Summary
Een hoog platform kan ratten zonder beperking repareren en de acupunten op de rug volledig blootleggen tijdens acupunctuurmanipulatie. Dit artikel beschrijft methoden voor de fabricage van het hoge platform, stelt een rattenmodel van astma vast en meet veranderingen in de ademhalingsfunctie met behulp van een niet-invasief en real-time plethysmografiesysteem voor het hele lichaam (WBP).
Abstract
Een hoog platform kan ratten zonder beperking repareren en de acupunten op de rug volledig blootleggen tijdens acupunctuurmanipulatie. Dit artikel beschrijft methoden voor de fabricage van het hoge platform, stelt een rattenmodel van astma vast en meet veranderingen in de ademhalingsfunctie met behulp van een niet-invasief en real-time plethysmografiesysteem voor het hele lichaam (WBP).
Introduction
Astma is een chronische ziekte die wordt gekenmerkt door bronchoconstrictie en hyperresponsiviteit van de luchtwegen1. Wereldwijd worden ongeveer 339,4 miljoen mensen gediagnosticeerd met astma2. De prevalentie van astma neemt wereldwijd toe, met 100 miljoen nieuwe gevallen verwacht in het komende decennium3. Inhalatiecorticosteroïden en langwerkende β2-agonisten beheersen de symptomen van alle patiënten niet effectief4. Daarom heeft het gebruik van alternatieve therapieën zoals acupunctuur voor de behandeling van astma meer aandachtgekregen 5. Een effectieve methode voor de behandeling van astma is naald GV14 (Dazhui), bilaterale BL12 (Fengmen) en bilaterale BL13 (Feishu)6. Acupunctuur vermindert aanzienlijk de niveaus van secretoire immunoglobuline A (SIgA) in het speeksel en neusafscheidingen van patiënten met allergisch astma en vermindert het aantal eosinofielen in het perifere bloed met een totale effectieve snelheid van 85%6. Acupunctuur bij BL13 en ST36 (Zusanli) bij muizen met chronisch astma verlaagt het niveau van IL-17 met 40% en vermindert de gladde spierdikte met 33% in vergelijking met die van de ovalbumine (OVA) groep, waardoor ontstekingsverschijnselen7,8worden verlicht . Het mechanisme van acupunctuurbehandeling voor astma is echter niet helemaal duidelijk.
Diermodellen zijn een belangrijk hulpmiddel voor astmaonderzoek9 omdat het diermodel kan worden gebruikt voor de continue meting van de ademhalingsfunctie om de effectiviteit van de astmabehandeling te beoordelen10. Ondertussen vereisen studies van de pathofysiologie van astma testmonsters, waaronder monsters van de luchtpijp, long en bronchoalveolaire lavage om veranderingen in de niveaus van belangrijke factoren te verifiëren11. Rattenmodellen van astma worden vaak gebruikt om astmapathofysiologie te beoordelen omdat ze langdurige luchtwegreacties produceren en onmiddellijke en late luchtwegreacties vertonen12. Door herhaalde experimentele stimulatie worden de ratten echter vaak prikkelbaar. Daarom is een geschikte methode nodig om ratten te repareren. Veelgebruikte methoden voor rattenfixatie zijn anesthesie en binding13. Hoewel de anesthesiemethode zorgt voor een betere blootstelling van de acupunten, kan het de zenuwgeleiding beïnvloeden en uiteindelijk de experimentele resultaten beïnvloeden14. De bindmethode induceert niet dezelfde fysiologische effecten als anesthesie, maar ingehouden ratten zullen skeletspierspanning ervaren. Ook kan de naald niet gemakkelijk de aangegeven positie bereiken15. Hier introduceren we een hoog platform dat kan worden gebruikt om ratten te repareren zonder ze te beperken en de acupunten op de rug volledig bloot te leggen. De ratten kunnen tijdens de toediening van acupunctuur op het hoge platform worden geplaatst. Het hoge platform is alleen geschikt voor de rat terwijl hij staat, en omdat hij op een bepaalde afstand van de grond wordt geplaatst, zullen de ratten niet bewegen vanwege hoogtevrees16.
Dit artikel beschrijft in detail de fabricage van het hoge platform, de vaststelling van een rattenmodel van astma, de werking van het needling van een rat op het hoge platform en de meting van de ademhalingsfunctie met behulp van een whole-body plethysmography (WBP) systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden beoordeeld en goedgekeurd door de Commissie ethiek van dierproeven van de Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (ethisch klaringsnummer PZSHUTCM190308020).
