de eerste FRET-afbeelding in grijsschaal (opgeslagen in stap 3.3.5) en klik op OK.
  3. Open de FRET/cAMP-beelden om de verdeling van cAMP-signalen in drie dimensies te inspecteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol beschrijft het gebruik van hyperspectrale FRET-beeldvormings- en analysebenaderingen om cAMP-gradiënten in drie ruimtelijke dimensies in levende cellen te meten. Er zijn verschillende belangrijke stappen betrokken bij het genereren van deze resultaten, waarvoor zorgvuldige aandacht vereist is bij het analyseren en kwantificeren van de gegevens. Deze belangrijke stappen omvatten de bouw van een geschikte spectrale bibliotheek, achtergrondspectraal onmenging, drempeling om celgrenzen te identificeren en FRET-efficiëntieberekeningen. Figuur 1 illustreert de schematische stroom van alle stappen die betrokken zijn bij het meten van FRET-efficiëntie en cAMP-niveaus in levende cellen. Wanneer deze beeldvormings- en analysestappen correct worden uitgevoerd, kunnen de FRET-efficiëntie worden gemeten en de ruimtelijke gradiënten van cAMP in 3 dimensies in een cel worden geschat, terwijl rekening wordt gehouden met niet-uniforme achtergrondsignalen.

Figuur 2 toont 3-dimensionale weergaven van valsgekleurde ruwe hyperspectrale beeldgegevens verkregen met behulp van een Nikon A1R confocale microscoop bij baselinecondities (Figuur 2A) en 10 minuten daarna (Figuur 2B) forskolin behandeling. Merk op dat vergelijkbare detector- en systeemparameters werden gebruikt om beeldstapels voor en na de behandeling te verkrijgen om consistentie voor kwantitatieve analyse te behouden. Merk ook op dat veranderingen in FRET niet duidelijk zijn in deze afbeelding, omdat dit puur een visualisatie van onbewerkte gegevens is, voordat de FRET-efficiëntie wordt berekend.

Een spectrale bibliotheek met zuivere spectra van alle eindleden is nodig om ruwe spectrale beeldgegevens verder te analyseren. Het bouwen van een geschikte spectrale bibliotheek is een van de belangrijkste stappen om de juiste metingen van FRET-efficiëntie te garanderen. Figuur 3 toont de constructie van een spectrale bibliotheek met de zuivere spectra van eindleden (in deze huidige studies zijn de eindleden Turquoise, Venus en DRAQ5). Om de FRET-efficiëntie te meten, is het belangrijk om de spectra van Turkoois en Venus te verkrijgen met behulp van een monster met 1:1 stoichiometrie. Hier hebben we een aanpak geboden waarbij de acceptorfluoofoor volledig foto-vernietigd wordt, waardoor spectrale handtekeningen van de donor en acceptor met 1:1 stoichiometrie kunnen worden verkregen (Figuur 3A-F). Bovendien werden lineaire vermogensrelaties tussen de lasers (aanvullende figuur 1) toegepast om het acceptorspectrum te berekenen met een intensiteit die zou worden verwacht als het zou worden geëxciteerd met behulp van de donorexcitatielaser, in dit geval 405 nm voor Turkoois (Figuur 3G). Dit zorgt ervoor dat ongemengde donor- en acceptorsignalen in absolute intensiteit vergelijkbaar zijn wanneer FRET wordt geëxciteerd met een enkele 405 nm laserlijn. Niet-getransfecteerde cellen gelabeld met de nucleaire kleurstof, DRAQ5 (Figuur 3H) werden gebruikt om het zuivere spectrum van DRAQ5 te verkrijgen (Figuur 3I). Door de spectra van de donor, Turquoise(Figuur 3F),acceptor, Venus(Figuur 3G)en DRAQ5(Figuur 3I)te combineren, werd een 3-componentenbibliotheek gecreëerd(Figuur 3J).

Signalen van andere bronnen dan de fluorescerende labels kunnen ook in een monster aanwezig zijn. Om deze te verklaren, werden drie verschillende spectrale handtekeningen met pieken die optreden bij 424 nm, 504 nm en 574 nm geïdentificeerd in niet-gelabelde cellulaire monsters. Wij geloven dat deze spectrale handtekeningen overeenkomen met coverslipreflectie en celmatrix of cellulaire autofluorescentie. Figuur 4 toont de bronnen van deze drie achtergrondspectrale handtekeningen. Het is belangrijk op te merken dat deze signalen niet-uniform binnen de steekproef worden verdeeld en daarom niet eenvoudigweg kunnen worden afgetrokken. Het toevoegen van de spectrale handtekeningen van deze signalen aan de spectrale bibliotheek en het gebruik van lineaire ontmenging om de signalen te scheiden, biedt echter een benadering voor het verwijderen van deze verstorende signalen van de donor- en acceptorsignalen voorafgaand aan het berekenen van FRET-efficiëntie. Om dit te bereiken, werden de drie achtergrondspectrale handtekeningen toegevoegd aan de 3-componenten spectrale bibliotheek, waardoor een nieuwe 6-componentenbibliotheek werd gevormd bestaande uit donor (Turquoise), acceptor (Venus), DRAQ5 en drie achtergrondspectrale handtekeningen.

