Summary
Una piattaforma alta può riparare i ratti senza restrizioni ed esporre completamente gli acupoint sul retro durante la manipolazione dell'agopuntura. Questo articolo descrive i metodi per la fabbricazione dell'alta piattaforma, stabilisce un modello di ratto di asma e misura i cambiamenti nella funzione respiratoria utilizzando un sistema di pletosmografia per tutto il corpo (WBP) non invasivo e in tempo reale.
Abstract
Una piattaforma alta può riparare i ratti senza restrizioni ed esporre completamente gli acupoint sul retro durante la manipolazione dell'agopuntura. Questo articolo descrive i metodi per la fabbricazione dell'alta piattaforma, stabilisce un modello di ratto di asma e misura i cambiamenti nella funzione respiratoria utilizzando un sistema di pletosmografia per tutto il corpo (WBP) non invasivo e in tempo reale.
Introduction
L'asma è una malattia cronica caratterizzata da broncocostrizione e iper-reattività delle vie aeree1. A circa 339,4 milioni di persone in tutto il mondo viene diagnosticata l'asma2. La prevalenza dell'asma è in aumento a livello globale, con 100 milioni di nuovi casi previsti per il prossimodecennio 3. Corticosteroidi inalati e a β2-agonisti non controllano efficacemente i sintomi di tutti i pazienti4. Pertanto, l'uso di terapie alternative come l'agopuntura per trattare l'asma ha ricevuto una maggioreattenzione 5. Un metodo efficace per il trattamento dell'asma è l'ago GV14 (Dazhui), il BL12 bilaterale (Fengmen) e il bilaterale BL13 (Feishu)6. L'agopuntura riduce significativamente i livelli di immunoglobulina secretoria A (SIgA) nella saliva e nelle secrezioni nasali dei pazienti con asma allergica e riduce il numero di eosinofili del sangue periferico con un tasso effettivo totale dell'85%6. L'agopuntura a BL13 e ST36 (Zusanli) nei topi con asma cronica diminuisce il livello di IL-17 del 40% e diminuisce lo spessore muscolare liscio del 33% rispetto a quello del gruppo ovalbumina (OVA), alleviando così i sintomi infiammatori7,8. Tuttavia, il meccanismo del trattamento dell'agopuntura per l'asma non è completamente chiaro.
I modelli animali sono uno strumento importante per la ricercasull'asma 9 perché il modello animale può essere utilizzato per la misurazione continua della funzione respiratoria per valutare l'efficacia del trattamento dell'asma10. Nel frattempo, gli studi sulla fisiopatologia dell'asma richiedono campioni di prova, inclusi campioni di trachea, polmone e broncoalveolare per verificare i cambiamenti nei livelli dei fattorichiave 11. I modelli di ratto dell'asma sono comunemente usati per valutare la fisiopatologia dell'asma perché producono risposte alle vie aeree di lunga durata e mostrano risposte immediate e tardive alle vieaeree 12. Tuttavia, a causa della ripetuta stimolazione sperimentale, i ratti spesso diventano irritabili. Pertanto, è necessario un metodo adatto per riparare i ratti. I metodi comunemente utilizzati per la fissazione del ratto includono anestesia e legame13. Sebbene il metodo di anestesia fornisca una migliore esposizione degli acupoint, può influenzare la conduzione nervosa e, in ultima analisi, influenzare i risultati sperimentali14. Il metodo di legame non induce gli stessi effetti fisiologici dell'anestesia, ma i ratti trattenuti sperimenteranno la tensione muscolare scheletrica. Inoltre, l'ago non può raggiungere facilmente la posizionedesignata 15. Qui, introduciamo un'alta piattaforma che può essere utilizzata per riparare i ratti senza limitarli ed esporre completamente gli acupoint sul retro. I ratti possono essere posizionati sulla piattaforma alta durante la somministrazione dell'agopuntura. La piattaforma alta è in grado di ospitare il topo solo mentre è in piedi, e poiché è posizionata a una certa distanza da terra, i ratti non si muoveranno a causa della paura delle altezze16.
Questo articolo descrive in dettaglio la fabbricazione dell'alta piattaforma, l'istituzione di un modello di ratto di asma, il funzionamento dell'accostamento di un topo sulla piattaforma alta e la misurazione della funzione respiratoria utilizzando un sistema di pletosmografia per tutto il corpo (WBP).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per l'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di medicina tradizionale cinese di Shanghai (numero di autorizzazione etica PZSHUTCM190308020).
1. Fabbricazione dell'alta piattaforma
- Impostare la lunghezza e la larghezza del dispositivo di supporto su 86 cm x 17 cm (Figura 1).