1. Fabricage van het hoge platform
- Stel de lengte en breedte van het steunapparaat in op 86 cm x 17 cm (afbeelding 1).
- Bevestig het verbindingsapparaat verticaal aan het ondersteuningsapparaat. Het verbindingsapparaat moet ongeveer 30 cm lang zijn om te voorkomen dat de rat naar het bovenoppervlak van het hoge platform loopt en een breedte van 14 cm heeft.
- Bevestig het horizontale pedaal (5 cm x 5 cm) aan het aansluitapparaat. De hangende hoogte aan de onderkant van het horizontale pedaal moet groter zijn dan of gelijk zijn aan 50 cm.
OPMERKING: Afhankelijk van het aantal experimentele ratten kunnen meerdere horizontale pedalen worden gebruikt, waarbij één rat op elk pedaal wordt geplaatst.
2. Vaststelling van een rattenmodel van astma
- Sensibiliseren van de ratten met OVA
- Bereid de sensibilisatieoplossing voor op dag 0. Bereid elke 1 ml van de sensibilisatieoplossing met 1 mg OVA en 10 mg aluminiumhydroxide, met normale zoutoplossing als oplosmiddel.
- Injecteer elke rat intraperitonaal met 1 ml van de sensibilisatieoplossing op dag 0. Trek de sensibiliserende oplossing met een geschikte spuit voor later gebruik.
- Pak de staart en til de rat op, plaats hem op een ruw oppervlak en trek de staart voorzichtig naar achteren. Pak de huid van zowel oren als nek vast met de linkerduim en wijsvinger terwijl u de achterhuid stevig vasthoudt met de resterende drie vingers en handpalmen (wees voorzichtig om geen overtollige kracht toe te passen die de rat zal stikken).
- Voer met de rechterhand een intraperitoneale injectie bij de rat uit met de voorbereide spuit met 1 ml van de sensibilisatieoplossing.
- Ratten uitdagen met OVA
- Selecteer een doos met een deksel (de lengte, breedte en hoogte zijn 39 cm x 28 cm x 23 cm) en boor een klein gaatje in de zijkant. Sluit de verzegelde doos, de vernevelbeker en de compressievernevelaar aan met een rubberen buis(aanvullende figuur 1).
OPMERKING: De deeltjesgrootte van de samengeperste vernevelaar is 1 - 5 μm, de vernevelingssnelheid is groter dan 0,2 ml/min en de uiteindelijke druk is 205 kPa. - Open op de 14e dag na sensibilisatie het deksel van de zelfgemaakte verzegelde doos en plaats de rat in de doos (de doos is geschikt voor 5 ratten) en plaats de verzegelde doos vervolgens in een bioveiligheidskast.
- Bereid de uitdagingsoplossing voor. Meng 300 mg OVA grondig met 30 ml normale zoutoplossing.
- Schakel de ultrasone vernevelaar in en voeg 30 ml van de uitdagingsoplossing toe aan de vernevelbeker. Pas de dosering van de uitdagingsoplossing en het aantal ratten aan op basis van het volume van de zelfgemaakte verzegelde doos.
- Herhaal verneveling meerdere keren (eenmaal per dag) of pas de procedure aan op basis van de ernst van astmasymptomen.
- Selecteer een doos met een deksel (de lengte, breedte en hoogte zijn 39 cm x 28 cm x 23 cm) en boor een klein gaatje in de zijkant. Sluit de verzegelde doos, de vernevelbeker en de compressievernevelaar aan met een rubberen buis(aanvullende figuur 1).
3. Acupunctuur behandeling
- Selecteer acupunten, waaronder GV14, bilaterale BL12 en bilaterale BL13, volgens de theorie van de traditionele Chinese geneeskunde voor de behandeling van astma (Aanvullend figuur 2). Beheer manuele acupunctuur op dag 2 en voer eens op de andere dag uit gedurende in totaal 7 sessies (Figuur 2).
- Acupunctuur de GV14 gelegen tussen de zevende halswervel en de eerste borstwervel (de holte van het schouderblad), op de middellijn van de rug (Figuur 3).
- Acupunctuur de BL13 bevindt zich onder de derde thoracale wervel, aan beide zijden van de intercostale ruimtes (onderrand van het schouderblad).
- Acupunctuur de BL12 gelegen onder de tweede thoracale wervel, aan beide zijden van de intercostale ruimten (onder het schouderblad, positie geïdentificeerd volgens BL13).
- Pak de ratten vast en plaats ze op het hoge platform.