Een aangepast programmeerscript werd geschreven om de spectrale beeldgegevens in individuele eindleden te mengen en een apart script werd geschreven om daaropvolgende FRET-efficiëntieberekeningen uit te voeren. Lineaire spectrale ontmenging (geïllustreerd in figuur 5)werd uitgevoerd met behulp van de 6-componenten spectrale bibliotheek. Het mengen werd uitgevoerd voor elk segment in de axiale beeldstapel, ook wel z-stack genoemd (zie de 3-dimensionale visualisatie van ruwe spectrale beeldgegevens in figuur 5A). Dit resulteerde in afzonderlijke ongemengde afbeeldingen voor elk eindlid, voor elk z-segment in de z-stack(figuur 5C-E, achtergrond niet-gemengde afbeeldingen worden niet getoond). Indien gewenst kunnen de niet-gemengde signalen vals gekleurd zijn voor visualisatie met een andere kleur toegewezen aan elk niet-gemengd signaal(figuur 5F-H).

Figuur 6 illustreert de stappen die betrokken zijn bij de FRET-efficiëntieberekeningen, evenals de stappen voor het in kaart brengen van FRET-efficiëntie op cAMP-niveaus. Een FRET-efficiëntiebeeld werd gegenereerd met behulp van afgevlakte ongemixte donor- en acceptorafbeeldingen. Een binair maskerbeeld werd verkregen met behulp van ongemengde donor-, acceptor- en nucleaire afbeeldingen. Het masker werd toegepast op de FRET-efficiëntieafbeelding om bijdragen van pixels buiten de cel te verwijderen. Hoewel ongemengde afbeeldingen van enkele z-slices werden gebruikt voor de picturale demonstratie van FRET-efficiëntiemetingen, werden deze berekeningen uitgevoerd op elk segment binnen de 3-dimensionale beeldstapel. De 3-dimensionale FRET-beeldgegevensset werd vervolgens gereliceerd in drie orthogonale vlakken om ruimtelijke gradiënten van cAMP-signalen in verschillende richtingen te visualiseren.

Visualiseren van door agonisten geïnduceerde veranderingen in FRET-efficiëntie en cAMP-niveaus
De hierboven beschreven stappen bieden een methode voor het berekenen van FRET-efficiëntie en cAMP-niveaus op uit hyperspectrale beeldgegevens in drie ruimtelijke dimensies. Deze stappen kunnen worden toegepast op cellulaire preparaten voor en na de behandeling met verbindingen die een cAMP-respons uitlokken, zoals forskoline. Hier geven we een voorbeeld van het gebruik van deze aanpak om veranderingen in FRET- en cAMP-distributie in PMVECs te observeren na behandeling met 50 μM forskolin. Figuur 7 illustreert de veranderingen in FRET-efficiëntie en cAMP-niveaus in verschillende XY-vlaksegmenten (z-plakjes), van apicale tot basale, waardoor vergelijking van baselinecondities (vóór de behandeling met forskoline) en 10 minuten na de behandeling mogelijk is. In dit illustratieve voorbeeld nam de FRET-efficiëntie af (kolommen 1 en 3 in figuur 7)na behandeling met forskoline, wat overeenkomt met een toename van de cAMP-niveaus (kolommen 2 en 4 in figuur 7). Minimale ruimtelijke variatie van cAMP binnen een enkel XY-vlak werd waargenomen. Axiale (apicale-naar-basale) cAMP ruimtelijke gradiënten werden echter waargenomen, zoals kan worden vermoed door op te nemen dat de apicale plak een diepere rode kleur heeft (wat wijst op hogere cAMP-niveaus door de kleurenopzoektabel die werd toegepast) dan de basale plak na forskolinebehandeling (kolom 4 in figuur 7). Axiale FRET- of cAMP-verdelingen kunnen vaak beter worden gevisualiseerd met behulp van afbeeldingen verkregen uit de twee orthogonale ruimtelijke vlakken: figuur 8 toont de FRET-efficiëntie en cAMP-niveaus in het YZ-vlak bij baseline (kolommen 1 en 2) en 10 minuten na forskolinebehandeling (kolommen 3 en 4), terwijl aanvullende figuur 2 de FRET-efficiëntie en cAMP-niveauveranderingen in het XZ-vlak weergeeft. Deze resultaten tonen de haalbaarheid aan van het meten van FRET en het schatten van cAMP-niveaus op 3-dimensionale hyperspectrale beeldgegevens en tonen ook het belang aan van het visualiseren van axiale verdelingen van FRET of cAMP. Hoewel buiten het bestek van dit methodologische artikel, kan het zijn dat axiale ruimtelijke verdelingen van cyclische nucleotiden bijdragen aan specificiteit binnen cyclische nucleotide signaleringsroutes.