- Fissare il dispositivo di connessione verticalmente al dispositivo di supporto. Il dispositivo di collegamento deve essere lungo circa 30 cm per impedire al topo di correre sulla superficie superiore della piattaforma alta e avere una larghezza di 14 cm.
- Fissare il pedale orizzontale (5 cm x 5 cm) al dispositivo di collegamento. L'altezza sospesa nella parte inferiore del pedale orizzontale deve essere maggiore o uguale a 50 cm.
NOTA: A seconda del numero di ratti sperimentali, è possibile utilizzare più pedali orizzontali, con un topo posizionato su ogni pedale.
2. Istituzione di un modello di ratto di asma
- Sensibilizzare i ratti con oav
- Preparare la soluzione di sensibilizzazione il giorno 0. Preparare ogni 1 mL della soluzione di sensibilizzazione con 1 mg di OAV e 10 mg di idrossido di alluminio, con soluzione salina normale come solvente.
- Iniettare per via intraperitoneale ogni ratto con 1 mL della soluzione di sensibilizzazione il giorno 0. Disegnare la soluzione sensibilizzante con una siringa adatta per un uso successivo.
- Afferrare la coda e sollevare il topo, posizionarlo su una superficie ruvida e tirare delicatamente indietro la coda. Afferrare la pelle sia delle orecchie che del collo con il pollice sinistro e l'indice tenendo saldamente la pelle posteriore con le restanti tre dita e palmi (fare attenzione ad astenersi dall'applicare forza in eccesso che soffoca il topo).
- Con la mano destra, eseguire un'iniezione intraperitoneale nel ratto con la siringa preparata con 1 ml della soluzione di sensibilizzazione.
- Ratti impegnativi con OAV
- Selezionare una scatola con un coperchio (la lunghezza, la larghezza e l'altezza sono 39 cm x 28 cm x 23 cm) e praticare un piccolo foro sul lato. Collegare la scatola sigillata, la tazza di nebulizzazione e il nebulizzatore di compressione con un tubo di gomma (Figura complementare 1).
NOTA: La dimensione delle particelle nebulizzate del nebulizzatore compresso è di 1 - 5 μm, il tasso di nebulizzazione è maggiore di 0,2 mL/min e la pressione finale è di 205 kPa. - Il 14 ° giorno dopo la sensibilizzazione, aprire il coperchio della scatola sigillata fatta in casa e posizionare il topo nella scatola (la scatola può ospitare 5 ratti), quindi mettere la scatola sigillata in un armadietto di biosicurezza.
- Preparare la soluzione di sfida. Mescolare accuratamente 300 mg di OAV con 30 mL di soluzione salina normale.
- Accendere il nebulizzatore ad ultrasuoni e aggiungere 30 mL della soluzione di sfida nella tazza di nebulizzazione. Regolare il dosaggio della soluzione di sfida e il numero di ratti in base al volume della scatola sigillata fatta in casa.
- Ripetere la nebulizzazione più volte (una volta al giorno) o regolare la procedura in base alla gravità dei sintomi dell'asma.
- Selezionare una scatola con un coperchio (la lunghezza, la larghezza e l'altezza sono 39 cm x 28 cm x 23 cm) e praticare un piccolo foro sul lato. Collegare la scatola sigillata, la tazza di nebulizzazione e il nebulizzatore di compressione con un tubo di gomma (Figura complementare 1).
3. Trattamento dell'agopuntura
- Selezionare gli acupoint, tra cui GV14, BL12 bilaterale e BL13 bilaterale, secondo la teoria della medicina tradizionale cinese per il trattamento dell'asma (Figura complementare 2). Somministrare l'agopuntura manuale il giorno 2 ed eseguire una volta ogni due giorni per un totale di 7 sessioni (Figura 2) .
- Agopuntura del GV14 situato tra la settima vertebra cervicale e la prima vertebra toracica (la cavità della scapola), sulla linea mediana della schiena (Figura 3).
- Agopuntura del BL13 situato sotto la terza vertebra toracica, su entrambi i lati degli spazi intercostali (bordo inferiore della scapola).
- Agopuntura il BL12 situato sotto la seconda vertebra toracica, su entrambi i lati degli spazi intercostali (sotto la scapola, posizione identificata secondo BL13).
- Afferra i ratti e posizionali sulla piattaforma alta.
- Tenere l'ago monouso in acciaio inossidabile (0,3 mm x 13,0 mm, figura complementare 3) maneggiare con il pollice e l'indice della mano destra e premere la parte posteriore del topo con il palmo della mano destra.