- Houd de wegwerpnaald van roestvrij staal (0,3 mm x 13,0 mm, aanvullend figuur 3) vast met de duim en wijsvinger van de rechterhand en druk met de rechterhand op de achterkant van de rat.
OPMERKING: Wegwerpnaalden mogen slechts eenmalig worden gebruikt. Omdat herhaald gebruik de naald zal stompen, wat leidt tot verhoogde pijn bij ratten. - Raak de depressie aan in het midden van de bovenrand (GV14) of de onderrand van het schouderblad (BL12 en BL13) en prik vervolgens voorzichtig de huid van de rat met de naaldpunt om de acupunten te lokaliseren.
- Plaats de naald snel na het bepalen van de specifieke locatie van het acupunt en verwijder snel de rechterhand.
- Draai de naalden ongeveer 360° gelijkmatig met een snelheid van 60 keer / min gedurende 10 - 20 s, manipuleer ze elke 5 minuten en trek ze vervolgens na 20 - 30 minuten terug (Aanvullende figuur 4).
4. De Penh-meting
- Bereid methacholine voor: Doe 100 mg methacholine in een centrifugebuis van 5 ml en voeg PBS toe aan een volume van 2 ml (50 mg/ml methacholine). Verdun vervolgens de 50 mg/ml methacholineoplossing tot 25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 6,25 mg/ml en 3,125 mg/ml.
- Instrumentinspectie
- Schakel de signaalversterker in (het aerosoldistributiesysteem en het knaagdier bias flow supply system zijn allemaal uitgeschakeld en de vernevelingsconnector is gesloten).
- Controleer de kanalen: Klik op Kalibreren,zet de grove instelbasislijn terug op 0 en schakel over naar de gelijkstroomstand (DC). Stem de uitgangswaarde af op 0 en injecteer 5 ml gas met een spuit. Schakel vervolgens over naar de wisselstroomstand (AC).
- Controleer na het controleren van de kanalen of de foutwaarde minder dan 0,5% is.
- Parameters instellen
- Schakel het aerosoldistributiesysteem en het knaagdier bias flow supply system in. Stel het debiet in op 4,5 ml volgens het vloeistofniveau op de kwikbol.
- Klik op Studieopties maken en selecteer Dosisresponsstudie, selecteer Rat van soort en klik op Volgende.
- Selecteer Lijst met eenvoudige doses, stel het aantal doses in op 6 en klik op Volgende.
- Selecteer de penh- en gebiedsparameters: Stel de aanpassingstijd van het dier in op 5 minuten, de vernevelingstijd op 2 minuten, de responstijd op 3 minuten en de hersteltijd op 2 minuten.
- Voeg achtereenvolgens de volgende oplossingen toe aan de vernevelaar (200 μL per rat): methacholine (0 mg/ml, 3,125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml en 50 mg/ml). Real-time veranderingen in Penh kunnen worden waargenomen (Figuur 4).
- Nadat alle 6 oplossingen met verschillende concentraties zijn gereageerd, klikt u op Bestand en Eindsessie om het experiment te voltooien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met acupunctuur op de GV14, bilaterale BL12 en bilaterale BL13 punten behoudt de rat een gevoelige positie. De rat kan zijn kop alleen naar buiten draaien en niet naar binnen omdat één richting is geblokkeerd met een houten plank (figuur 5).