Bij het uitvoeren van de hierboven beschreven methoden is het belangrijk om de nauwkeurigheid van de stappen zorgvuldig te controleren en de juiste experimentele en voertuigcontroles uit te voeren om ervoor te zorgen dat veranderingen in FRET (en de bijbehorende cAMP) te wijten zijn aan werkelijke veranderingen in donor- en acceptorsignalen en geen beeldvormende artefacten zijn. Belangrijke stappen om te overwegen zijn bijvoorbeeld:

Een geschikte spectrale bibliotheek gebruiken die alle benodigde spectrale componenten bevat
Zoals vermeld, kan er een aanzienlijke bijdrage zijn van achtergrondsignalen van cellulaire autofluorescentie, gedeponeerde matrix of gereflecteerd licht van de coverslip (excitatie-emissie doorbloedt). Figuur 9 geeft een voorbeeldgegevensset weer die illustreert dat het achtergrondsignaal in de beelden werd behouden toen een 3-componentenbibliotheek (Turquoise, Venus en DRAQ5) werd gebruikt om de spectrale gegevens te ontmengen. Daarentegen werd het achtergrondsignaal effectief verwijderd wanneer een completere (en geschikte) 6-componenten spectrale bibliotheek werd gebruikt.

Een optimale drempelwaarde gebruiken om een celmasker te genereren
In veel van de experimenten die we hebben uitgevoerd, is de intensiteit van het achtergrondsignaal ongeveer 50-60% van de FRET-signaalintensiteit die aanwezig is in de onbewerkte spectrale beeldgegevens (d.w.z. bij het visualiseren van onbewerkte spectrale beeldgegevens is de piek van het FRET-signaal slechts ~ 2x hoger dan die van het omringende achtergrondsignaal). Het scheiden van achtergrondsignaal van voorgrondsignaal met behulp van een drempelwaarde om een binair masker te verkrijgen, is dus een gevoelige stap en moet zorgvuldig worden uitgevoerd om analyseartefacten te voorkomen. Figuur 10 illustreert het effect van verschillende drempelwaarden die worden toegepast voor celsegmentatie om een binair masker van de cel te maken. Een lage drempelwaarde kan een achtergrondsignaal bevatten als onderdeel van de uitdrukcel. Aan de andere kant kan een te hoge drempelwaarde het meten van FRET in laag tot expressie brengende cellen of gebieden van een cel met een laag donor+acceptorsignaal (ofwel zeer dunne delen van de cel of delen die een lagere regionale concentratie van de FRET-sonde kunnen hebben) uitsluiten.

Het selecteren van een getransfecteerde cel met donor+acceptor signaalintensiteit ≥ achtergrondsignaal
Figuur 11 illustreert een voorbeeldgegevensset waarin FRET-efficiënties en overeenkomstige niveaus werden gemeten uit niet-gemengde beelden die werden verkregen met behulp van een 6-componenten spectrale bibliotheek voor lineaire spectrale ontmenging. Ondanks het gebruik van de 6-componentenbibliotheek om spectrale beeldgegevens te ontmengen en een hoge drempel te selecteren voor het maken van de celrand en het nucleaire masker, waren FRET-efficiëntiebeelden nog steeds gevoelig voor hoge achtergrondruissignalen in de buurt van de basale kant van de cel. In dit geval was de aanwezigheid van achtergrondruis te wijten aan de selectie van een cel die de FRET-sonde slechts zwak tot expressie kwam, en de signaalsterkte van de donor + acceptor was ongeveer gelijk aan de achtergrondsignaalsterkte, zelfs na het mengen. Naast het toepassen van de hierboven beschreven geavanceerde analysestappen, is het dus ook belangrijk om tijdens de acquisitie een cel te selecteren met voldoende expressie van de FRET-sonde en dienovereenkomstig voldoende FRET-signaal (donor- en acceptorsignaal dat ten minste gelijk is aan of boven het ruissignaal ligt) om resultaten van hoge kwaliteit te garanderen.

