هنا نقدم طريقة إزالة الأنسجة الكارهة للماء التي تسمح بعرض الجزيئات المستهدفة كجزء من هياكل الدماغ السليمة. وقد تم الآن التحقق من صحة هذه التقنية للسيطرة F344/N والجرذان المعدلة وراثيا فيروس نقص المناعة البشرية-1 من كلا الجنسين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة إزالة الأنسجة الكارهة للماء لأنسجة دماغ الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
طرق إزالة الأنسجة الكارهة للماء قابلة للتعديل بسهولة وسريعة ومنخفضة التكلفة تسمح بدراسة جزيء مهم في عينات الأنسجة دون تغيير. تتطلب إجراءات وضع العلامات المناعية التقليدية قطع العينة إلى أقسام رقيقة ، مما يحد من القدرة على تسمية وفحص الهياكل السليمة. ومع ذلك، إذا كان يمكن أن تظل أنسجة الدماغ سليمة أثناء المعالجة، يمكن أن تظل الهياكل والدوائر سليمة للتحليل. تستغرق طرق التطهير التي تم إنشاؤها سابقا وقتا طويلا لتطهير الأنسجة تماما ، ويمكن أن تلحق المواد الكيميائية القاسية أضرارا بالأجسام المضادة الحساسة في كثير من الأحيان. طريقة iDISCO بسرعة وتماما مسح الأنسجة، متوافق مع العديد من الأجسام المضادة، ويتطلب أي معدات مختبر خاص. تم التحقق من صحة هذه التقنية في البداية لاستخدامها في أنسجة الفئران ، ولكن البروتوكول الحالي يكيف هذه الطريقة لتصوير نصفي الكرة الأرضية للتحكم وأدمغة الفئران المعدلة وراثيا. بالإضافة إلى ذلك، يقوم هذا البروتوكول أيضا بإجراء تعديلات عديدة على البروتوكول الموجود مسبقا لتوفير صور أوضح مع تلطيخ أقل للخلفية. تم التحقق من صحة الأجسام المضادة لIba-1 والتيروزين هيدروكسيلاز في الفئران المعدلة وراثيا HIV-1 وفي فئران التحكم F344/N باستخدام طريقة إزالة الأنسجة الكارهة للماء الحالية. الدماغ هو شبكة متشابكة، حيث تعمل الهياكل معا في كثير من الأحيان أكثر من منفصلة عن بعضها البعض. تحليل الدماغ ككل بدلا من نظام مزيج من القطع الفردية هو أكبر فائدة من هذا الأسلوب تطهير الدماغ كله.
المقدمة
وقد تم التحقق من صحة العديد من تقنيات إزالة الأنسجة للاستخدام في الدماغ: الهيدروجيل، والهيدروفيلي، والماء. وتهدف هذه التقنيات لتحويل نسيج شفاف من خلال delipidation، إزالة اللون، والشارات عن طريق إدارة المذيبات. بمجرد أن يطابق مؤشر الانكسار لعينة الأنسجة مؤشر الانكسار لوسط التصوير المختار ، يمكن الحصول على صورة واضحة للعينة. تقنيات هيدروجيل القائمة، مثل وضوح، الجزيئات الحيوية آمنة في الأنسجة عن طريق ربطها إلى الهيدروجيلات المستندة إلى الأكرييل، والذي يمنع الضرر الهيكلي وفقدان البروتينات1. ومع ذلك، تستخدم تقنيات الهيدروجيل مواد كيميائية قاسية من القدرة على إتلاف الأنسجة الأكثر هشاشة، وقد لا تكون عينات الأنسجة الأكثر كثافة متوافقة مع بروتوكول الهي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم مراجعة جميع بروتوكولات الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدامه في جامعة كارولينا الجنوبية.
1. إعداد حل المخزون
- الحل 1 (1 لتر): إلى 900 مل من H2O deionized إضافة 100 مل من 10x فوسفات المالحة المخزنة مؤقتا (PBS) و 2 مل من تريتون X-100.
- الحل 2 (1 لتر): إلى 900 مل من H2O deionized، أضف 100 مل من 10x PBS، 2mL من Tween-20 و 1 مل من محلول مخزون 10 ملغم/مل هيبارين.
- الحل 3 (500 مل): إلى 400 مل من الحل 1، أضف 11.5 غرام من الجليسين و100 مل من ثنائي ميثيل سلف أكسيد (DMSO).
- الحل 4 (50 مل): إلى 42 مل من الحل 1، أضف 3 مل من المصل المقابل و5 مل من DMSO.
- حل الأج....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم تحقيق التطهير الكامل للأقسام الكبيرة من كل من F344/N وأنسجة دماغ الفئران HIV-1 باستخدام بروتوكول إزالة الأنسجة الكارهة للماء المعدل هذا. يعرض الشكل 1 صورة كونفوجال نموذجية ل TH في منطقة نيغرا تحتستانتيا. يمثل الشكل 1A تلطيخا إيجابيا كثيفا. يمكن تحليل المناطق الكثيفة مثل هذه من خلال التركيز من خلال الطائرة "Z" لتأكيد تلطيخ إيجابي ومورفولوجيا الخلايا المناسبة. يمثل الشكل 1B تلطيخ إيجابي متفرق ، والتي يمكن تحديدها من قبل مورفولوجيا .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوفر تطهير الأنسجة حلا لقيود بروتوكول IHC التقليدي. عينة شفافة تقلل من تشتت وامتصاص الضوء ، والتي توفر الوصول البصري على المستوى الخلوي إلى الأنسجة السليمة18،19. تقنيات إزالة الأنسجة تحويل نسيج شفاف من خلال delipidation، إزالة اللون، والشارات مع إدارة المذيبات. بمجرد أن يطابق مؤشر الانكسار لعينة الأنسجة مؤشر الانكسار لوسط التصوير المختار ، ستظهر العينة شفافة تماما ويمكن تصويرها بشكل صحيح3. البروتوكول الحالي الكاره للماء يزيل الماء من الأنس.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يوجد لدى أي من أصحاب البلاغ تضارب في المصالح للإعلان عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من منح المعاهد القومية للصحة: NS100624، DA013137، HD043680، MH106392 & amp؛ بواسطة T32 منحة التدريب 5T32GM081740
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| توكسين الكوليرا الوحدة الفرعية B (المؤتلف) ، Alexa Fluor 488 | Invitrogen | C34775 | |
| DBE | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| DCM | Sigma-Aldrich | 270997-100mL | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-1L | |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-500 | |
| الماعز المضاد للأرانب Alexa Fluor Plus 647 | Invitrogen | A32733 | |
| مصل الماعز | Sigma Life Science | G9023-10mL | |
| Heparin | Acros Organics | 41121-0010 | |
| Iba1 الجسم المضاد الأساسي | FUJIFILM Wako | 019-19741 | |
| Kwik-sil الايبوكسي | VWR | 70730-062 | |
| الميثانول | سيجما ألدريتش | 34860-1l-R | |
| PBS | كواشف فيشر الحيوية | BP2944-100 | |
| آلة التروية | VWR | 70730-062 | مضخة صغيرة متغيرة التدفق |
| PFA | سيجما ألدريتش | 158127-3KG | |
| TH الجسم المضاد الأساسي | Millipore Sigma | AB152 | |
| TritonX-100 | Fisher Biorecodes | BP151-500 | |
| Tween-20 | Fisher Bioreagents | بي ت 337-500 |
المراجع
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