NOTA: Gli aghi monouso devono essere monouso. Perché l'uso ripetuto attenuerà l'ago, il che porta ad un aumento del dolore nei ratti. - Toccare la depressione al centro del bordo superiore (GV14) o il bordo inferiore della scapola (BL12 e BL13), quindi pungere delicatamente la pelle del topo con la punta dell'ago per localizzare gli acupoint.
- Inserire rapidamente l'ago dopo aver determinato la posizione specifica dell'acume e rimuovere rapidamente la mano destra.
- Attorcigliato uniformemente gli aghi di circa 360° ad una velocità di 60 volte/min per 10 -20 s, manipolarli ogni 5 minuti, quindi ritirarli dopo 20-30 min(Figura complementare 4).
4. La misurazione penh
- Preparare la metacolina: Mettere 100 mg di metacolina in un tubo di centrifuga da 5 ml e aggiungere PBS ad un volume di 2 ml (50 mg/mL di metacolina). Quindi, diluire la soluzione di metacolina da 50 mg/mL a 25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 6,25 mg/mL e 3,125 mg/mL.
- Ispezione degli strumenti
- Accendere l'amplificatore di segnale (il sistema di distribuzione aerosol e il sistema di alimentazione del flusso di polarizzazione dei roditori sono tutti spenti e il connettore di nebulizzazione è chiuso).
- Controllare i canali: fare clic su Calibra, riportare la linea di base di regolazione grossolana a 0 e passare alla posizione corrente diretta (DC). Mettere a punto la linea di base su 0 e iniettare 5 ml di gas con una siringa. Quindi, passare alla posizione di corrente alternata (AC).
- Dopo aver controllato i canali, assicurarsi che il valore di errore sia inferiore allo 0,5%.
- Impostazione dei parametri
- Accendere il sistema di distribuzione dell'aerosol e il sistema di alimentazione del flusso di polarizzazione dei roditori. Regolare la portata a 4,5 mL in base al livello del liquido sulla sfera di mercurio.
- Fate clic su Crea opzioni di studio (Create Study Options) e selezionate Studio risposta dose (Dose Response Study),selezionate Ratto di specie (Rat of species) e fate clic su Avanti (Next).
- Selezionare Elenco dose semplice, impostare il numero di dosi su 6 e fare clic su Avanti.
- Selezionare i parametri Penh e Area: impostare il tempo di adattamento dell'animale su 5 minuti, il tempo di nebulizzazione su 2 minuti, il tempo di risposta a 3 minuti e il tempo di recupero su 2 minuti.
- Aggiungere in sequenza le seguenti soluzioni al nebulizzatore (200 μL per ratto): metacolina (0 mg/mL, 3,125 mg/mL, 6,25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL e 50 mg/mL). Si possono osservare cambiamenti in tempo reale a Penh (Figura 4).
- Dopo aver reagito tutte e 6 le soluzioni con concentrazioni diverse, fare clic su File e sessione finale per completare l'esperimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Con agopuntura ai punti GV14, BL12 bilaterali e BL13 bilaterali, il topo mantiene una posizione soggetta. Il topo può ruotare la testa solo verso l'esterno e non verso l'interno perché una direzione è bloccata con una tavola di legno(Figura 5).
Con l'aumento della concentrazione di metacolina, Penh mostra una tendenza all'aumento e il tasso di crescita aumenta gradualmente. A concentrazioni di 3,125 mg/mL, 6,25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL e 50 mg/mL, Penh è aumentata del 18,40% ± 10,70%, del 27,55% ± 10,70%. 26,30%, 88,10% ± 45,63%, 427,60% ± 172,92% e 882,27% ± 121,97%, mostrando un effetto che aumenta con l'aumento della dose (Figura 6).
Figura 1. Fabbricazione dell'alta piattaforma. La piattaforma alta è costituita da un dispositivo di supporto, tre dispositivi di collegamento e tre pedali. La lunghezza e la larghezza del dispositivo di supporto sono di 86 cm x 17 cm, la lunghezza e la larghezza del dispositivo di collegamento sono 30 cm x 14 cm, la lunghezza e la larghezza del pedale sono 5 cm x 5 cm. Ogni dispositivo di connessione è separato da 20 cm.