Figure 1
Figuur 1: Stroomdiagram met de stappen die betrokken zijn bij FRET-efficiëntie- en niveaumetingen in drie ruimtelijke dimensies met behulp van hyperspectrale FRET-beeldvorming en -analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Een 3-dimensionale visualisatie van een cel die de cAMP FRET reporter (groen) en kernen uit de cel en omliggende niet-expresserende cellen (rood) tot expressie brengen. Ruwe spectrale beeldgegevens verkregen met behulp van een Nikon A1R spectrale confocale microscoop zijn vals gekleurd volgens golflengte en gevisualiseerd in 3 dimensies met behulp van NIS Elements-software. A) 3-dimensionale beeldgegevens bij baseline en B) 10 minuten na behandeling met 50 μM forskoline. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Constructie van een spectrale bibliotheek met de zuivere spectra van fluorescerende labels in de studie (aangeduid als eindleden door het teledetectieveld). A) Een vals gekleurd beeld van cellen die de FRET-biosensor tot expressie brengen, verkregen bij 405 nm excitatie (donorexcitatie). B) Spectrum overeenkomend met FRET-signaal: 4 verschillende gebieden van belang (ROIs) werden getekend op afbeelding A weergegeven door rode, gele, blauwe en groene rechthoeken. De gemiddelde intensiteit op elke golflengte voor elke geselecteerde ROI werd geëxporteerd. De gemiddelde intensiteit van deze 4 ROIs werd uitgezet op elke emissiegolflengte. De emissiepieken van het spectrum komen overeen met zowel de donor (Turquoise) als de acceptor (Venus) fluoroforen. C) Een vals gekleurd beeld van cellen die de FRET-biosensor tot expressie brengen, verkregen bij 488 nm excitatie (acceptor excitatie). D) Het gemiddelde spectrum werd geschat zoals uitgelegd in B van verschillende ROIs in C (dezelfde regio's als in A) met emissiepiek alleen als gevolg van de acceptor. E) Een vals gekleurd beeld van cellen die de FRET-biosensor tot expressie brengen, verkregen bij 405 nm excitatie na fotodestructie van de acceptorfluoofoor door 514 nm bestraling. F) Het gemiddelde spectrum werd geschat zoals uitgelegd in B van verschillende ROIs in E (dezelfde regio's als A) met een emissiepiek die alleen aan de donor te wijten was. MERK OP dat de donorintensiteit in F is toegenomen in vergelijking met die van het oorspronkelijke FRET-signaal, wat aangeeft dat na fotobleaching van de acceptor de donorexcitatie leidt tot directe donoremissie. G) Het acceptorspectrum zoals verwacht zou worden indien verkregen met behulp van 405 nm excitatie. Dit werd geschat door gebruik te maken van de feiten dat de excitatielasers van 405 nm en 488 nm een lineaire respons hebben die kan worden gekarakteriseerd met behulp van een spectrometer en integrerende bol (aanvullende figuur 1) en de golflengteafhankelijke extinctiecoëfficiënt van Venus. Vandaar dat het Venus-spectrum verkregen bij 488 nm excitatie kan worden omgezet in het Venus-spectrum dat zou worden verwacht als het zou worden verkregen bij 405 nm excitatie H) Een vals gekleurd beeld van cellen gelabeld met het nucleaire label, DRAQ5. I) Het gemiddelde spectrum van verschillende gebieden van belang in H. J) De resulterende spectrale bibliotheek die de genormaliseerde zuivere spectra van de donor en DRAQ5 en het excitatiegolflengte-gecorrigeerde spectrum van de acceptor bevat. Merk op dat Turquoise en Venus spectra werden genormaliseerd tot de maximale waarde van gecombineerde Turquoise + Venus spectrale gegevens, terwijl DRAQ5 eenvoudig werd genormaliseerd tot eenheid op de waarde van de piekemissiegolflengte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Achtergrondspectrale handtekeningen werden geïdentificeerd en opgenomen in de spectrale bibliotheek om rekening te houden met achtergrondfluorescentiesignalen tijdens het ontmengingsproces. A, B) Twee achtergrondfluorescentie spectrale handtekeningen werden waargenomen bij het karakteriseren van een monster blanco (ongelabelde coverslip). Deze spectrale handtekeningen werden genoemd op basis van hun piekgolflengten - één bij 424 nm (van coverslip fluorescentie) en de andere bij 504 nm (waarschijnlijk van reflectie of rugverstrooiing). C) Een derde achtergrond spectrale signatuur werd waargenomen met een piekemissiegolflengte van 574 nm wanneer niet-gelabelde cellen werden geanalyseerd, mogelijk van cellulaire autofluorescentie of fluorescentie van de onderliggende matrix. D) Achtergrondspectra geëxtraheerd uit afbeeldingen A, B en C. Deze drie achtergrondspectra werden toegevoegd aan de bestaande 3-componentenbibliotheek (Figuur 3J) om een 6-componenten spectrale bibliotheek te ontwikkelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Lineaire spectrale ontmenging met behulp van een 6-componenten spectrale bibliotheek die rekening houdt met achtergrondsignalen. A) Ruwe spectrale beeldgegevens verkregen als een axiale z-stack. B) 6-componenten spectrale bibliotheek gebruikt om ruwe spectrale gegevens lineair te ontmengen. C, D en E) Ongemengde beelden op grijsschaal van respectievelijk DRAQ5, Turquoise en Venus waren het gevolg van lineaire spectrale vermenging. F, G en H) Valse gekleurde ongemengde afbeeldingen van respectievelijk DRAQ5, Turkoois en Venus. Ongemengde beelden van achtergrondsignalen werden ook berekend (gegevens die hier niet worden weergegeven omdat alleen de fluorescerende labels van belang zijn voor deze methodologie - zie figuur 4 in Annamdevula, et al. voor voorbeelden van niet-gemengde achtergrondsignalen25). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Stroomdiagram met de stappen die betrokken zijn bij het berekenen van FRET- en cAMP-niveaus op uit niet-gemengde spectrale beeldgegevens. A) Representatieve ongemengde afbeelding van donor, Turquoise. B) Representatief ongemengd beeld van acceptor, Venus. C) Representatief ongemengd beeld van kernen, DRAQ5. D) Binair celmasker wordt gegenereerd door het drempelen van ongemengde donor + acceptor opgetelde afbeelding. E) Een drempel wordt toegepast op het nucleaire beeld om een binair masker van de kern te creëren. F) De pixelgewijze FRET-efficiëntie werd berekend op basis van ongemengde donor- en acceptorafbeeldingen. G) Een samengesteld binair masker werd gemaakt van celrand en nucleaire maskers. H) Gemaskeerd FRET-efficiëntiebeeld: samengesteld celmasker werd toegepast op FRET-efficiëntiebeeld om niet-specifieke FRET-signalen buiten de cel en binnen de kern uit te sluiten. I) Een kleurenkaart werd toegepast op het gemaskeerde FRET-efficiëntiebeeld om ruimtelijke veranderingen in FRET beter te visualiseren. J) Het beeld van cAMP-niveaus dat werd geschat op basis van het FRET-efficiëntiebeeld. K) Colormap werd toegepast om ruimtelijke veranderingen in cAMP beter te visualiseren. Kleurbalken aan de rechterkant werden gebruikt om FRET-efficiëntie (bovenpaneel) en cAMP-niveaus (onderste paneel) te visualiseren. Afbeeldingen in deze figuur zijn representatief voor één enkele axiale z-slice, maar de analysebewerking die in deze figuur wordt beschreven, wordt uitgevoerd op de gehele axiale z-stack. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Forskolin-geïnduceerde FRET-efficiëntie en cAMP ruimtelijke gradiënten gevisualiseerd in PMVECs. XY-vlakbeelden werden gegenereerd door 3-dimensionale gereconstrueerde FRET- en cAMP-beeldgegevens in de axiale (Z) richting van de apicale naar de basale kant van de cel te snijden. Er worden vijf aaneengesloten XY-plakjes weergegeven. Kolommen 1 en 3 vertegenwoordigen de FRET-efficiëntie bij baseline en 10 minuten na behandeling met respectievelijk 50 μM forskolin. Kolommen 2 en 4 geven de niveaus aan bij baseline en 10 minuten na behandeling met forskoline. De kleurenbalken werden gebruikt om veranderingen in de kleurenkaart te relateren aan FRET-efficiëntie (boven) en cAMP-niveaus (onder). Witte lijnen op afbeeldingen in kolom 2 en kolom 4 worden gebruikt om het intensiteitsprofiel (lijnscanprofiel) van cAMP-signalen over deze geselecteerde lijn te genereren. Intensiteitsprofielplot verkregen uit het middensegment van de cel bij baseline (blauw profiel) en na forskolinebehandeling (groen profiel) toont de ruimtelijke verdeling van cAMP-signalen over de lijnscan. Schaalbalk geeft 20 μm aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Forskolin-geïnduceerde FRET-efficiëntie en cAMP ruimtelijke gradiënten gevisualiseerd in de axiale richting. YZ-vlakbeelden werden gegenereerd door 3-dimensionale gereconstrueerde FRET- en cAMP-beeldgegevens in de laterale (X) richting (van links naar rechts van de cel) te verkleinen. Kolommen 1 en 3 vertegenwoordigen respectievelijk de FRET-efficiëntie bij baseline en bij 10 minuten na behandeling met 50 μM forskolin. Kolommen 2 en 4 vertegenwoordigen de cAMP-waarden bij baseline en 10 minuten na behandeling met forskoline. De kleurenbalken rechts werden gebruikt om veranderingen in de kleurenkaart te relateren aan FRET-efficiëntie (boven) en cAMP-niveaus (onder). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: Een vergelijking van de effectiviteit van het gebruik van een 3-componenten of een 6-componenten spectrale bibliotheek voor het berekenen van FRET- en cAMP-niveaubeelden. Niet-specifieke achtergrondsignalen werden waargenomen in afbeeldingen die werden berekend met behulp van een 3-componentenbibliotheek, die geen rekening hield met spectrale achtergrondhandtekeningen. Dit gold met name voor beelden in de buurt van de basale kant van de cel na behandeling met 50 μM forskoline (kolom 2). Daarentegen werden achtergrondsignaalartefacten effectief verwijderd bij het gebruik van een 6-componentenbibliotheek met achtergrondspectrale handtekeningen, waardoor de mogelijkheid om de cel te segmenteren en FRET- en cAMP-signalen te analyseren, werd verbeterd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 10
Figuur 10: Beeldanalyseartefacten kunnen worden geïntroduceerd als er geen geschikte drempelwaarde is geselecteerd om de cel- en kerngrenzen af te bakenen. Ongemengde donor- en acceptorafbeeldingen werden gebruikt om een masker te maken met drie verschillende drempelwaarden: 0,35 (kolommen 1 als 2), 0,65 (kolommen 3 en 4) en 0,9 (kolommen 5 en 6). Kolommen 1, 3 en 5 geven de FRET-efficiëntie bij baseline weer. Kolommen 2, 4 en 6 geven de FRET-efficiëntie weer op 10 minuten na 50 μM forskolinebehandeling. Het selecteren van een drempel die te laag was, resulteerde in het opnemen van delen van de achtergrond of extracellulair gebied met de cel voor analyse, terwijl het selecteren van een drempel die te hoog is resulteerde in het verlies van een deel van de cel (zie het apicale segment in kolommen 4-5 in vergelijking met kolommen 3-4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 11
Figuur 11: Achtergrondsignaalartefacten kunnen nog steeds bestaan, zelfs na het uitmengen van de achtergrond en het selecteren van een geschikte drempel tijdens het maken van een binair masker. Kolom 1 toont representatieve apicale, middelste en basale plakjes bij baseline en kolom 2 toont hetzelfde na 10 minuten na behandeling met 50 μM forskoline. Ondanks het gebruik van een 6-componentenbibliotheek voor het mengen die rekening hield met achtergrondsignalen en het gebruik van een hogere drempel van 0,85 voor het genereren van binaire maskers, werden achtergrondregio's nog steeds geïdentificeerd als onderdeel van de cel, vooral na behandeling met forskoline. Als dit gebeurt, kan een mogelijke verklaring zijn dat een cel met zwakke expressie van de FRET-reporter is geselecteerd voor beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Metingen van de intensiteit van de laserlijn als functie van de laserinstelling in de software. Een vezel-gekoppelde spectrometer en integrerende bol werden gekalibreerd op een NIST-traceerbare lamp om de laserintensiteit te meten voor zowel de 405 nm laserlijn als de 488 nm laserlijn. A) Totaal aantal fotonen gemeten in het microscoopstadium dat overeenkomt met verschillende laserintensiteiten van de 405 nm-laser. B) Totaal aantal fotonen gemeten in het microscoopstadium dat overeenkomt met verschillende laserintensiteiten van 488 nm laser. Lineaire respons in laserintensiteit werd waargenomen voor zowel de lasers als gemeten in het microscoopstadium. Een lineaire trendlijn werd fit en de trendlijnvergelijking voor elke laserlijn werd gebruikt om het acceptorspectrum te berekenen dat zou worden verwacht als het zou worden geëxciteerd met de 405nm-laserlijn (donorexcitatie). Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Forskolin-geïnduceerde FRET-efficiëntie en cAMP ruimtelijke gradiënten gevisualiseerd in de axiale richting. XZ-vlakbeelden werden gegenereerd door 3-dimensionale gereconstrueerde FRET- en cAMP-beeldgegevens in de laterale (Y) richting (van voor naar achter van de cel) te verkleinen. Kolommen 1 en 3 vertegenwoordigen respectievelijk de FRET-efficiëntie bij baseline en bij 10 minuten na behandeling met 50 μM forskolin. Kolommen 2 en 4 vertegenwoordigen de cAMP-waarden bij baseline en 10 minuten na behandeling met forskoline. De kleurenbalken rechts werden gebruikt om veranderingen in de kleurenkaart te relateren aan FRET-efficiëntie (boven) en cAMP-niveaus (onder). Vergelijkbaar met de resultaten die worden getoond voor de YZ-vlakken(figuur 8),kunnen apicale tot basale ruimtelijke gradiënten in FRET-efficiëntie en cAMP-niveaus worden gevisualiseerd als kleurveranderingen van de boven- naar beneden van een enkele YZ-plak, zowel bij basislijnomstandigheden (een bepaald segment in kolommen 1-2) als na 50 μM forskolin-behandeling (kolommen 3-4). Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende bestanden. Klik hier om deze bestanden te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De ontwikkeling van FRET-biosensoren heeft de meting en visualisatie van cyclische nucleotidesignalen in afzonderlijke cellen mogelijk gemaakt, en er is een grote belofte voor het visualiseren van subcellulaire signaleringsgebeurtenissen13,22,37,38. Het gebruik van FRET-biosensoren vertoont echter verschillende beperkingen, waaronder de lage signaal-ruiskenmerken van veel op fluorescerende eiwitten gebaseerde FRET-verslaggevers en de zwakke transfectie- of expressie-efficiëntie van de FRET-verslaggevers (dit kan vooral een uitdaging zijn in bepaalde cellijnen, zoals PMVEC's)23,24. Beeldvorming van zwak tot expressie gebrachte fluorescerende eiwitten, gecombineerd met ratiometrische FRET-berekeningen, resulteert vaak in een hoge mate van onzekerheid of fluctuatie in de berekende FRET-efficiëntie. In een poging om de betrouwbaarheid van FRET-metingen te verbeteren, hebben wij en anderen eerder het gebruik van hyperspectrale beeldvorming en analyse aangetoond om FRET-signalen te meten en om overspraak of bloeding door fluorescentiesignalen tussen fluorescerende labels en autofluorescentie-effecten te verminderen26,31,32,39. Vanwege beperkingen in signaalsterkte waren deze spectrale FRET-studies tot voor kort beperkt tot twee (X en Y) ruimtelijke dimensies. Daarom boden ze een weergave met één segment van FRET-veranderingen binnen een cel.