Naarmate de methacholineconcentratie toenam, vertoont Penh een stijgende trend en neemt de groei geleidelijk toe. Bij concentraties van 3,125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml en 50 mg/ml, Penh steeg met 18,40% ± 10,70%, 27,55% ± 26,30%, 88,10% ± 45,63%, 427,60% ± 172,92% en 882,27% ±1.60%
Figuur 1. Fabricage van het hoge platform. Het hoge platform bestaat uit een ondersteunend apparaat, drie verbindingsapparaten en drie pedalen. De lengte en breedte van het steunapparaat zijn 86 cm x 17 cm, de lengte en breedte van het verbindingsapparaat zijn 30 cm x 14 cm, de lengte en breedte van het pedaal zijn 5 cm x 5 cm. Elk verbindingsapparaat is gescheiden door 20 cm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Protocol voor het vaststellen van een rattenmodel van astma. Sensibilisatie wordt uitgevoerd op dag 0 en acupunctuur wordt om de andere dag uitgevoerd op het hoge platform van dag 2 tot 14. Na uitdaging wordt de verandering in Penh gemeten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Anatomische posities van GV14 (Dazhui), BL12 (Fengmen), en BL13 (Feishu) op de ratten. (A) Anatomische dissectie van de rug van een rat met het schouderblad, de eerste rib, de tweede rib, de derde rib en de tweede thoracale wervel (T2). (B) Het sagittale vlak van de ribben en de borstwervel. (C) De doorsnede van het schouderblad. (D) GV14: Gelegen in de holte van het schouderblad, middellijn van de rug; BL13: Gelegen aan de onderrand van het schouderblad; BL12: Bevindt zich onder het schouderblad, geplaatst volgens BL13. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Real-time veranderingen in de ademhalingsfunctie. De blauwe curve toont real-time veranderingen in Penh. De groene curve toont de totale verandering in het getijdenvolume (TVb) over een bepaalde periode. De paarse curve toont de totale verandering in Penh over een bepaalde periode. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Acupunctuur van GV14 (Dazhui), BL12 (Fengmen), en BL13 (Feishu) bij ratten op het hoge platform. (A) Bovenaanzicht van de posities van GV14, BL12 en BL13 bij ratten. (B) Zijaanzicht van een acupunctuurrat op een hoog platform. De rat wordt op het platform geplaatst en tijdens de acupunctuur in de gevoelige positie gehouden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Meting van Penh. WBP wordt gebruikt om de Penh van de normale rat te meten. Naarmate de concentratie methacholine toeneemt, neemt de Penh ook geleidelijk toe. De gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullend figuur 1. De vernevelaar specificaties. De deeltjesgrootte van de samengeperste vernevelaar is 1 - 5 μm, de vernevelingssnelheid is groter dan 0,2 ml/min en de uiteindelijke druk is 205 kPa. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend figuur 2. De schematische posities van GV14 (Dazhui), BL12 (Fengmen), en BL13 (Feishu) in rat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend figuur 3. Naaldspecificaties. De lengte van de naald is 13 mm en de diameter is 0,3 mm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend figuur 4. Het schema van acupunctuurmanipulatie. Na het inbrengen van de naald hebben de naalden ongeveer 360° in verschillende richtingen gelijkmatig gedraaid. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De GV14, bilaterale BL12 en bilaterale BL13 acupoints die in deze studie worden gebruikt, bevinden zich aan de achterkant, en dus is het hoge platform geschikt voor het fixeren van ratten. In andere studies moet een adequate fixatiemethode worden gekozen op basis van de positie van de acupunten15. Voor acupunten op de buik kan de rat naar beneden worden geplaatst in een zwarte kegel (vergelijkbaar met een gebakzak die door bakkers wordt gebruikt)17. Een ketting is bevestigd aan de bevestigingskegel voor fixatie en het achterbeen van de rat is ook bevestigd. Op deze manier is de voorkant van het lichaam van het dier stevig bevestigd in de kegel, terwijl de buik en de rug worden blootgesteld. Voor acupunten op het been kan de rat verticaal in een speciale transparante emmer worden geplaatst, waardoor de staart en achterpoten van nature buiten de emmerblijven 18. Het transparante vat bedekt het lichaam van de rat, maar het is handig voor acupunctuur op het been.
Bij het uitvoeren van deze methoden moet rekening worden gehouden met verschillende kritieke stappen. Vóór de acupunctuurbehandeling moeten de ratten een paar dagen van tevoren op het hoge platform worden geplaatst om te trainen totdat de ratten stil blijven en soepel ademen op het hoge platform. Voor acupunctuurmanipulatie geldt: hoe harder de palm van de rechterhand de rat terugdrukt, hoe gemakkelijker het is om de naald in te brengen. Voor de meting van de ademhalingsfunctie meet het WBP-systeem veranderingen in de Penh die veranderingen in longweerstand van ratten op een niet-invasieve manier weerspiegelen en de effecten van psychologische stress minimaliseren19,20. Het effect van de externe omgeving op ratten moet worden geminimaliseerd. De rat moet in de testruimte worden geplaatst en vervolgens de testruimte worden bedekt met een plastic zak (met een gat van 1 cm x 1 cm aan de dorsale kant voor ventilatie) om de irritatie veroorzaakt door de externe omgeving te verminderen.
De beperking van dit experiment is dat de naald eraf kan vallen als de rat rondzwaait tijdens de acupunctuur. Daarom moet needling elke 5 minuten worden gemanipuleerd om de diepte aan te passen. Bovendien is het hoge platform geschikt voor ratten, maar niet voor kleinere dieren, zoals muizen.