Figura 2. Protocollo per la definizione di un modello di ratto di asma. La sensibilizzazione viene eseguita il giorno 0 e l'agopuntura viene eseguita a giorni diversi sulla piattaforma alta dai giorni 2 ai 14. Dopo la sfida, il cambiamento in Penh viene misurato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Posizioni anatomiche di GV14 (Dazhui),BL12 (Fengmen)e BL13 (Feishu) sui ratti. (A) Dissezione anatomica della parte posteriore di un ratto che mostra la scapola, la prima costola, la seconda costola, la terza costola e la seconda vertebra toracica (T2). (B) Il piano sagittale delle costole e della vertebra toracica. (C) La sezione trasversale della scapola. (D) GV14: Situato nella cavità della scapola, linea mediana della schiena; BL13: Situato sul bordo inferiore della scapola; BL12: Situato sotto la scapola, posizionato secondo BL13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Cambiamenti in tempo reale nella funzione respiratoria. La curva blu mostra i cambiamenti in tempo reale in Penh. La curva verde mostra la variazione totale del volume delle maree (TVb) in un determinato periodo. La curva viola mostra il cambiamento totale in Penh in un certo periodo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Agopuntura di GV14 (Dazhui),BL12 (Fengmen)e BL13 (Feishu) nei ratti sulla piattaforma alta. (A) Vista dall'alto delle posizioni di GV14, BL12 e BL13 nei ratti. (B) Vista laterale di un ratto agopuntura su una piattaforma elevata. Il topo viene posizionato sulla piattaforma e mantenuto in posizione soggetta durante l'agopuntura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Misurazione di Penh. Il WBP viene utilizzato per misurare il Penh del ratto normale. Con l'aumentare della concentrazione di metacolina, anche il Penh aumenta gradualmente. I dati sono presentati come la media ± SEM (n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura complementare 1. Le specifiche del nebulizzatore. La dimensione delle particelle nebulizzate del nebulizzatore compresso è di 1 - 5 μm, il tasso di nebulizzazione è maggiore di 0,2 mL/min e la pressione finale è di 205 kPa. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura complementare 2. Le posizioni schematiche di GV14 (Dazhui),BL12 (Fengmen)e BL13 (Feishu) nel ratto. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura complementare 3. Specifiche dell'ago. La lunghezza dell'ago è di 13 mm e il diametro è di 0,3 mm. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura complementare 4. Schema della manipolazione dell'agopuntura. Dopo aver inserito l'ago, ha attorcigliato uniformemente gli aghi di circa 360° in diverse direzioni. Clicca qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gli acupoint GV14, bilaterali BL12 e bilaterali BL13 utilizzati in questo studio si trovano sul retro, e quindi l'alta piattaforma è adatta per il fissaggio dei ratti. In altri studi, un metodo di fissazione adeguato deve essere selezionato in base alla posizione degli acupoint15. Per gli acupoint sull'addome, il topo può essere posizionato verso il basso in un cono nero (simile a un sacchetto di pasticceria utilizzato dai fornai)17. Una catena è attaccata al cono di ritenuta per la fissazione e anche la gamba posteriore del topo è fissata. In questo modo, la parte anteriore del corpo dell'animale è saldamente fissata nel cono, mentre l'addome e la schiena sono esposti. Per gli acupoint sulla gamba, il topo può essere posizionato verticalmente in uno speciale secchio trasparente, lasciando la coda e le zampe posteriori naturalmente fuori dalsecchio 18. La canna trasparente copre il corpo del topo, ma è conveniente per l'agopuntura sulla gamba.
Durante l'esecuzione di questi metodi è necessario prendere in considerazione diversi passaggi critici. Prima del trattamento di agopuntura, i ratti devono essere posizionati sulla piattaforma alta per l'allenamento con alcuni giorni di anticipo fino a quando i ratti non si tengono zitti e respirano senza intoppi sulla piattaforma alta. Per la manipolazione dell'agopuntura, più duro è il palmo della mano destra preme indietro il topo, più facile è inserire l'ago. Per la misurazione della funzione respiratoria, il sistema WBP misura i cambiamenti nel Penh che riflettono i cambiamenti nella resistenza polmonare dei ratti in modo non invasivo e riduce al minimo gli effetti dello stresspsicologico 19,20. L'effetto dell'ambiente esterno sui ratti dovrebbe essere ridotto al minimo. Il ratto deve essere collocato nella sala prove e quindi coperto la sala prove con un sacchetto di plastica (con foro di 1 cm x 1 cm sul lato dorsale per la ventilazione) per ridurre l'irritazione causata dall'ambiente esterno.
La limitazione di questo esperimento è che l'ago può cadere se il topo oscilla durante l'agopuntura. Pertanto, il bisogno deve essere manipolato ogni 5 minuti per regolare la profondità. Inoltre, l'alta piattaforma è adatta per ratti, ma non per animali più piccoli, come i topi.