In recente studies merkten we op dat FRET (en bijbehorende cAMP-niveaus) ruimtelijk verdeeld leken te zijn, niet alleen in het XY-vlak, maar ook over de XZ- en YZ-vlakken25. De hier beschreven hyperspectrale FRET-beeldvormingsbenadering breidt ons vermogen om FRET- en cyclische nucleotide (cAMP) -veranderingen te visualiseren en te meten uit tot drie ruimtelijke dimensies, waardoor nieuwe mogelijkheden worden geopend voor het beoordelen van signaalcompartimentering. Deze 4-dimensionale (X, Y, Z en λ) hyperspectrale beeldvormings- en analysebenadering maakt het mogelijk om cAMP-gradiënten in drie ruimtelijke dimensies te meten en te visualiseren, terwijl rekening wordt gehouden met niet-uniforme achtergrondsignalen. Hier hebben we aangetoond hoe we deze aanpak kunnen implementeren door het voorbeeld van forskolin-geïnduceerde cAMP ruimtelijke gradiënten. In de beeldgegevens na de behandeling kunnen cAMP ruimtelijke gradiënten worden waargenomen van de apicale naar de basale kant van de cel(figuur 7 en figuur 8). De cAMP die werd geproduceerd na behandeling met forskoline leek geen cel-celverbindingen te bereiken(figuur 7 en figuur 8).