Samengevat geven we een gedetailleerde beschrijving van de methode voor het fabriceren van een hoog platform voor het fixeren van ratten zonder beperking tijdens acupunctuur. Het hoge platform kan de acupunten op de achterkant van de rat volledig blootleggen. Het gebruik van het hoge platform en niet-invasieve ademhalingsfunctiemetingen kan de analyse van acupunctuur als behandeling voor astma vergemakkelijken. Het bestuderen van het therapeutische mechanisme van acupunctuur op de rug kan nieuwe behandelingen brengen voor aandoeningen van de luchtwegen zoals astma en chronische obstructieve longziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 81922076, 81973951, 81873373), Bouwproject van collaboratieve innovatie van Shanghai (nr. ZYJKFW201811010, ZYJKFW201701005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mm x 13.0 mm acupuncture needle | China Suzhou Medical Device Factory | ||
| Al(OH)3 | American Thermo | 77161 | |
| Compression nebulizer | Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd. | NB-212C | |
| Fine Pointe V2.0 | American Buxco | ||
| Laboratory gas drying unit | American Drierite | 26800 | |
| Methacholine | American Sigma | MKCF6054 | |
| Ovalbumin | American Sigma | A5503-25G | |
| Phosphate Buffer solution (1x) | Gelifesciences | SH30256.01 | |
| Seal box | IRIS Corporation of Japan | ||
| Whole-body plethysmography respiratory function measurement system | American Buxco |
References
- Papi, A., Brightling, C., Pedersen, S. E., Reddel, H. K.
- Global Initiative for Asthma, 2019. Global strategy for asthma management and prevention. , Available from: https://ginasthma.org/gina-reports/ (2019).
- Enilari, O., Sinha, S. The Global Impact of Asthma in Adult Populations. Annals of Global Health. 85 (1), (2019).
- Global Initiative for Asthma, 2020. Global strategy for asthma management and prevention. , Available from: https://ginasthma.org/gina-reports/ (2020).
- Zhuang, Y., Xing, J. J., Li, J., Zeng, B. Y., Liang, F. R.
- Yang, Y. Q., et al. Considerations for use of acupuncture as supplemental therapy for patients with allergic asthma. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 44 (3), 254-261 (2013).
- Nurwati, I., et al. Reduction of interleukin-17 level by acupuncture at Feishu (BL13) is strengthened by acupuncture at Zusanli (ST36) in a mouse model of chronic asthma: An experimental study. Medical Acupuncture. 27 (4), 278-282 (2015).
- Nurwati, I., et al. Improvement in inflammation and airway remodelling after acupuncture at BL13 and ST36 in a mouse model of chronic asthma. Acupuncture in Medicine. 37 (4), 228-236 (2019).
- Reddy, A. T., Lakshmi, S. P., Reddy, R. C. Murine model of allergen induced asthma. Journal of Visualized Experiments. (63), e3771 (2012).
- Zhou, D. D., et al. Metallothionein-2 is associated with the amelioration of asthmatic pulmonary function by acupuncture through protein phosphorylation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 123, 109785 (2020).
- Yin, L. M., et al. Transgelin-2 as a therapeutic target for asthmatic pulmonary resistance. Science Translational Medicine. 10 (427), (2018).
- Shin, Y. S., Takeda, K., Gelfand, E. W. Understanding asthma using animal models. Allergy Asthma & Immunology Research. 1 (1), 10-18 (2009).
- Cui, K. M., et al. Electro-acupuncture relieves chronic visceral hyperalgesia in rats. Neuroscience Letters. 376 (1), 20-23 (2005).
- Tobin, J. R., Martin, L. D., Breslow, M. J., Traystman, R. J. Selective anesthetic inhibition of brain nitric oxide synthase. Anesthesiology. 81 (5), 1264-1269 (1994).
- Dimitrov, N., Sivrev, D., Atanasova, D. Method of rat immobilization during experimental acupuncture. Scripta Scientifica Medica. 45, 105-108 (2013).
- Aguilar, R., et al. emotional reactivity and fear of heights: a factor analytic map from a large F(2) intercross of Roman rat strains. Brain Research Bulletin. 57 (2), 17-26 (2002).
- Lai, X., et al. Proteomic response to acupuncture treatment in spontaneously hypertensive rats. PloS One. 7 (9), 44216 (2012).
- Niu, C., et al. A novel uni-acupoint electroacupuncture stimulation method for pain relief. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2011, 209879 (2011).
- McFadden, E. R., Luparello, T., Lyons, H. A., Bleecker, E. The mechanism of action of suggestion in the induction of acute asthma attacks. Psychosomatic Medicine. 31 (2), 134-143 (1969).
- Savov, J. D., et al. Ozone-induced acute pulmonary injury in inbred mouse strains. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 69-77 (2004).