In sintesi, forniamo una descrizione dettagliata del metodo per la fabbricazione di un'alta piattaforma per il fissaggio dei ratti senza restrizioni durante l'agopuntura. La piattaforma alta può esporre completamente gli acupoint sul retro del topo. L'uso dell'alta piattaforma e delle misurazioni della funzione respiratoria non invasiva può facilitare l'analisi dell'agopuntura come trattamento per l'asma. Lo studio del meccanismo terapeutico dell'agopuntura sul retro può portare nuovi trattamenti a malattie respiratorie come l'asma e la broncopneumopatia cronica ostruttiva.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 81922076, 81973951, 81873373), Construction project of collaborative innovation of shanghai (No. ZYJKFW201811010, ZYJKFW201701005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mm x 13.0 mm acupuncture needle | China Suzhou Medical Device Factory | ||
| Al(OH)3 | American Thermo | 77161 | |
| Compression nebulizer | Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd. | NB-212C | |
| Fine Pointe V2.0 | American Buxco | ||
| Laboratory gas drying unit | American Drierite | 26800 | |
| Methacholine | American Sigma | MKCF6054 | |
| Ovalbumin | American Sigma | A5503-25G | |
| Phosphate Buffer solution (1x) | Gelifesciences | SH30256.01 | |
| Seal box | IRIS Corporation of Japan | ||
| Whole-body plethysmography respiratory function measurement system | American Buxco |
References
- Papi, A., Brightling, C., Pedersen, S. E., Reddel, H. K.
- Global Initiative for Asthma, 2019. Global strategy for asthma management and prevention. , Available from: https://ginasthma.org/gina-reports/ (2019).
- Enilari, O., Sinha, S. The Global Impact of Asthma in Adult Populations. Annals of Global Health. 85 (1), (2019).
- Global Initiative for Asthma, 2020. Global strategy for asthma management and prevention. , Available from: https://ginasthma.org/gina-reports/ (2020).
- Zhuang, Y., Xing, J. J., Li, J., Zeng, B. Y., Liang, F. R.
- Yang, Y. Q., et al. Considerations for use of acupuncture as supplemental therapy for patients with allergic asthma. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 44 (3), 254-261 (2013).
- Nurwati, I., et al. Reduction of interleukin-17 level by acupuncture at Feishu (BL13) is strengthened by acupuncture at Zusanli (ST36) in a mouse model of chronic asthma: An experimental study. Medical Acupuncture. 27 (4), 278-282 (2015).
- Nurwati, I., et al. Improvement in inflammation and airway remodelling after acupuncture at BL13 and ST36 in a mouse model of chronic asthma. Acupuncture in Medicine. 37 (4), 228-236 (2019).
- Reddy, A. T., Lakshmi, S. P., Reddy, R. C. Murine model of allergen induced asthma. Journal of Visualized Experiments. (63), e3771 (2012).
- Zhou, D. D., et al. Metallothionein-2 is associated with the amelioration of asthmatic pulmonary function by acupuncture through protein phosphorylation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 123, 109785 (2020).
- Yin, L. M., et al. Transgelin-2 as a therapeutic target for asthmatic pulmonary resistance. Science Translational Medicine. 10 (427), (2018).
- Shin, Y. S., Takeda, K., Gelfand, E. W. Understanding asthma using animal models. Allergy Asthma & Immunology Research. 1 (1), 10-18 (2009).
- Cui, K. M., et al. Electro-acupuncture relieves chronic visceral hyperalgesia in rats. Neuroscience Letters. 376 (1), 20-23 (2005).
- Tobin, J. R., Martin, L. D., Breslow, M. J., Traystman, R. J. Selective anesthetic inhibition of brain nitric oxide synthase. Anesthesiology. 81 (5), 1264-1269 (1994).
- Dimitrov, N., Sivrev, D., Atanasova, D. Method of rat immobilization during experimental acupuncture. Scripta Scientifica Medica. 45, 105-108 (2013).
- Aguilar, R., et al. emotional reactivity and fear of heights: a factor analytic map from a large F(2) intercross of Roman rat strains. Brain Research Bulletin. 57 (2), 17-26 (2002).
- Lai, X., et al. Proteomic response to acupuncture treatment in spontaneously hypertensive rats. PloS One. 7 (9), 44216 (2012).
- Niu, C., et al. A novel uni-acupoint electroacupuncture stimulation method for pain relief. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2011, 209879 (2011).
- McFadden, E. R., Luparello, T., Lyons, H. A., Bleecker, E. The mechanism of action of suggestion in the induction of acute asthma attacks. Psychosomatic Medicine. 31 (2), 134-143 (1969).
- Savov, J. D., et al. Ozone-induced acute pulmonary injury in inbred mouse strains. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 69-77 (2004).