Bij het gebruik van de hier beschreven methodologie was het belangrijk om rekening te houden met verschillende bronnen van achtergrond- en autofluorescentiesignalen om een nauwkeurige schatting van fret-efficiëntie mogelijk te maken. Lineaire ontmenging biedt een mogelijke manier om rekening te houden met unieke achtergrondspectra, als hun handtekeningen anders zijn dan de fluorescerende sondes van belang. In het bijzonder is lineaire ontmenging beter geschikt voor het scheiden van achtergrond- en autofluorescentiesignalen dan standaard achtergrondaftrekking. 40,41,42 In het hier getoonde voorbeeld werden drie verschillende spectrale handtekeningen gemeten en een naam toegekend op basis van de piekemissiegolflengte van de handtekening: het 424 nm achtergrondspectrum (mogelijk van de coverslip fluorescentie), het 504 nm achtergrondspectrum (waarschijnlijk als gevolg van gereflecteerd of terugverstrooid licht) en het 574 nm achtergrondspectrum (mogelijk als gevolg van cel- of cellulaire matrixautofluorescentie). Om de effecten van het niet in aanmerking komen voor deze handtekeningen te illustreren, werden twee spectrale bibliotheken gemaakt en ongemengde afbeeldingen vergeleken. Eerst werd een spectrale bibliotheek gemaakt met alleen de fluorescerende labels in het monster, Turquoise, Venus en DRAQ5, en de 3-componentenbibliotheek gelabeld. Ten tweede werd een spectrale bibliotheek gemaakt die bovendien de drie achtergrondspectrale handtekeningen bevatte en de 6-componentenbibliotheek gelabeld. Zoals hierboven weergegeven, maakte het ontmengen met de 6-componentenbibliotheek (achtergrondonmenging) het verwijderen van achtergrondsignalen mogelijk, terwijl het ontmengen met de 3-componentenbibliotheek dat niet deed(figuur 9). In eerder werk hebben we aangetoond dat de root mean squared error (RMSE) geassocieerd met lineaire unmixing wordt verminderd bij het gebruik van een spectrale bibliotheek die rekening houdt met zowel de fluorescerende labels als achtergrondhandtekeningen. Opgemerkt moet worden dat de axiale verdeling van achtergrondfluorescentie vaak niet-uniform is en daarom zal een eenvoudige achtergrondaftrek niet werken om de beeldgegevens te corrigeren. De spectrale ontmengmethode is dus nodig om nauwkeurige achtergrondverwijdering en betrouwbare FRET-metingen te bieden.

Het is belangrijk om systeemparameters te optimaliseren om de best mogelijke systeem- en camera-instellingen te selecteren bij het verkrijgen van spectrale beelden. Het algemene doel moet zijn om SNR te optimaliseren en tegelijkertijd de acquisitietijd te minimaliseren en fotobleaching te voorkomen. 43 Bij het optimaliseren van een beeldvormingssysteem is dus vaak een compromis nodig tussen ruimtelijke, temporele en spectrale resoluties. In deze studies werden optimale waarden geselecteerd voor de systeem- en camera-instellingen, waaronder pinhole-grootte, laservermogen, scansnelheid, scangrootte en framegemiddelde zoals beschreven in de protocolsectie. Met behulp van deze instellingen wordt de ruimtelijke bemonstering van 80 nm / pixel, temporele bemonstering van ~ 3 minuten per spectrale z-stack (~ 10 seconden / XY-beeld) en spectrale bemonstering van 10 nm interval bereikt met verwaarloosbare of minimale fotobleaching.

Om nauwkeurige schattingen van de FRET-efficiëntie te garanderen, is het noodzakelijk om donor- en acceptorspectra te meten zoals ze zouden worden verwacht met 1:1 stoichiometrie en identieke excitatiegolflengten (figuur 3). Turkoois- en Venusspectra werden genormaliseerd ten opzichte van de turquoise piekemissiegolflengte. De FRET-efficiëntie die werd geschat met behulp van deze spectrale bibliotheek produceerde waarden die vergelijkbaar waren met die gerapporteerd in literatuur12,22. Meestal worden eindledenspectra in de bibliotheek genormaliseerd tot eenheid. Om de FRET-efficiëntie nauwkeurig te berekenen, moet het acceptorspectrum echter worden verkregen met betrekking tot het donorspectrum (d.w.z. bij equimolaire concentratie of 1:1 stoichiometrie en wordt verwezen naar dezelfde excitatiegolflengte). Naast het gebruik van een goed geconstrueerde bibliotheek, zijn er verschillende stappen betrokken bij een juiste schatting van de FRET-efficiëntie en het vermijden van analyseartefacten. Deze omvatten het selecteren van een tot expressie brengende cel met voldoende signaalintensiteit(figuur 11),het gladstrijken van niet-gemengde beelden voordat de FRET-efficiëntie wordt geschat (Gaussiaanse vervaging werd in dit voorbeeld toegepast), het gebruik van een geschikte drempelwaarde om het masker te maken (figuur 10) en schatting van een correctiefactor met behulp van extinctiecoëfficiënten van donor en acceptor (Aanvullende File_Spectral Library). Wanneer deze stappen worden gevolgd, kunnen 3-dimensionale verdelingen van FRET-efficiëntie en onderliggende cAMP-niveaus nauwkeurig worden gevisualiseerd in afzonderlijke cellen.

Gelokaliseerde cAMP-signalen zijn geschat in 2-ruimtelijke dimensies met behulp van gerichte FRET-biosensoren13,37. Het richten van FRET-sondes op specifieke subcellulaire compartimenten (bijvoorbeeld plasmamembraan- of lipidenvlotten) resulteert echter meestal in een verhoogde lokale concentratie van sondes. Dit kan resulteren in meetartefacten die worden geïntroduceerd als gevolg van intermoleculaire of bimoleculaire FRET. Bovendien tonen de hier gepresenteerde resultaten en in Annamdevula et.al., 2018, Cytometry A25 het belang aan van 3-dimensionale metingen van FRET van oplosbare of gerichte sondes.

Ondanks het belang van het meten van cAMP-signalen in drie ruimtelijke dimensies, zijn er ook beperkingen aan deze aanpak. De meest beperkende beperking is de lange acquisitietijd die nodig is - ongeveer 3 minuten per spectrale z-stack. Deze acquisitiesnelheid sluit het gebruik van deze aanpak uit voor het detecteren van iets anders dan quasi - steady state cAMP-distributies in cellen. Dat gezegd hebbende, tonen de gepresenteerde resultaten het belang aan van het opnemen van quasi - steady state 3-dimensionale (x, y, z) cAMP-metingen als kritische aanvullingen op standaard 2-dimensionale (x, y) metingen. In de toekomst zal het interessant zijn om gelabelde eiwitten en cellulaire structuren op te nemen in het experimentele ontwerp. Zorgvuldige keuze van fluoroforen die worden gebruikt om eiwitten (en / of structuren) te labelen, zou een beoordeling van de 3-dimensionale verdelingen van de gelabelde eiwitten en FRET mogelijk maken zonder extra verlies van acquisitiesnelheid. Dit zou op zijn beurt het mogelijk maken om gelokaliseerde cAMP-signalen en cAMP-signalen in de buurt van de gelabelde eiwitten in drie ruimtelijke dimensies te meten, waardoor een belangrijke experimentele aanvulling wordt aangeboden op gerichte cAMP-sondes en het nut van hyperspectrale metingen van 3-dimensionale cAMP-distributies in levende cellen verder wordt uitgebreid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Drs. Leavesley en Rich onthullen financieel belang in een startend bedrijf, SpectraCyte, LLC, dat werd opgericht om spectrale beeldvormingstechnologieën te commercialiseren. Alle procedures die in dit protocol worden beschreven, zijn echter uitgevoerd met behulp van commercieel verkrijgbare producten die niet zijn gekoppeld aan SpectraCyte, LLC.

Acknowledgments

De auteurs willen dr. Kees Jalink (Het Nederlands Kanker Instituut en van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Nederland) bedanken voor het leveren van de H188 cAMP FRET biosensor en Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) voor technische hulp bij het verkorten van de tijd die nodig is om onze op maat ontwikkelde programmeerscripts uit te voeren.

De auteurs willen graag de financieringsbronnen erkennen: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attofluor Cell Chamber Invitrogen A7816 Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution Thermo Scientific 62252 Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F6178 Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin Sigma F3917 Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink Gift Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J image.net Free download Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural Invitrogen 23017-015 Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit Invitrogen L3000-015 Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB Mathworks R2019a Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope Nikon Instruments Nikon A1R Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Software dongle used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama Isolated from Rat pulmonary microvasculature PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides Clay Adams 3010 Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media Invitrogen P36961 If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056 Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer Made in-house Made in-house Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate Corning 3506 Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips Fisher Scientific 12545102 Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 water immersion and commonly used objective for cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
  2. Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
  3. Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
  4. Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
  5. Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
  6. Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
  7. Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
  8. Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
  9. Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
  10. Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
  11. Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
  12. Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
  13. Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
  14. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
  15. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science's STKE. 2006, (2006).
  16. Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
  17. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
  18. Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
  19. Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
  20. Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
  21. Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
  22. Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
  23. Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
  24. Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
  25. Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  26. Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
  27. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
  28. Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
  29. Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
  30. Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
  31. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
  32. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
  33. Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
  34. Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
  35. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
  36. Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
  37. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
  38. Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
  39. Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
  40. Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
  41. Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
  42. West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
  43. Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).

Tags

Biologie Nummer 164 Cyclisch AMP ruimtelijk FRET hyperspectraal microscopie spectrale FRET
Meting van 3-dimensionale cAMP-distributies in levende cellen met behulp van 4-dimensionale (x, y, z en λ) hyperspectrale FRET-beeldvorming en -analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, … More

Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, H., Griswold, J. R., Britain, A. L., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and λ) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis. J. Vis. Exp. (164), e61720, doi:10.3791/61720 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter