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Engineering

फ्लो और स्ट्रेच के तहत बायोमैटेरियल्स की भड़काऊ और पुनर्योजी क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक बहु-क्यू बायोरिएक्टर

Published: December 10, 2020 doi: 10.3791/61824
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1, 1,2, *1,2, *1,2
1Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems (ICMS), Eindhoven University of Technology
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक बायोरिएक्टर का उपयोग करके सामग्री-संचालित ऊतक उत्थान की जांच करने के लिए ट्यूबलर इलेक्ट्रोस्पन मचान में मानव मैक्रोफेज और मायोफिब्रोब्लास्ट की एक गतिशील सह-संस्कृति को निष्पादित करना है, जो कतरनी तनाव और चक्रीय खिंचाव के वियुग्मन को सक्षम बनाता है।

Abstract

शरीर में सीधे पुनर्जनन को प्रेरित करने के लिए पुनर्संरभीय बायोमैटेरियल्स का उपयोग अनुवादात्मक परिप्रेक्ष्य से एक आकर्षक रणनीति है। इस तरह की सामग्री प्रत्यारोपण पर एक भड़काऊ प्रतिक्रिया प्रेरित करती है, जो सामग्री के बाद के अवशोषण और नए ऊतकों के उत्थान का चालक है। इस रणनीति, भी सीटू ऊतक इंजीनियरिंग में के रूप में जाना जाता है, इस तरह के ऊतक इंजीनियर संवहनी कलम के रूप में हृदय प्रतिस्थापन प्राप्त करने के लिए पीछा किया है । भड़काऊ और पुनर्योजी प्रक्रियाओं दोनों पाड़ (यानी, खिंचाव और कतरनी तनाव) पर स्थानीय बायोमैकेनिकल संकेतों द्वारा निर्धारित किए जाते हैं। यहां, हम विस्तार से एक कस्टम-विकसित बायोरिएक्टर के उपयोग का वर्णन करते हैं जो विशिष्ट रूप से एक ट्यूबलर पाड़ पर खिंचाव और कतरनी तनाव के वियुग्मन को सक्षम बनाता है। यह अच्छी तरह से नियंत्रित यांत्रिक भार के प्रभाव में ट्यूबलर मचान की भड़काऊ और पुनर्योजी क्षमता के व्यवस्थित और मानकीकृत मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, जिसे हम मानव मैक्रोफेज और माइफिलास्ट का उपयोग करके एक गतिशील सह-संस्कृति प्रयोग के आधार पर प्रदर्शित करते हैं। इस दृष्टिकोण में प्रमुख व्यावहारिक कदम- बायोरिएक्टर का निर्माण और स्थापना, मचान और सेल सीडिंग की तैयारी, खिंचाव और कतरनी प्रवाह के आवेदन और रखरखाव, और विश्लेषण के लिए नमूना संचयन- पर विस्तार से चर्चा की गई है।

Introduction

हृदय ऊतक इंजीनियरिंग (टीई) को वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले स्थायी हृदय कृत्रिम अंग (जैसे, संवहनी ग्राफ्ट, हार्ट वाल्व प्रतिस्थापन) के लिए एक वैकल्पिक उपचार विकल्प के रूप में आगे बढ़ाया जा रहा है, जो रोगियों के बड़े साथियों के लिए उप-सुशोथहैं 1,2,3,4। बहुत से मांग वाले अनुप्रयोगों में ऊतक-इंजीनियर वैस्कुलर ग्राफ्ट (तेवग)5,6 और हार्ट वाल्व (तेवी)7,8शामिल हैं। अक्सर, हृदय ते पद्धतियां पुन: प्राप्त जैव सामग्री (या तो प्राकृतिक या सिंथेटिक) का उपयोग करती हैं जो नए ऊतकों के गठन के लिए एक शिक्षाप्रद पाड़ के रूप में काम करती हैं। नए ऊतकों के गठन को या तो पूरी तरह से विट्रो में इंजीनियर किया जा सकता है, प्रत्यारोपण से पहले एक बायोरिएक्टर में कोशिकाओं और खेती के साथ पाड़ बोने से (इन विट्रोते) 9,10,11,या सीधे सीटू में, जिसमें सिंथेटिक पाड़ को शरीर में सीधे नए ऊतकों के गठन को प्रेरित करने के लिए प्रत्यारोपित किया जाता है (सीटू ते में)12,1314 4। दोनों इन विट्रो और सीटू हृदय ते दृष्टिकोणों के लिए, सफल कार्यात्मक उत्थान मुख्य रूप से प्रत्यारोपित निर्माण और उचित बायोमैकेनिकल लोडिंग के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया दोनों पर निर्भर है।

हृदय ते के लिए जैव यांत्रिक लोडिंग का महत्व अच्छी तरह से स्वीकार किया है15। हृदय प्रत्यारोपण के मामले में, पाड़ को आबाद करने वाली कोशिकाएं चक्रीय खिंचाव और कतरनी तनावों के संपर्क में आती हैं जो हीमोडायनामिक वातावरण के परिणामस्वरूप उत्पन्न होती हैं। कई अध्ययनों ने मैट्रिक्स घटकों के गठन पर (चक्रीय) खिंचाव के उत्तेजक प्रभाव की सूचना दी है, जैसे कोलेजन16,17,18,19,ग्लाइकोसामिनोग्लिकन (जीएजी)20,और इलास्टिन21,22,विभिन्न सेल प्रकारों द्वारा। उदाहरण के लिए, हुआंग एट अल ने दिखा दिया कि बाइक्सियल खिंचाव ने एक संवहनी बायोरिएक्टर23का उपयोग करके कोलेजन और इलास्टिन इन विट्रो तेवग्स में जमाव और इलास्टिन के संगठन को ऊंचा किया। जबकि जोर आम तौर पर प्रमुख भार के रूप में खिंचाव पर निहित है, ये अध्ययन अक्सर प्रवाह-चालित बायोरिएक्टर का उपयोग करते हैं जिसमें नमूना कतरनी प्रवाह के संपर्क में भी आता है। हालांकि अपेक्षाकृत कम ऊतक गठन और 3 डी में सूजन पर कतरनी तनाव के अलग प्रभाव के बारे में जाना जाता है, कुछ डेटा उपलब्ध हैं । उदाहरण के लिए, इन्टर एट अल और ईओएच एट अल ने दिखा दिया कि 3 डी पाड़ माइक्रोस्ट्रक्चर के अलावा कतरनी प्रवाह, इन विट्रो मॉडल सिस्टम24, 25में मानव संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं द्वारा परिपक्व इलास्टिनके गठनके लिए महत्वपूर्ण था। कुल मिलाकर, इन निष्कर्षों दोनों चक्रीय खिंचाव और हृदय ते के लिए कतरनी तनाव की प्रासंगिकता वर्णन ।

सफलता या ते प्रत्यारोपण की विफलता के लिए एक और महत्वपूर्ण निर्धारक प्रत्यारोपित भ्रष्टाचार26के लिए मेजबान की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है । यह विशेष रूप से सामग्री के लिए महत्वपूर्ण है-सीटू ते रणनीतियों में संचालित है, जो वास्तव में पाड़ के लिए तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया पर भरोसा करने के लिए सेलुलर बाढ़ और अंतर्जात ऊतक गठन और27remodeling की बाद की प्रक्रियाओं किकस्टार्ट । मैक्रोफेज कार्यात्मक ऊतक उत्थान का एक महत्वपूर्ण सर्जक है, जिसे कई अध्ययनों द्वारा28,29,30से दिखाया गया है। घाव भरने के अनुरूप, ऊतक का पुनर्जनन मैक्रोफेज और ऊतक उत्पादक कोशिकाओं जैसे फाइब्रोब्लास्ट और माइफिलोब्लास्ट31,32, 33के बीच पैराक्रिन सिग्नलिंग द्वारानियंत्रितहोता है। नए ऊतक जमाव के समन्वय के अलावा, मैक्रोफेज विदेशी पाड़ सामग्री34, 35के सक्रिय अवशोषण में शामिल हैं। इस प्रकार, बायोमैटेरियल के लिए इन विट्रो मैक्रोफेज प्रतिक्रिया को प्रत्यारोपण36, 37, 38की वीवो सफलता के लिए एक भविष्य कहनेवाला पैरामीटर के रूप मेंपहचानागया है।

प्रत्यारोपित पाड़ के प्रति मैक्रोफेज प्रतिक्रिया पाड़ डिजाइन सुविधाओं जैसे सामग्री संरचना और माइक्रोस्ट्रक्चर35,39,40पर निर्भर करती है। पाड़ गुणों के अलावा, एक पाड़ के लिए मैक्रोफेज प्रतिक्रिया और माइफिब्रोब्लास्ट के साथ उनकी क्रॉसटॉक भी हेमोडायनामिक भार से प्रभावित होती है। उदाहरण के लिए, चक्रीय खंड को मैक्रोफेज फेनोटाइप41, 42, 43, 44और साइटोकिन्स43,44,45, 46 में 3 डी इलेक्ट्रोस्पन मचान में एक महत्वपूर्ण मॉड्यूलर दिखाया गया था। मैक्रोफेज और वैस्कुलर चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की सह-संस्कृति प्रणाली का उपयोग करते हुए, बतिस्तन एट अल ने दिखा दिया कि मैक्रोफेज की उपस्थिति के कारण इलास्टिन और जीएजी का स्तर बढ़ गया और चक्रीय खिंचाव (1.07-1.10) के मध्यम स्तर ने कोलेजन I और इलास्टिन47के जमाव को प्रेरित किया। पिछले कार्यों में, हमने दिखा दिया है कि कतरनी तनाव 3 डी इलेक्ट्रोस्पन मचान48, 49में मोनोसाइट भर्ती के लिए एक महत्वपूर्ण निर्धारक है, और कतरनी तनाव और चक्रीय खिंचाव दोनों मानव मोनोसाइट्स और मेसेन्ची स्ट्रोमल कोशिकाओं के बीच पैराक्राइन सिग्नलिंग को प्रभावित करते हैं50। फही एट अल ने दिखा दिया कि कतरनी प्रवाह ने मानव मोनोसाइट्स51द्वारा समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के स्राव को बढ़ा दिया।

एक साथ लिया, उपरोक्त साक्ष्य से पता चलता है कि हृदय ते के लिए हीमोडायनामिक भार पर पर्याप्त समझ और नियंत्रण महत्वपूर्ण है, और इसे प्राप्त करने के लिए भड़काऊ प्रतिक्रिया पर विचार करना महत्वपूर्ण है। इन विट्रो52, 53, 54, 55,56,57,58या पूर्ववीवो59, 60, 61हृदय ऊतकों की संस्कृति के लिए पहले कई बायोरिएक्टर का वर्णन किया गया है। हालांकि, इन सभी प्रणालियों को जितना संभव हो शारीरिक हीमोडायनामिक लोडिंग स्थितियों की नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। हालांकि यह विट्रो में हृदय ऊतकों को बनाने या पूर्व वीवो संस्कृतियों को बनाए रखने के उद्देश्य से अत्यधिक मूल्यवान है, ऐसी प्रणालियां व्यक्तिगत संकेतों के व्यक्तिगत प्रभावों में व्यवस्थित अध्ययन के लिए अनुमति नहीं देती हैं। इसका कारण यह है कि इन बायोरिएक्टरों में चक्रीय खिंचाव और कतरनी तनाव दोनों का अनुप्रयोग एक ही दबाव वाले प्रवाह से प्रेरित होता है, जो आंतरिक रूप से उन्हें जोड़ता है। जबकि सटीक मल्टी-क्यू मैकेनिकल हेरफेर के लिए अनुमति देने वाले माइक्रोसिस्टम्स को 2डी सब्सट्रेट्स62 या 3डी हाइड्रोगेल सेटअप63,64के लिए वर्णित किया गया है, ऐसे सेटअप इलास्टोमेरिक 3डी बायोमैटेरियल मचानों के समावेश के लिए अनुमति नहीं देते हैं।

यहां, हम एक ट्यूबलर बायोरिएक्टर प्रणाली का अनुप्रयोग प्रस्तुत करते हैं जो विशिष्ट रूप से कतरनी तनाव और चक्रीय खिंचाव के वियुग्मन को सक्षम बनाता है और उनके व्यक्तिगत और संयुक्त प्रभावों की जांच करने में मदद करता है। यह प्रणाली ऊतक इंजीनियर संवहनी ग्राफ्ट (जैसे, सिंथेटिक या प्राकृतिक मूल, विभिन्न सूक्ष्म वास्तुकला, विभिन्न छिद्रों) की एक विस्तृत विविधता के परीक्षण के लिए अनुमति देती है। कतरनी तनाव और खिंचाव के आवेदन को प्रभावी ढंग से अलग करने के लिए, बायोरिएक्टर का उपयोग करने वाली प्रमुख अवधारणाएं (1) कतरनी तनाव के नियंत्रण और खिंचाव के अलग-अलग होते हैं और कम्प्यूटेशनली रूप से संचालित आयामों के साथ 'इनसाइड-आउट' तरीके से मचानों की उत्तेजना होती है। प्रवाह को प्रवाह पंप के उपयोग के माध्यम से ट्यूबलर पाड़ की बाहरी सतह पर लागू किया जाता है, जबकि पाड़ का परिवर्ती खिंचाव एक सिलिकॉन ट्यूब का विस्तार करके प्रेरित होता है जिस पर पाड़ को एक अलग तनाव पंप के उपयोग के माध्यम से रखा जाता है। सिलिकॉन ट्यूब और ग्लास ट्यूब के आयाम जिसमें निर्माण होता है, को कम्प्यूटेशनल द्रव गतिशीलता सिमुलेशन का उपयोग करके सावधानीपूर्वक चुना और मान्य किया जाता है, ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पाड़ पर कतरनी तनाव (प्रवाह के कारण) और परिधि खिंचाव (ट्यूब विस्तार के कारण) एक दूसरे को काफी प्रभावित नहीं करते हैं। इस इनसाइड-आउट डिजाइन में कई व्यावहारिक तर्क हैं। यदि खिंचाव चमकदार द्रव दबाव (शारीरिक लोडिंग के समान) द्वारा लागू किया जाता है, तो स्वाभाविक रूप से नमूना डिजाइन को रिसाव मुक्त होने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, नमूना खिंचाव के लिए आवश्यक दबाव पूरी तरह से नमूना कठोरता द्वारा निर्धारित किया जाएगा, जो नमूनों के बीच और समय के साथ एक नमूने के भीतर भिन्न हो सकता है, जिससे खिंचाव को नियंत्रित करना मुश्किल हो जाता है। यह बायोरिएक्टर एक सिलिकॉन ट्यूब के चारों ओर ऊतक इंजीनियर भ्रष्टाचार माउंट करता है और भ्रष्टाचार की बाहरी दीवार पर दीवार कतरनी तनाव (डब्ल्यूएसएस) आवेदन के लिए अनुमति देता है और अंदर से भ्रष्टाचार पर दबाव बनाता है। इस तरह, समय के साथ नमूनों और नमूनों के बीच समान लोडिंग की स्थिति सुनिश्चित की जा सकती है, और इसके अलावा, नमूनों को टपका हुआ होने की अनुमति है, जैसा कि असुरक्षित संवहनी मचान19के लिए आम है। यह इनसाइड-आउट बायोरिएक्टर विशेष रूप से शेरनी और/या खिंचाव के प्रभावों पर व्यवस्थित अध्ययन के लिए है, बजाय विट्रो में देशी जैसे रक्त वाहिका की इंजीनियरिंग, जिसके लिए पारंपरिक संवहनी बायोरिएक्टर सेटअप अधिक उपयुक्त हैं । बायोरिएक्टर डिजाइन चित्रों के लिए चित्र 1ए-बी देखें, और बायोरिएक्टर के मुख्य घटकों के पीछे एक कार्यात्मक विवरण और तर्क के लिए इसकी संबंधित तालिका 1।

बायोरिएक्टर का उपयोग हमारे समूह द्वारा हाल के अध्ययनों की एक श्रृंखला के आधार पर किया जाता है जिसमें हमने सीटू हृदय ऊतक19,43,44में पुनः विद्युत क्रड़ों में सूजन और ऊतक गठन पर कतरनी तनाव और चक्रीय खिंचाव के व्यक्तिगत और संयुक्त प्रभावों की जांच की। इस उद्देश्य के लिए, हमने मानव मैक्रोफेज और माइोफीब्रोब्लास्ट का उपयोग मोनो-या सह-संस्कृति में किया ताकि सीटू पुनर्योजी झरना के विभिन्न चरणों का अनुकरण किया जा सके। हमने दिखा दिया है कि मानव मैक्रोफेज द्वारा साइटोकिन स्राव चक्रीय खिंचाव और कतरनी तनाव दोनों से स्पष्ट रूप से प्रभावित होता है, जो इन मचानों में मानव माइफिलास्ट द्वारा मैट्रिक्स जमाव और संगठन को प्रभावित करता है, दोनों पैराक्रिन सिग्नलिंग और सीधे संपर्क19,43,44के माध्यम से। विशेष रूप से, इन अध्ययनों से पता चला है कि कतरनी तनाव और खिंचाव के संयुक्त आवेदन के मामले में, ऊतक गठन और सूजन पर प्रभाव या तो दो भार में से एक का प्रभुत्व है, या दोनों भार के सहक्रियात्मक प्रभाव हैं । ये निष्कर्ष टीई प्रक्रियाओं पर यांत्रिक वातावरण के योगदान की बेहतर समझ हासिल करने के लिए दोनों भारों को वियुग्मन करने की प्रासंगिकता को दर्शाते हैं। यह समझ प्रासंगिक हीमोडायनामिक लोडिंग व्यवस्थाओं में पाड़ डिजाइन मापदंडों को व्यवस्थित रूप से अनुकूलित करने के लिए लागू की जा सकती है। इसके अलावा, इस तरह के अच्छी तरह से नियंत्रित वातावरण से यंत्रवादी डेटा संख्यात्मक मॉडल है कि सीटू ऊतक remodeling में के पाठ्यक्रम की भविष्यवाणी करने के लिए विकसित किया जा रहा है के लिए इनपुट के रूप में काम कर सकते हैं, के रूप में हाल ही में TEVGs६५ या TEHVs६६के लिए रिपोर्ट, आगे भविष्य कहनेवाला क्षमता में सुधार करने के लिए ।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित अध्ययनों में, कोरोनरी बाय-पास सर्जरी के बाद सैफेनस नस से अलग परिधीय रक्त बफी कोट और मानव माइफिनब्रोब्लास्ट से अलग प्राथमिक मानव मैक्रोफेज का उपयोग44किया गया है। बफी कोट स्वस्थ, अनाम स्वयंसेवकों से प्राप्त किए गए थे जिन्होंने लिखित सूचित सहमति प्रदान की थी, जिसे सैनक्विन रिसर्च इंस्टीट्यूशनल मेडिकल एथिकल कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था । मानव वेना सफेना कोशिकाओं (एचवीएससी) का उपयोग नीदरलैंड में फेडरेशन ऑफ मेडिकल सोसाइटीज (एफएमडब्ल्यूवी) द्वारा विकसित "कोड उचित माध्यमिक मानव ऊतक का उपयोग" के अनुसार था।

1. बायोरिएक्टर की स्थापना से पहले सामान्य तैयारी और आवश्यक कार्रवाई

नोट: संबंधित अलगाव और खेती प्रोटोकॉल के बारे में जानकारी के लिए, कृपया पहले के काम19,43,44का उल्लेख करें। प्रोटोकॉल में सभी गणनाएं मोनोसाइट्स और मायोफिब्रोब्लास्ट के साथ सह-संस्कृति प्रयोग के लिए उदाहरण के रूप में दी जाती हैं, जो 8 हेमोडायनामिक रूप से लोडेड मचान और 2 स्थिर नियंत्रण (एन = 10) में वरीयता प्राप्त हैं।

  1. सेल अलगाव और सेल संस्कृति शुरू करें। मोनोसाइट्स और माइफिब्रोब्लास्ट (2:1 के सीडिंग अनुपात के साथ) के सह-सुसंस्कृत नमूनों के लिए सीडिंग घनत्व क्रमशः 30 ×10 6 मोनोसाइट्स/सेमी3 और 15 × 106 मायोफिब्रोब्लास्ट/सेमी3हैं ।
    नोट: इलेक्ट्रोस्पन सामग्री में उच्च पॉर्सिटी (>90%) है। प्रति भ्रष्टाचार कोशिकाओं की आवश्यक संख्या का अनुमान लगाने के लिए, पाड़ की मात्रा की गणना खोखले सिलेंडर की मात्रा के सूत्र के साथ की जाती है: π *(मोटाई) 2* लंबाई ≈ 0.04 सेमी3। प्रति भ्रष्टाचार कोशिकाओं की कुल मात्रा 1.2 × 106 मोनोसाइट्स और 0.6 × 106 माईऑफिब्रोब्लास्ट है। 10 नमूनों के लिए, कम से कम 12 × 106 मोनोसाइट्स और 6 ×10 6 माईफिब्रोब्लास्ट की आवश्यकता होती है; संभव पाइपिंग त्रुटियों के लिए खाते में ~ 10-15% अधिक कोशिकाओं के साथ शुरू करें।
  2. डेगास सेल कल्चर मीडियम जिसका इस्तेमाल बायोरिएक्टर से जुड़े प्रयोगों के लिए किया जाएगा ।
    1. सह-संस्कृतियों के लिए माध्यम तैयार करें, जिसमें आरपीएमआई-1640: एडीईएम (1:1), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.5% एल-ग्लूटामाइन के साथ पूरक होता है।
    2. मध्यम रात भर (O/N) को एक सेल कल्चर फ्लास्क में फिल्टर कैप से डेगास में रखें ।
    3. फिल्टर कैप को एयर टाइट कैप से बदलें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. उपयोग से ठीक पहले, माध्यम में 0.25 मिलीग्राम/एमएल एल-एस्कॉर्बिक एसिड 2-फॉस्फेट (विटामिन सी) जोड़ें।
      नोट: गणना के लिए, प्रति प्रवाह संस्कृति कक्ष आवश्यक मध्यम की मात्रा 50 मिलीएल है। प्रति सप्ताह तीन बार माध्यम को ताज़ा करें; 25 एमएल ओल्ड मीडियम की जगह 25 एमएल फ्रेश मीडियम है। 10 नमूनों के लिए; सीडिंग के बाद, कुल 500 एमएल ताजा माध्यम की आवश्यकता होती है, और प्रत्येक बाद के मध्यम परिवर्तन के लिए, कुल 250 एमएल ताजा माध्यम का उपयोग किया जाता है। मीडियम को हमेशा तैयार करें, खासकर मीडियम बदलने से ठीक पहले विटामिन सी को जोड़ा जाना चाहिए।
  3. वैन हाफटेन एट अल19 (चित्रा1जी-आई)द्वारा वर्णित आइसोट्रोपिक इलेक्ट्रोस्पन मचान (3 मिमी ल्यूमिनल व्यास, 200 माइक्रोन वॉल मोटाई) तैयार करें। संक्षेप में, ट्यूबलर पॉलीकैप्रोलैक्टोन बिसिओरिया (पीसीएल-बीयू) मचान 15% (w/w) क्लोरोफॉर्म-बहुलक समाधानों से इलेक्ट्रोस्पिनिंग द्वारा उत्पादित किए जाते हैं। बहुलक समाधान कमरे के तापमान पर इलेक्ट्रोस्पन और 30% सापेक्ष आर्द्रता, 40 माइक्रोल/मिनट की प्रवाह दर पर, घूर्णन बेलनाकार लक्ष्य (ø 3 मिमी, 500 आरपीएम) से 16 सेमी दूरी पर और इलेक्ट्रोस्पिनिंग नोजल पर 16 केवी का एक लागू वोल्टेज और लक्ष्य पर -1 केवी हैं।
    नोट: हालांकि पीसीएल-बीयू ग्राफ्ट का उपयोग इन प्रयोगों के लिए किया गया था, लेकिन इस बायोरिएक्टर (उदाहरण के लिए, विभिन्न सिंथेटिक या प्राकृतिक मूल, विभिन्न माइक्रोआर्किटचर, विभिन्न छिद्रों) में इलास्टोमेरिक ऊतक इंजीनियर ग्राफ्ट की एक विस्तृत विविधता को रखा जा सकता है
    1. मंड्रल से इलेक्ट्रोस्पन मचान निकालें।
      1. केंद्र में मंड्रेल को 'पकड़'ने के लिए 15 एमएल ट्यूब की टोपी में एक छोटा छेद बनाएं और इसे ट्यूब की दीवार को छूने से रोकें।
      2. फाल्कन ट्यूब में इलेक्ट्रोस्पन पाड़ के साथ मांड्रल रखें और इसे डिएक्रिड पानी से भरें।
      3. ट्यूबों को -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
      4. ट्यूबों को कमरे के तापमान (आरटी) पर रखें और कुछ मिनटों के बाद मैंड्रेल्स को बाहर निकालें, जिससे इलेक्ट्रोस्पन ग्राफ्ट बर्फ में आ गया।
      5. बर्फ को पूरी तरह से पिघलने दें, गल गए पानी से इलेक्ट्रोस्पन ट्यूब को हटा दें, और कई घंटों तक खड़ी सूखने के लिए 'लटका' करें। सुनिश्चित करें कि मचान अपने वजन के तहत 'पतन' नहीं करते हैं।
    2. वैक्यूम ओ/एन के तहत सूखी मचान ।
    3. छवि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) का उपयोग करके इलेक्ट्रोस्पन ग्राफ्ट का एक छोटा सा नमूना उनके माइक्रोस्कोप (जैसे, फाइबर आकृति विज्ञान, फाइबर व्यास) का आकलन करने के लिए। उदाहरण अध्ययनों में ग्राफ्ट में एक आइसोट्रोपिक फाइबर ओरिएंटेशन और 5 माइक्रोन(चित्रा 1एच-I)का फाइबर व्यास है।
  4. प्रयोग शुरू करने से एक दिन पहले, इनक्यूबेटर में डिएकोन्ड पानी से भरे हाइड्रोलिक जलाशय को रखें। सफेद Luer टोपियां के साथ प्रवाह संस्कृति कक्षों के लिए सभी आठ कनेक्शन बंद करो । कंप्रेस्ड एयर सिस्टम से कनेक्ट करें और प्रेशर सेंसर डालें। तनाव पंप चलाने के लिए (चरण ५.६ देखें) O/N Teflon bellow के छोटे विस्तार के लिए अनुमति देने के लिए ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सभी आवश्यक सामग्रियों और उपकरणों को साफ किया जाता है और/या ऑटोक्लेव (सामग्री की तालिकादेखें, टिप्पणियां/विवरण स्तंभ जिसके लिए सामग्री को स्वचालित करने की अनुमति है), निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार या चरणों में वर्णित 7.3-7.6 ।
  5. प्रोटोकॉल के शेष के लिए बाँझ काम करने की स्थिति सुनिश्चित करें।
    1. स्टेरल लैमिनार फ्लो कैबिनेट में स्टेप्स 2-5.3 (सिस्टम की स्थापना), चरण 6.3 (मध्यम परिवर्तन), और चरण 7.1-7.2 (संवहनी निर्माणों की फसल) करें।
    2. ऐसी सामग्रियों को रखें जो बंद पेट्री व्यंजनों में बाद के चरणों के लिए सीधे आवश्यक नहीं हैं ताकि सब कुछ यथासंभव साफ रखा जा सके।
    3. 70% इथेनॉल के साथ एक कागज के ऊतकों को भिगोने से नियमित रूप से साफ या शुष्क सामग्री सतहों, और बायोरिएक्टर घटकों और लैमिनार प्रवाह कैबिनेट की सतहों को मिटा दें।

2. बायोरिएक्टर की स्थापना

नोट: एक लैमिनार प्रवाह कैबिनेट में चरण 2 करें।

  1. इलेक्ट्रोस्पन मचान को लगभग 25 मिमी लंबाई की ट्यूबों में काट लें, और उपयोग से पहले उन्हें दस्तावेज़ करें (उदाहरण के लिए, लंबाई के लिए तस्वीर, प्रारंभिक द्रव्यमान के लिए संतुलन के साथ वजन)।
  2. इलेक्ट्रोस्पन मचान को दूषित करें।
    1. एक अच्छी तरह से थाली या पेट्री डिश में झुका इलेक्ट्रोस्पन मचान रखें, एक खोलने के साथ पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश स्रोत का सामना करना पड़ रहा है, यूवी प्रकाश (२५३.७ एनएम) को सक्षम करने के लिए मचान के अंदर रोशन ।
    2. 5 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के लिए इलेक्ट्रोस्पन मचान का पर्दाफाश करें।
    3. सभी मचान चालू करें और अन्य उद्घाटन के लिए यूवी रोशनी दोहराएं।
      नोट: इस चरण के बाद, जरूरत पड़ने पर केवल इलेक्ट्रोस्पन पाड़ को स्पर्श करें। हमेशा साफ चिमटी या साफ दस्ताने का उपयोग करें।
    4. 70% में संग्रहीत प्रवाह संस्कृति कक्षों की ग्लास ट्यूब लें, अल्ट्रापुरे पानी में कांच की ट्यूब धोएं, सूखी, और एक बड़े, बंद पेट्री डिश में रखें।
      नोट: निम्नलिखित चरण, विशेष रूप से चरण 2.3-2.5, आदर्श रूप से दो प्रयोगकर्ताओं द्वारा किए जाते हैं।
  3. सिलिकॉन ट्यूबिंग पर इलेक्ट्रोस्पन मचान माउंट।
    1. ट्यूब के एक तरफ और दूसरे से बाहर के माध्यम से सीवन लेने के द्वारा सिलिकॉन ट्यूबिंग के एक छोर के लिए 5-0 प्रोलीन सीवन संलग्न, ट्यूबिंग के पार अनुभाग फैले दो विपरीत तना हुआ टांके छोड़ । समुद्री मील के लोकस पर ट्यूब को संकुचित करते समय ट्यूब के दोनों किनारों पर एक छोटी सी गाँठ बनाएं और दोनों समुद्री मील पर लगभग 10 सेमी तार छोड़ दें। दो 10 सेमी बाएं-ऊपर तारों के अंत में एक तीसरी गाँठ बनाएं।
      1. सीवन सुई और सभी मुक्त धागे को काट लें जो बाहर चिपक सकते हैं और इलेक्ट्रोस्पन पाड़ के अंदर नुकसान पहुंचा सकते हैं। इलेक्ट्रोस्पन पाड़ के माध्यम से सिलिकॉन ट्यूबिंग खींचने में सहायता करने के लिए सिलिकॉन टयूबिंग के किनारों को त्रिकोणीय आकार में काट लें।
    2. इलेक्ट्रोस्पन पाड़ को 30% इथेनॉल में डुबोएं (यह अतिरिक्त विसंदूषण चरण के रूप में कार्य करता है और सिलिकॉन ट्यूबिंग पर इलेक्ट्रोस्पन पाड़ को फिसलने में सहायक करता है) और इलेक्ट्रोस्पन पाड़ को मुफ्त 10 सेमी तार पर रखें। प्रयोगकर्ता एक सिलिकॉन ट्यूबिंग दोनों सिलिकॉन ट्यूबिंग और 10 सेमी सीवन तार की गांठ पर धीरे से खींच कर सिलिकॉन टयूबिंग फैला है, जबकि प्रयोगकर्ता बी धीरे से एक चिकनी आंतरिक टिप के साथ चिमटी का उपयोग कर सिलिकॉन ट्यूबिंग पर इलेक्ट्रोस्पन पाड़ स्लाइड करने के लिए मचान के हानिकारक को रोकने के ।
    3. धीरे-धीरे सिलिकॉन ट्यूबिंग पर खिंचाव जारी करें, जबकि साथ ही चिमटी के साथ इलेक्ट्रोस्पन पाड़ को स्मूदन करते हैं। इलेक्ट्रोस्पन पाड़ को दो बार अल्ट्रापुरे पानी में सिलिकॉन ट्यूबिंग पर डुबोएं।
      नोट: यह संभव है कि इलेक्ट्रोस्पन पाड़ की कुछ झुर्रियां होती हैं। यह झुर्रियां चरण 2.5.3 पर दबाव नाली के लिए मचान फिक्सिंग से पहले लागू पूर्व खिंचाव सही के दौरान गायब हो जाएगा।
    4. अन्य इलेक्ट्रोस्पन मचान के लिए 2.3.2 और 2.3.3 चरण दोहराएं। सिलिकॉन ट्यूबिंग की लंबाई के आधार पर, एक ही सिलिकॉन ट्यूबिंग पर कई इलेक्ट्रोस्पन मचान लगाए जा सकते हैं।
    5. जब सभी इलेक्ट्रोस्पन मचान सिलिकॉन ट्यूबिंग पर चढ़कर होते हैं, तो पीड़ों के चारों ओर सिलिकॉन ट्यूबिंग को काट दें, सभी एक ही लंबाई (5.5 सेमी) तक; एक तरफ, इलेक्ट्रोस्पन पाड़ के अंत के करीब, दूसरी तरफ, ~ 2-3 सेमी मुफ्त सिलिकॉन ट्यूबिंग छोड़ते हैं।
  4. प्रवाह संस्कृति कक्ष(चित्रा 1ए-बी)के नीचे के डिब्बे का निर्माण करें।
    1. प्रवाह आउटलेट युक्त नीचे डिब्बे के ऊपरी भाग ले लो, और एक पुरुष Luer प्लग के साथ प्रवाह आउटलेट बंद करो ।
    2. नीचे के डिब्बे के माध्यम से छेद के साथ दबाव नाली पुश, और रिसाव को रोकने के लिए दबाव नाली के निचले छोर के चारों ओर एक सिलिकॉन ओ अंगूठी जगह है । प्रेशर नाली को सुरक्षित करने के लिए नीचे के डिब्बे के निचले हिस्से को नीचे के डिब्बे के ऊपरी हिस्से में पेंच करें। सुनिश्चित करें कि दबाव नाली के निचले उत्कीर्ण नाली नीचे डिब्बे के एडाप्टर बुशिंग के किनारे से लगभग 3-5 मिमी ऊपर है; यह बाद में सीवन तार की तंग गाँठ को 'पकड़' लेगा, सिलिकॉन ट्यूबिंग पर इलेक्ट्रोस्पन पाड़ को ठीक करेगा।
      नोट: यदि दबाव नाली आसानी से ऊपर और नीचे पैंतरेबाज़ी किया जा सकता है, यह इंगित करता है कि नीचे डिब्बे अच्छी तरह से सुरक्षित नहीं है । बाद के चरणों (चित्रा 2डी) में रिसाव को रोकने के लिए चरण2.4.2 दोहराएं।
  5. दबाव नाली के लिए इलेक्ट्रोस्पन पाड़ के साथ सिलिकॉन ट्यूबिंग सुरक्षित।
    1. दबाव नाली पर इलेक्ट्रोस्पन पाड़ के साथ सिलिकॉन ट्यूब खींचो।
    2. दबाव नाली पर उत्कीर्ण नाली के स्थान पर इलेक्ट्रोस्पन पाड़ के निचले छोर पर सीवन तार के साथ एक गाँठ बनाओ। इलेक्ट्रोस्पन भ्रष्टाचार के साथ सिलिकॉन ट्यूबिंग को कसकर सुरक्षित करने के लिए विपरीत दिशा में एक दूसरी गाँठ बनाएं।
      सावधानी: यह एक महत्वपूर्ण कदम है। सुनिश्चित करें कि गांठ हाइड्रोलिक जलाशय से प्रवाह संस्कृति कक्षों के लिए पानी के रिसाव को रोकने के लिए दबाव नाली के उत्कीर्ण नाली में बिल्कुल 'गिर जाता है' । यदि यकीन नहीं है, तो नाली के अपेक्षित स्थान के ऊपर या नीचे कई पदों पर सीवन तार को कसने की कोशिश करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि अंतिम समुद्री मील बिल्कुल उत्कीर्ण नाली(चित्रा 2A)पर हैं।
    3. सिलिकॉन ट्यूब के ऊपरी छोर पर कैंची क्लैंप रखें, और सिलिकॉन ट्यूबिंग को ऊपर की ओर फैलाएं (यह सीधे पहली गाँठ का परीक्षण करेगा, यदि दबाव नाली पर इलेक्ट्रोस्पन पाड़ के साथ सिलिकॉन ट्यूबिंग को स्थानांतरित करना संभव है, तो इसे पर्याप्त रूप से कड़ा नहीं किया गया था)। पुलिंग फोर्स के साथ सिलिकॉन ट्यूबिंग पहले से फैला हुआ है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि सिलिकॉन ट्यूबिंग विभिन्न नमूनों के बीच संगत है, एक शासक को कैंची क्लैंप से जोड़ता है। कैंची क्लैंप को ऊपर की ओर खींचें जब तक कि शासक का निचला सिरा पाड़ के निचले छोर की ऊंचाई तक न पहुंच जाए।
      नोट: यह प्रत्येक नमूने में पूर्व खिंचाव रखने के लिए महत्वपूर्ण है मोटे तौर पर एक ही (~ 5%) दो कारणों के लिए: (1) यदि सिलिकॉन ट्यूबिंग पूर्व फैला हुआ है, यह नमूना की लंबाई के साथ और अधिक सजातीय विस्तार में परिणाम होगा जब दबाव; (2) पूर्व खिंचाव सिलिकॉन के यांत्रिक गुणों को प्रभावित करेगा, इसलिए यह नमूनों के बीच समान खिंचाव की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए सभी नमूनों में एक ही होना चाहिए ।
    4. इलेक्ट्रोस्पन पाड़ पर धीरे-धीरे खींचकर इलेक्ट्रोस्पन पाड़ में झुर्रियां हटाएं। फिर, दबाव नाली पर ऊपरी उत्कीर्ण नाली के स्थान पर पाड़ के ऊपरी छोर पर एक सीवन तार के साथ दोनों पक्षों पर दो समुद्री मील बनाओ ।
    5. कैंची क्लैंप जारी करें, और एक चाकू के साथ सिलिकॉन ट्यूबिंग की अधिकता को काट दें, सिलिकॉन ट्यूबिंग के साथ कवर किए गए पेंच धागे का 20-30% छोड़ दें, रिसाव को रोकने के लिए जब नाक शंकु पेंच धागे पर रखा जाता है।
      नोट: सभी गतिशील नमूनों के लिए 2.4 और 2.5 चरणों को दोहराएं।
    6. स्थिर नियंत्रण नमूनों के लिए, छेद के बिना दबाव नाली पर सिलिकॉन ट्यूबिंग पर घुड़सवार इलेक्ट्रोस्पन पाड़ सुरक्षित करें। इन नाली एक 15 मिलीएल ट्यूब में अलग से रखा जा सकता है जब तक सीडिंग (चरण 4) और प्रवाह संस्कृति चैंबर डिब्बों में घुड़सवार होने की जरूरत नहीं है ।
  6. 10 मिनट के लिए यूवी प्रकाश को उजागर करके इलेक्ट्रोस्पन पाड़ के साथ आंशिक रूप से निर्मित प्रवाह संस्कृति कक्षों को दूषित करें। इलेक्ट्रोस्पन पाड़ के साथ प्रवाह संस्कृति कक्षों को दूसरी तरफ घुमाएं, और 10 मिनट के लिए यूवी लाइट एक्सपोजर दोहराएं।
  7. गतिशील नमूनों के लिए छेद के साथ दबाव नाली के पेंच धागे पर नाक शंकु पेंच।
    1. सुनिश्चित करें कि सिलिकॉन ट्यूबिंग के शीर्ष अंत बाद के चरणों में रिसाव को रोकने के लिए नाक शंकु में फिट बैठता है । यदि बहुत अधिक सिलिकॉन ट्यूबिंग है, तो चाकू से दूर ट्यूबिंग की अतिरिक्त कटौती करें।
    2. आंशिक रूप से निर्मित प्रवाह संस्कृति कक्षों को एक बड़े पेट्री डिश में रखें, और यूवी प्रकाश स्रोत की ओर नाक शंकु को इंगित करें। 5 मिनट के लिए यूवी रोशनी लागू करें।
  8. ग्लास ट्यूब और प्रवाह संस्कृति कक्ष(चित्रा 1ए-बी)के शीर्ष डिब्बे के साथ प्रवाह संस्कृति कक्ष का पूर्ण निर्माण।
    1. 30% इथेनॉल में सिलिकॉन ट्यूबिंग और इलेक्ट्रोस्पन पाड़ के साथ दबाव नाली को डुबोकर इलेक्ट्रोस्पन मचान को पूर्व-गीला करें, इसके बाद दो बार अल्ट्रापुरे पानी में डुबकी लगाई जाती है।
    2. कांच की ट्यूब को प्रेशर नाली के ऊपर रखें, और धीरे-धीरे नीचे के डिब्बे में पुश करें और धीरे-धीरे इसे सुरक्षित करें।
    3. प्रवाह इनलेट युक्त शीर्ष डिब्बे लें, एक सिलिकॉन ओ-रिंग, फ्लो स्ट्रेटनर, और एडाप्टर को सही क्रम(चित्रा 1ए-बी)में बुशिंग रखें, और ग्लास ट्यूब के खुले छोर पर रखें और धीरे-धीरे इसे सुरक्षित करें।
    4. शीर्ष डिब्बे के प्रवाह इनलेट पर एक सफेद Luer टोपी पेंच।
    5. नीचे के डिब्बे के प्रवाह आउटलेट से पुरुष लूयर प्लग निकालें, और इथेनॉल से लथपथ पेपर ऊतक के साथ इसके चारों ओर की सतह को साफ करें।
    6. प्रवाह आउटलेट में अल्ट्रापुरे पानी के 10 एमएल के साथ एक सिरिंज रखें, शीर्ष डिब्बे पर सफेद लूयर कैप खोलें, और कक्ष को अल्ट्रापुरे पानी से भरें। सफेद Luer टोपी फिर से बंद करो, सिरिंज को हटा दें, इथेनॉल के साथ फिर से साफ है, और एक पुरुष Luer प्लग के साथ प्रवाह आउटलेट बंद करो ।
      नोट: सभी प्रवाह संस्कृति कक्षों के लिए 2.6-2.8 चरण दोहराएं।
    7. स्थिर नियंत्रण के लिए, छेद के बिना दबाव नाली पर चढ़कर नमूनों को पकड़े 15 एमएल ट्यूबों में अल्ट्रापुरे पानी के 10 एमएल जोड़ें।
  9. इनक्यूबेटर में सभी प्रवाह संस्कृति कक्षों रखें। एक दिन पहले संस्कृति माध्यम के साथ अल्ट्रापुरे पानी की जगह के रूप में कदम २.८.५ और २.८.६ में वर्णित पर सेल सीडिंग (एक इथेनॉल लथपथ कागज ऊतक के साथ ' पुराने ' अल्ट्रापुरे पानी इकट्ठा करने के लिए सुनिश्चित करें प्रवाह आउटलेट पर सीधे रखा) ।

[प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है]

3. प्रवाह पंप सेटअप के लिए तैयारी

नोट: एक लैमिनार प्रवाह कैबिनेट में चरण 3 प्रदर्शन करें।

  1. सभी पंप सेटअप सामग्री ले लीजिए और उपयोग के लिए तैयार करते हैं।
    नोट: प्रयोगकर्ताओं को तरल इकाई के वाल्व के माध्यम से पंप, तरल इकाइयों और मध्यम टयूबिंग स्थापित करने के विस्तृत विवरण के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के लिए भेजा जाता है।
    1. पंप को 200 मीटर क्षमता तक सेट करें।
    2. 60 एमएल जलाशयों के लिए जलाशय धारकों को तरल इकाइयों में पेंच करें।
    3. इथेनॉल में भिगोए गए पेपर टिश्यू के साथ फिर से इस् स्यूजेबल रबर एयर फिल्टर को साफ करें, सुनिश्चित करें कि एयर फिल्टर सूखा रहता है।
  2. जलाशय धारकों में 60 एमएल जलाशयों रखें, और तरल इकाई के वाल्व के माध्यम से मानक मध्यम टयूबिंग रखें। मध्यम टयूबिंग को एक संलग्न लूप में महिला लुएर लॉक कपलर्स के साथ एक बड़े आंतरिक व्यास के साथ जोड़ें।
  3. जलाशयों के नीचे सीधे एक नली क्लिप के साथ मध्यम टयूबिंग क्लैंप करें।
  4. जलाशयों को प्रति 60 एमएल जलाशय संस्कृति माध्यम के 25 एमएल से भरें। नली क्लिप जारी करें, और माध्यम को टयूबिंग में प्रवेश करने दें।
  5. मध्यम जलाशयों को रबर एयर फिल्टर के साथ बंद करें, और प्रवाह पंप सेटअप को इनक्यूबेटर में चरण 4 तक रखें।

4. सेल कैरियर के रूप में फिब्रिन का उपयोग करके सेल सीडिंग

नोट: एक लैमिनार प्रवाह कैबिनेट में चरण 4 करें।

  1. सेल सीडिंग स्टेप के लिए फिब्रिन जेल तैयार करें। विवरण के लिए, फोल्ड एट अल देखें67 फाइब्रिन जेल के लिए, फाइब्रिनोजेन समाधान में 10 मिलीग्राम/एमएल (प्रोटीन स्टॉक की शुद्धता के लिए सही) की अंतिम एकाग्रता होनी चाहिए, और थ्रोम्बिन समाधान में 10 यू/एमएल की अंतिम एकाग्रता होनी चाहिए।
    1. लाल ढक्कन वाले प्लास्टिक कंटेनर में ~ 50 मिलीग्राम (10 नमूनों के लिए पर्याप्त) वजन से पहले, आर टी के लिए फाइब्रिनोजेन गल।
    2. फाइब्रिनोजेन समाधान तैयार करने के लिए सेल कल्चर माध्यम जोड़ें (10 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर, प्रोटीन स्टॉक की शुद्धता के लिए सही)। अच्छी तरह से मिलाएं और एक बाँझ 15 एमएल ट्यूब में 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ फाइब्रिनोजेन समाधान को बाँझ करने के लिए फ़िल्टर करें। बर्फ पर फ़िल्टर फिब्रिनोजेन समाधान रखें।
      नोट: फिब्रिनोजेन समाधान को बहुत लंबे समय से पहले तैयार करने से बचें, अन्यथा फाइब्रिनोजन अनायास थक्का हो सकता है।
    3. गल थ्रोम्बिन और सेल कल्चर मीडियम में थ्रोम्बिन का घोल (10 यू/एमएल की एकाग्रता पर) बनाएं और बर्फ पर रखें । प्रति सैंपल 20 माइक्रोन थ्रोम्बिन + कोशिकाओं का समाधान तैयार करें। n = 10 नमूनों के लिए, 200 माइक्रोन की जरूरत है; इसलिए, संभावित पाइपिंग त्रुटियों के लिए खाते में 250 माइक्रोन थ्रोम्बिन समाधान तैयार करें।
  2. संस्कृति फ्लास्क से कोशिकाओं को इकट्ठा करें और गिनें। कोशिकाओं को वांछित अनुपात और राशि (1.2 × 106 मोनोसाइट्स और 0.6 × 106 माईऑफिब्रोब्लास्ट प्रति पीपाड़) में मिलाएं। सुनिश्चित करें कि एन + 1 नमूनों के लिए पर्याप्त कोशिकाएं हैं जो पाइपिंग त्रुटियों के लिए सही हैं। आरटी में 10 मिनट के लिए 350 × जी पर सेंट्रलाइज करें।
  3. निलंबित कोशिकाओं और थ्रोम्बिन का मिश्रण बनाएं।
    1. प्रत्येक नमूने के लिए, थ्रोम्बिन समाधान के 20 माइक्रोन का उपयोग करें। n = 10 नमूनों के लिए, सेल पेलेट में 200 माइक्रोन थ्रोम्बिन जोड़ें और मिलाएं। सेल सस्पेंशन (कोशिकाओं + थ्रोम्बिन) की मात्रा को मापें, और गणना करें कि सभी 10 मचानों पर समान रूप से कैसे विभाजित किया जाए (उदाहरण के लिए, यदि थ्रोम्बिन + सेल सस्पेंशन में 260 माइक्रोन की मात्रा है, तो प्रत्येक इलेक्ट्रोस्पन नमूने को 260 μL/10 नमूने = 26 μL थ्रोम्बिन + सेल निलंबन) प्राप्त होंगे।
    2. चूंकि पाड़ की सीडिंग दो चरणों में की जाती है, इसलिए दो 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब तैयार करें जो प्रत्येक पाड़ के लिए सेल निलंबन का आधा हिस्सा रखेंगे (पिछले चरण की गणना में: थ्रोम्बिन + सेल निलंबन के 13 माइक्रोल के साथ दो ट्यूब तैयार करें)। बर्फ पर रखें।
      नोट: निम्नलिखित चरण, विशेष रूप से चरण 4.4, आदर्श रूप से दो प्रयोगकर्ताओं द्वारा किए जाते हैं।
  4. सेल सीडिंग के लिए तैयार करने के लिए वैक्यूम के साथ पूर्व-गीले इलेक्ट्रोस्पन मचान को सुखाएं।
    1. लैमिनार प्रवाह कैबिनेट के वैक्यूम सिस्टम से एक ग्लास पाश्चर पिपेट कनेक्ट करें, और बाँझ अस्थायी भंडारण के लिए एक खाली 50 एमएल ट्यूब में रखें।
    2. इनक्यूबेटर से प्रवाह संस्कृति कक्षों ले लो, प्रवाह आउटलेट से पुरुष Luer प्लग को हटा दें, और सफेद Luer टोपी खोलने और प्रवाह आउटलेट के सामने एक इथेनॉल से लथपथ कागज ऊतक रखने के बाद माध्यम को हटा दें ।
    3. ऊपर के डिब्बे और कांच की ट्यूब को उतार लें, और अस्थायी भंडारण के लिए बाँझ पेट्री डिश में रखें।
    4. इलेक्ट्रोस्पन पाड़ पर वैक्यूम पाश्चर पिपेट रखें, और जितना संभव हो उतना माध्यम हटा दें।
      सावधानी: वैक्यूम इलेक्ट्रोस्पन पाड़ को बहुत धीरे से सूखा। पाड़ पर पीछे-पीछे रैखिक गति के बजाय, वैक्यूम पिपेट को कई स्थानों पर रखें। बेहतर नियंत्रण के लिए उंगलियों के बीच में पाश्चर के पिपेट के शीर्ष पर वैक्यूम टयूबिंग दबाएं।
    5. थ्रॉम्बिन + सेल सस्पेंशन के साथ 1:1 अनुपात में फाइब्रिनोजेन समाधान मिलाएं (उदाहरण के लिए, थ्रॉम्बिन + सेल सस्पेंशन के 13 माइक्रोन के साथ फाइब्रिनोजन के 13 माइक्रोन मिलाएं)। यह सुनिश्चित करने के लिए कि फाइब्रिन पाड़ में बहुलक होता है और माइक्रोफ्यूज ट्यूब में नहीं, फाइब्रिनोजन को पिपेट करें, थ्रोम्बिन + सेल सस्पेंशन के 'अतिरिक्त मात्रा' के लिए पिपेट व्हील को चालू करें, और माइक्रोफ्यूज ट्यूब में एक बार सेल निलंबन के साथ मिश्रण करने के लिए पिपेट करें।
    6. सीधे सजातीय रूप से इलेक्ट्रोस्पन पाड़ की पूरी लंबाई पर समाधान ड्रिप। यह सलाह दी जाती है कि प्रयोगकर्ता एक फाइब्रिन मिश्रण को ड्रिप करता है, जबकि प्रयोगकर्ता बी नीचे के डिब्बे को इलेक्ट्रोस्पन पाड़ के साथ नीचे के डिब्बे को दबाव नाली में ले जाकर रखता है।
    7. कोशिकाओं के साथ फाइब्रिन के बाद इलेक्ट्रोस्पन पाड़ पर टपकता है, प्रयोगकर्ता बी धीरे-धीरे पाड़ को बाएं से दाएं और ऊपर और नीचे ले जाता है, ताकि कोशिकाओं को पाड़ पर समान रूप से विभाजित किया जा सके।
    8. इलेक्ट्रोस्पन पाड़ के दूसरी तरफ 4.4.7 - 4.4.7 कदम दोहराएं।
    9. ध्यान से ग्लास ट्यूब रखकर प्रवाह संस्कृति कक्ष को फिर से माउंट करें (फाइब्रिन चिपकाने और ग्लास ट्यूब के भीतरी हिस्से में थक्के को रोकें), और प्रवाह संस्कृति कक्ष के शीर्ष डिब्बे को पीछे धकेलें। सीधे इनक्यूबेटर में प्रवाह संस्कृति कक्ष में किसी भी माध्यम या फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के बिना वरीयता प्राप्त निर्माण रखें।
    10. सभी गतिशील नमूनों के लिए 4.4.1-4.4.9 कदम दोहराएं। छिद्रों के बिना नाली के दबाव के लिए स्थिर नमूनों के लिए, चरण 4.4.1-4.4.8 के अनुसार बीज, और बाद में 15 एमएल ट्यूब में रखें।
    11. इनक्यूबेटर में 60 मिनट के लिए फाइब्रिन को पॉलीमराइज होने दें।

[प्रोटोकॉल यहां 30-60 मिनट के लिए रोका जा सकता है।

  1. बहुलीकरण के बाद, प्रवाह संस्कृति कक्षों (गतिशील नमूने) या 15 एमएल ट्यूब (स्थिर नमूने) को माध्यम से भरें।

5. प्रयोग शुरू करने से पहले बायोरिएक्टर और फ्लो पंप सिस्टम की युग्मन

नोट: एक लैमिनार प्रवाह कैबिनेट में चरण 5.1-5.3 प्रदर्शन करें।

  1. प्रवाह संस्कृति कक्षों और भरे मध्यम जलाशयों और laminar प्रवाह अलमारियाँ के अंदर जुड़े मध्यम टयूबिंग के साथ तरल इकाइयों ले जाने ट्रे ले लो ।
  2. चक्रीय खिंचाव से भरे प्रायोगिक समूहों के लिए बायोरिएक्टर आधार पर प्रवाह संस्कृति कक्षों की स्थिति और संयुक्त हीमोडायनामिक लोड(चित्रा 1E)के साथ।
    1. प्रवाह संस्कृति कक्ष को उल्टा झुकाएं, और पतली ट्यूबिंग के साथ एक सिरिंज का उपयोग करके अल्ट्रापुरे पानी के साथ नीचे से दबाव नाली को भरें (यह किसी भी प्रकार का हो सकता है, जब तक यह लचीला और पतला है, इस प्रयोग में, एक 10 सेमी लंबा, 0.15 मिमी आंतरिक व्यास तार सुई से जुड़ा हुआ था)।
    2. दबाव नाली के अंदर पतली टयूबिंग रखें, और जबकि दबाव नाली धीरे-धीरे सिरिंज से बाहर पानी धक्का द्वारा अल्ट्रापुरे पानी से भर जाता है, तार को एक साथ दबाव नाली से बाहर खींचें, ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि दबाव नाली के अंदर कोई हवा के बुलबुले न हों।
    3. बायोरिएक्टर बेस पर आठ स्क्रू थ्रेड्स में से एक पर फ्लो कल्चर चैंबर रखें। संभावित रिसाव को रोकने के लिए बायोरिएक्टर बेस और व्हाइट ल्यूयर कनेक्टर के बीच सिलिकॉन ओ-रिंग रखें, और नीचे के डिब्बे से सफेद लूयर कनेक्टर को कस दें।
    4. सभी चक्रीय रूप से फैला नमूनों के लिए 5.2.2 और 5.2.3 कदम दोहराएं।
  3. प्रवाह पंप प्रणाली के लिए, स्थिर नियंत्रण को छोड़कर सभी प्रयोगात्मक समूहों के लिए प्रवाह संस्कृति कक्षों को कनेक्ट करें।
    1. मीडियम ट्यूबिंग पर एक नली क्लिप रखें। प्रवाह संस्कृति कक्ष के शीर्ष डिब्बे के प्रवाह इनलेट को कवर सफेद Luer टोपी निकालें। मध्यम टयूबिंग की मादा ल्यूयर कपलर को हटा दें, और एक तरफ मध्यम टयूबिंग को शीर्ष डिब्बे पर प्रवाह इनलेट के साथ कनेक्ट करें, और नीचे के डिब्बे में प्रवाह आउटलेट के साथ मध्यम टयूबिंग के दूसरे पक्ष को जोड़ें।
    2. सभी प्रवाह संस्कृति कक्षों के लिए चरण 5.3.1 दोहराएं। इस बिंदु पर, बायोरिएक्टर और प्रवाह संस्कृति कक्ष मध्यम से भरे हुए हैं और प्रवाह प्रणालियों से जुड़े हुए हैं।
    3. स्थिर नियंत्रण नमूनों के लिए, नमूनों को कैंची क्लैंप का उपयोग करके फिल्टर कैप के साथ सेल कल्चर फ्लास्क में खड़ी रखें। सेल कल्चर फ्लास्क को मीडियम से भरें, और इनक्यूबेटर में रखें ।
  4. लेमिनार फ्लो कैबिनेट से पूरा सेटअप इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें, और तरल इकाइयों को हवा के दबाव टयूबिंग और इलेक्ट्रिक केबल से जोड़ें।
  5. सॉफ्टवेयर शुरू करें, और प्रवाह पंपों को शुरू करें। नमूनों के लिए मध्यम प्रवाह को एक-एक करके शुरू करें।
    1. जांच करें कि तरल इकाई के वाल्व क्लिक कर रहे हैं या नहीं।
    2. मीडियम ट्यूबिंग से नली क्लैंप निकालें।
    3. 100 मीटर और 10 एस स्विचिंग समय के साथ प्रवाह पंप शुरू करें।
    4. संभावित रिसाव या हवा के बुलबुले के लिए प्रवाह दिशा की सावधानीपूर्वक जांच करें। किसी भी फंसे हवा बुलबुले प्रवाह संस्कृति कक्ष उल्टा मोड़ द्वारा हटाया जा सकता है ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि मध्यम जलाशयों में मध्यम स्तर संतुलित हैं, प्रणाली में हवा के चूषण को रोकने के लिए और प्रवाह संस्कृति कक्षों में हवा बुलबुले, और जलाशयों को सूखी(चित्रा 2C)चलाने के लिए अनुमति नहीं है ।
    5. एक-एक करके सभी तरल इकाइयों के लिए चरण 5.5 दोहराएं।
  6. स्ट्रेन पंप को शुरू करें।
    1. वायवीय सिलेंडर पर हवा के इनलेट के माध्यम से वायवीय एक्ट्यूएटेड पंप को संकुचित हवा से कनेक्ट करें। एयर आउट(चित्रा 1F)के लिए ब्लू ट्यूबिंग के साथ निचले एयर आउटलेट को कनेक्ट करें।
    2. ओपन लैबव्यू सॉफ्टवेयर, लैबव्यू स्क्रिप्ट और संकुचित वायु दबाव अनुप्रयोग प्रणाली चलाएं, जैसा कि वैन केले एट अल68द्वारा वर्णित है, विस्थापन और आवृत्ति दर्ज करें (0.2 हर्ट्ज की कम आवृत्ति के साथ शुरू करें)। जब टेफ्लॉन बेलो अपने निम्नतम स्तर पर हो तो पंप को रोकें।
    3. हाइड्रोलिक जलाशय पर प्रेशर सेंसर इनलेट में प्रेशर सेंसर रखें।
  7. पंप सेटिंग्स को वांछित सेटिंग्स में बदलें (1.5 पीए के लिए, 150 mbar, 10 s स्विचिंग समय का उपयोग करें)।
  8. स्ट्रेन पंप शुरू करें, और पसंदीदा सेटिंग (जैसे, 0.5 हर्ट्ज, 1.05 खिंचाव) लागू करें।

6. कई दिनों के लिए प्रयोग चल रहा है; संस्कृति और मध्यम प्रतिस्थापन के दौरान कतरनी और खिंचाव की निगरानी

  1. पाड़ की दीवार पर WSS की गणना करें।
    1. हर दूसरे दिन प्रवाह परिमाण रिकॉर्ड करें (विवरण के लिए प्रवाह पंप निर्माता का मैनुअल देखें)। संक्षेप में, 10 एस के लिए तरल इकाई जलाशय के स्विचन के बीच में मध्यम जलाशयों में तरल स्तर (एमएल में) में परिवर्तन का निरीक्षण करें। कम से कम पांच माप आचरण, मतलब मूल्य की गणना, और 6 से गुणा करने के लिए एमएल में प्रवाह दर क्यू/
    2. प्रवाह एक वलयाकार चैनल के माध्यम से एक Poiseuille प्रवाह द्वारा वर्णित है। एक न्यूटोनियन तरल पदार्थ के रूप में संस्कृति माध्यम संभालने, पाड़ दीवार पर WSS की गणना, आर1,समीकरण 1 द्वारा ।
      Equation 1 (1)
      जहां पीपाड़ की दीवार पर डब्ल्यूएसएसडब्ल्यू (आर1;यहां आर1 = 1.7 मिमी), एक स्थिर राज्य प्रवाह के परिणामस्वरूप, लागू दबाव पी और ग्लास ट्यूब आर 2 (यहां आर2 =2.3 मिमी) के भीतरी त्रिज्या द्वारा निर्धारित किया जाता है। अक्षीय दिशा में दबाव ढाल प्रवाह इनलेट और प्रवाह आउटलेट के बीच एक समान माना जाता है और समीकरण 2(चित्रा 1J)द्वारा दिया जाता है ।
      Equation 2 (2)
      गतिशील चिपचिपाहट μ के साथ (यहां मध्यम चिपचिपाहट को स्थिर मान लिया गया था, μ = 0.7 × 10-3 पीए∙ 37 डिग्री सेल्सियस पर) और क्यू लागू प्रवाह दर।
  2. हर दूसरे दिन मचानों पर लागू खिंचाव की निगरानी करें।
    1. पाड़ और पृष्ठभूमि के बीच इसके विपरीत बढ़ाने के लिए प्रवाह संस्कृति कक्ष के पीछे एक अंधेरे पृष्ठभूमि रखें। पाड़ के दृश्य में मदद करने के लिए, पाड़ की ओर इशारा करते हुए एलईडी लाइट लैंप की स्थिति।
    2. एक उच्च गति कैमरे के साथ 6 एस (यानी, 3 खिंचाव चक्र) के लिए 30 हर्ट्ज की आवृत्ति पर पाड़ की समय-चूक तस्वीरें लें।
      नोट: यदि कैमरा अनुमति देता है तो कम रिकॉर्डिंग आवृत्ति पर्याप्त हो सकती है। हालांकि, न्यूनतम आवश्यक आवृत्ति निर्धारित नहीं की गई थी।
    3. मैन्युअल रूप से छवियों से पाड़ के न्यूनतम और अधिकतम व्यास का निर्धारण करें।
    4. समीकरण 3 के अनुसार अधिकतम हिस्सों की गणना करने के लिए इलेक्ट्रोस्पन पाड़ के न्यूनतम और अधिकतम बाहरी व्यास की गणना करें।
      Equation 3 (3)
      जहां परिक्षित खिंचाव(λθ)पाड़ के बाहरी व्यास, डी1,और उसके प्रारंभिक व्यास, डी0 के बीच अनुपात द्वारा दियाजाताहै ।
  3. मध्यम वाष्पीकरण के लिए सही है, और प्रति सप्ताह तीन बार मध्यम ताज़ा।
    1. बंद करो और प्रवाह प्रणाली और तनाव पंप के लिए केबल decouple ।
    2. मीडियम ट्यूबिंग पर नली क्लिप रखें।
    3. मध्यम जलाशयों पर वॉल्यूम इंडिकेटर निशान के आधार पर कितना मध्यम सुखाया गया निर्धारित करें।
    4. ट्रे को बायोरिएक्टर और फ्लूइड यूनिट्स के साथ लैमिनार फ्लो कैबिनेट में ट्रांसफर करें।
    5. मध्यम जलाशयों के रबर एयर फिल्टर निकालें; मध्यम की सुखाया मात्रा की भरपाई के लिए ऑटोक्लेवेड अल्ट्रापुरे पानी जोड़ें। मध्यम जलाशयों को फिर से बंद करें, और अल्ट्रापुरे पानी के साथ माध्यम को मिलाने के लिए फिर से पंप से कनेक्ट करें।
    6. 6.3.1-6.3.5 चरण दोहराएं। रबर एयर फिल्टर फिर से निकालें, संस्कृति माध्यम के 25 एमएल बाहर ले, और आरटी में 5 मिनट के लिए ३०० × जी पर नीचे स्पिन ।
      1. 1.5 एमएल सुपरनैंट लीजिए, और स्रावीय प्रोफाइल के विश्लेषण के लिए -30 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) के साथ विश्लेषण के लिए)।
      2. वातानुकूलित मध्यम43के रूप में सुपरनैंट का उपयोग करके पैराक्रिन सिग्नलिंग अध्ययन के लिए सुपरनेटेंट की वांछित मात्रा एकत्र करें।
    7. मध्यम जलाशयों में ताजा माध्यम के 25 एमएल जोड़ें।
    8. मध्यम जलाशयों पर रबर एयर फिल्टर वापस रखें।
    9. पूरा सेटअप वापस इनक्यूबेटर में रखें; पंप और तनाव पंप करने के लिए सभी केबल और हवा टयूबिंग कनेक्ट। नली क्लिप जारी करें और चरण 5.4-5.8 दोहराएं।
  4. जांच करें कि क्या सिलिका सुखाने की बोतलों में पंप से जुड़े मोती नम (सफेद उपस्थिति) हैं, और यदि आवश्यक हो तो शुष्क सिलिका मोतियों (नारंगी उपस्थिति) के साथ बदलें।

7. प्रयोग, नमूना संग्रह, और उपकरण सफाई और भंडारण समाप्त

  1. प्रयोग के अंतिम दिन, मध्यम वाष्पीकरण के लिए सही के रूप में कदम 6.3.1-6.3.5 में वर्णित है, और एक-एक करके नमूनों की कटाई ।
    1. नमूनों की कटाई के लिए एक-एक कर फ्लो पंप और स्ट्रेन पंप को कई बार रोके जाने की जरूरत है। मीडियम ट्यूबिंग पर एक नली क्लिप रखें। अस्थायी रूप से प्रवाह पंप और तनाव पंप बंद करो। बायोरिएक्टर बेस से एक प्रवाह संस्कृति कक्ष को डिस्कनेक्ट करें; बायोरिएक्टर बेस पर एक सफेद लूयर कैप से बदलें। प्रवाह संस्कृति कक्ष और तरल इकाई को लेमिनार प्रवाह कैबिनेट में ले जाएं। कटाई तक अन्य नमूनों के लिए हेमोडायनामिक लोड लागू करने के लिए प्रवाह पंप और तनाव पंप फिर से शुरू करें।
    2. एलिसा के माध्यम से पैराक्रिन साइटोकिन उत्पादन विश्लेषण के लिए मध्यम जलाशयों से मध्यम एकत्र करें।
  2. डिकोपल फ्लो यूनिट्स और हार्वेस्ट ट्यूबलर निर्माण। वांछित कटिंग योजना के अनुसार अनुभाग। निर्माण के कुछ हिस्सों को 4 डिग्री सेल्सियस (3.7% फॉर्मलडिहाइड में 15 मिनट निर्धारण और पीबीएस में 3 x 5 मिनट धोने के बाद) या -30 डिग्री सेल्सियस (तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रीजिंग के बाद) पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. बायोरिएक्टर और पंप घटकों को साफ करें। इसके अतिरिक्त, प्रति आइटम सलाह दी सफाई विधि सामग्री की तालिकामें उल्लेख किया गया है।
    1. 70% इथेनॉल के साथ रबर एयर फिल्टर साफ करें। आंतरिक फिल्टर गीला नहीं करने के लिए बहुत सावधान रहें!
    2. सभी अलग-अलग घटकों को इकट्ठा करें: मध्यम टयूबिंग, मध्यम जलाशय, ग्लास ट्यूब, पुरुष लूयर प्लग और मादा लूयर लॉक, सफेद लूयर कैप्स, प्रेशर नाली, नाक शंकु, सिलिकॉन ओ-रिंग्स, एडाप्टर बुशिंग, फ्लो स्ट्रेटनर (पंप, तरल इकाइयों, रबर एयर फिल्टर, बायोरिएक्टर बेस को छोड़कर), और चलने वाले नल के पानी में कुल्ला।
    3. ओ/एन को डिओनाइज्ड पानी में 0.1% सोडियम डॉडेकाइल्सुफेट में रखें।
      नोट: अल्ट्रापुरे पानी का उपयोग न करें क्योंकि भागों में जंग लग सकती है।
    4. नल के पानी और डिशवॉशिंग साबुन से कुल्ला करें।
    5. डिएकॉल्ड पानी में विसर्जित किया जाता है, इसके बाद दो बार 70% इथेनॉल होता है, जिसके बाद पानी को अलग किया जाता है।
    6. सभी सामग्रियों को कागज के ऊतकों पर अलग-अलग रखें और उन्हें सूखने दें। ट्यूबिंग को सुखाने के लिए दबाव वाली हवा का उपयोग करें।
    7. 70% इथेनॉल में भिगोए गए पेपर टिश्यू के साथ सभी गैर-ऑटोक्लेवेबल सामग्रियों को साफ करें। इसमें रबर एयर फिल्टर (ध्यान रखें कि एयर फिल्टर शुष्क रहना चाहिए) और बायोरिएक्टर बेस (टेफ्लॉन बेलो और वायवीय सिलेंडर) शामिल हैं।
    8. द्रव कक्ष के घटकों (सिलिकॉन ओ-रिंग सहित), मध्यम ट्यूबिंग, मध्यम जलाशयों (रबर एयर फिल्टर के बिना), पुरुष लुयर प्लग और मादा ल्यूयर कपलर, सफेद लुएर कैप्स, नली क्लिप, और मानक उपकरण (जैसे, चिमटी, क्लैंपिंग कैंची) के घटकों को ऑटोक्लेव करें
    9. अगले प्रयोगों के दौरान सुविधाजनक उपयोग के लिए, एक ऑटोक्लेवेबल बॉक्स में एक पूर्ण तरल कक्ष के लिए अलग-अलग घटकों को मिलाएं।
  4. हाइड्रोलिक जलाशय से पानी निकालें। 70% इथेनॉल के साथ साफ करें, इसके बाद पानी को डिवोनाइज्ड करें। इसे सूखने दें। डियोनाइज्ड पानी और पानी-बाथ-संरक्षित कीटाणुनाशक की कुछ बूंदें के साथ फिर से भरें।
  5. 70% इथेनॉल में प्रवाह संस्कृति कक्ष के लिए ग्लास ट्यूब स्टोर करें।
  6. नम सिलिका सुखाने वाले मोतियों (सफेद उपस्थिति) को ओवन ओ/एन में 120 डिग्री सेल्सियस पर रखें ताकि उन्हें सूखा (नारंगी उपस्थिति) दिया जा सके, और एक एयर-टाइट फ्लास्क में स्टोर करें।

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Representative Results

इस बायोरिएक्टर को 3 डी बायोमटेरियल मचानों में संवहनी ऊतक विकास और रीमॉडलिंग पर कतरनी तनाव और चक्रीय खिंचाव के व्यक्तिगत और संयुक्त प्रभावों का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था। बायोरिएक्टर का डिजाइन विभिन्न लोडिंग शर्तों(चित्रा 1 ए)के तहत आठ संवहनी निर्माणों तक खेती करने की अनुमति देता है। संवहनी निर्माण एक प्रवाह संस्कृति कक्ष(चित्रा 1 बी)में तैनात हैं जिसमें परिधि खिंचाव और डब्ल्यूएसएस दोनों को स्वतंत्र रूप से नियंत्रित किया जा सकता है। प्रवाह संस्कृति कक्ष के शीर्ष डिब्बे में अपेक्षाकृत कम बसने की लंबाई(चित्रा 1C)में प्रवाह को स्थिर करने के लिए एक प्रवाह सीधा होता है। प्रवाह स्ट्रेटनर के सीधे नीचे, नाक शंकु वलयाकार चैनल(चित्रा 1D)के माध्यम से प्रवाह को समान रूप से वितरित करता है। जब प्रोटोकॉल के सभी चरणों को सही तरीके से किया जाता है, तो प्रवाह संस्कृति कक्ष में संवहनी मचान को पाड़ और कांच की दीवार के बीच वलयाकार चैनल के माध्यम से निरंतर एकदिशात्मक प्रवाह के अधीन किया जा सकता है और वायवीय पंप(चित्रा 1ई-एफ)द्वारा परिधीय रूप से फैलाया जाता है। पाड़ के चढ़ने से पहले, इलेक्ट्रोस्पन ट्यूब को 25 मिमी ट्यूबों(चित्रा 1G)में काटा जाना चाहिए और माइक्रोआर्किटेक्चर(चित्रा 1एच-I)का विश्लेषण करने के लिए एसईएम के साथ जांच की जा सकती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस उदाहरण में पीसीएल-बीयू ग्राफ्ट को किसी अन्य इलास्टोमेरिक ऊतक इंजीनियर ग्राफ्ट (प्राकृतिक या सिंथेटिक मूल, विभिन्न माइक्रोआर्किटेचर या पोरोसिटी) द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। अंदर बाहर डिजाइन अत्यधिक असुरक्षित कलम के परीक्षण की अनुमति देता है के रूप में यह जरूरी रिसाव मुक्त होना जरूरी नहीं है । प्रवाह संस्कृति कक्ष की योजनाबद्ध छवि डब्ल्यूएसएस (समीकरण 1), दबाव ढाल (समीकरण 2), और परिधि खिंचाव (समीकरण 3)(चित्रा 1J)का वर्णन करने के लिए समीकरणों में उपयोग किए जाने वाले मापदंडों की भौतिक व्याख्या दिखाती है।

प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों के गलत निष्पादन के परिणामस्वरूप कुछ परिदृश्य हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, हाइड्रोलिक जलाशय से रिसाव गलत तरीके से घुड़सवार समुद्री मील के परिणामस्वरूप हो सकता है, जिससे सिलिकॉन ट्यूब से गुजरने वाले छेद के साथ दबाव नाली से हाइड्रोलिक द्रव का रिसाव हो सकता है और प्रवाह संस्कृति कक्ष(चित्रा 2 ए)में प्रवेश कर सकता है। पेंच धागे और बायोरिएक्टर बेस के बीच संबंध में हाइड्रोलिक तरल पदार्थ का रिसाव तब भी हो सकता है जब सिलिकॉन रिंग अच्छी तरह से नहीं रखा जाता है या यदि टेफ्लॉन बेलो को प्रयोग(चित्रा 2 बी)से एक दिन पहले O/N का विस्तार करने की अनुमति नहीं थी। इसके अलावा, जब मध्यम को विकृत नहीं किया जाता है, या यदि मध्यम जलाशयों में मध्यम स्तर अच्छी तरह से संतुलित नहीं होते हैं और एक मध्यम जलाशय शुष्क होता है, जिसके परिणामस्वरूप हवा को सिस्टम में चूसा जाता है, तो प्रवाह संस्कृति कक्ष(चित्रा 2C)में हवा के बुलबुले उत्पन्न हो सकते हैं, जो डब्ल्यूएस पैटर्स को परेशान करता है, सेल व्यवहार्यता और बाद में ऊतक विकास से समझौता करता है। अंत में, जब नीचे के डिब्बे में सिलिकॉन ओ-रिंग को सही ढंग से नहीं रखा जाता है, तो प्रवाह संस्कृति कक्ष(चित्रा 2डी)के नीचे मध्यम रिसाव देखा जा सकता है।

चूंकि यह बायोरिएक्टर सेटअप व्यक्तिगत और संयुक्त हीमोडायनामिक लोड के अनुप्रयोग के लिए अनुमति देता है, इसलिए कई हीमोडायनामिक रूप से लोड किए गए प्रयोगात्मक समूहों को एक प्रयोग(चित्र 3 ए)में शामिल किया जा सकता है। इससे पहले, विभिन्न हेमोडायनामिक लोड (यानी, दो कतरनी तनाव व्यवस्थाओं और दो खिंचाव व्यवस्थाओं) को विभिन्न संभावित सिस्टम सेटिंग्स(चित्रा 3B)लागू करके मान्य किया गया था। जब दीर्घकालिक संस्कृति अवधि में खिंचाव(चित्रा 3 सी)और डब्ल्यूएसएस(चित्रा 3 डी)की निगरानी की गई, तो यह मान्य किया गया कि इन्हें 20 दिनों तक की अवधि में अपेक्षाकृत निरंतर स्तर पर बनाए रखा जा सकता है।

बायोरिएक्टर विशेष रूप से सीटू वैस्कुलर ते संदर्भ में विकास और रीमॉडलिंग पर हीमोडायनामिक लोडिंग के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। सीटू ते में के चरणों को प्राकृतिक घाव भरने की प्रतिक्रिया(चित्रा 4 ए)के चरणों को दर्पण करने के लिए परिकल्पना की जाती है। मानव सैफेनस नसों से प्राप्त मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज और मायोफिब्रोब्लास्ट की सह-संस्कृतियों को, जैसा कि यहां वर्णित है, को प्रसारीय चरण की इन विट्रो नकल के रूप में स्थापित किया गया था। सीडिंग के तीन दिन बाद, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला ने पाड़(चित्रा 4B)में दोनों सेल प्रकारों का समरूप वितरण दिखाया। सह-संस्कृति के 20 दिनों के बाद, अकेले चक्रीय खिंचाव के परिणामस्वरूप अधिक असंख्य और मोटे कोलेजन प्रकार I फाइबर का जमाव हुआ, जबकि संयुक्त हीमोडायनामिक भार वाले समूह में, चक्रीय खिंचाव के इस प्रभाव को कतरनी तनाव से खारिज कर दिया गया था, जिसके परिणामस्वरूप कम स्पष्ट कोलेजन प्रकार मैं जमाव, इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग(चित्रा 4C)द्वारा यहां सचित्र था। सीटू ऊतक उत्थान में सफल होने के लिए, ऊतक उत्पादन और पाड़ अवशोषण के बीच एक तंग संतुलन की आवश्यकता है। ऊतक गठन के अलावा, बायोरिएक्टर सेल-संचालित पाड़ अवशोषण को शामिल करने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, जब इलेक्ट्रोस्पन ग्राफ्ट पर 8 दिनों के लिए मैक्रोफेज की मोनो-कल्चर को तैयार किया जाता है, तो सभी हीमोडायनामिक लोडिंग व्यवस्थाओं में फाइबर कटाव और फाइबर क्लीवेज देखे गए, जिसमें स्थिर समूह में सबसे स्पष्ट अवशोषण और कतरनी तनाव समूह(चित्रा 4 डी)में सबसे कम स्पष्ट अवशोषण के साथ। साथ में, ये परिणाम विकास और रीमॉडलिंग दोनों पर विभिन्न हीमोडायनामिक लोडिंग व्यवस्थाओं का प्रभाव दिखाते हैं। ये अंतर्दृष्टि सीटू तेवजी में नए विकसित के लिए डिजाइन मापदंडों को अनुकूलित करने में सहायक हैं।

ऊतक पुनर्जनन प्रक्रिया का एक और महत्वपूर्ण निर्धारक समर्थक और विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स की उपस्थिति है। चूंकि बायोरिएक्टर एक बंद-लूप सिस्टम है, इसलिए सिस्टम में कोशिकाएं लगातार स्रावित कारकों की पैराक्राइन उत्तेजनाओं के संपर्क में आ जाएंगी। मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल (पीबीएमसी) की गतिशील रूप से भरी हुई सह-संस्कृतियों के माध्यम में साइटोकिन स्राव प्रोफाइल-व्युत्पन्न मैक्रोफेज और सैफेनस नसों से मानव myofibroblasts का प्रारंभिक और बाद के चरणों(चित्रा 5A)में विश्लेषण किया गया था। ये प्रतिनिधि परिणाम सह-संस्कृति सेटअप में साइटोकिन स्राव प्रोफ़ाइल पर चक्रीय खिंचाव और कतरनी तनाव दोनों के प्रभाव को दर्शाते हैं। दिलचस्प बात यह है कि दोनों भारों के संयुक्त प्रभावों ने दो भारों में से एक का प्रभुत्व दिखाया (उदाहरण के लिए, इंटरल्यूकिन-6 (आईएल-6) और मोनोसाइट केमोएट्रेक्टेंट प्रोटीन-1 (एमसीपी-1)) के लिए चक्रीय खिंचाव या दोनों भार (जैसे, आईएल-10 के लिए)(चित्रा 5B)के सहक्रियात्मक प्रभाव। इन अंतर्दृष्टि, इस इन विट्रो परीक्षण मंच का उपयोग करके इकट्ठे हुए, सीटू तेवजी में के विकास के लिए मूल्यवान जानकारी देते हैं जो सीटू ऊतक उत्थान में मैक्रोफेज-संचालित के औचित्य पर आधारित हैं।

मैक्रोफेज और मायोफिब्रोब्लास्ट के सह-संस्कृति प्रयोगों से पता चला है कि यांत्रिक वातावरण और परिणामस्वरूप लोडिंग-निर्भर भड़काऊ वातावरण ने माइफिब्रोब्लास्ट के फेनोटाइप को संग्राहक किया। हेमोडायनामिक लोडिंग के 20 दिनों के बाद, माइफिब्रोब्लास्ट मार्कर की जीन अभिव्यक्ति ने लोडिंग के व्यक्तिगत और संयुक्त प्रभाव में स्पष्ट अंतर दिखाया और माइफिब्रोब्लास्ट(चित्रा 6 ए)पर मैक्रोफेज के प्रत्यक्ष और पैराक्राइन सिग्नलिंग में। इसके अलावा, संकुचन मार्कर अल्फा चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन के जीन अभिव्यक्ति पैटर्न प्रोटीन संश्लेषण(चित्रा 6B)के साथ सहसंबद्ध । इसके अलावा, चक्रीय खिंचाव ने कोलेजनस और लोचदार मैट्रिक्स जीन अभिव्यक्ति और तनु मैट्रिक्स मेटललोप्रोटीनेज 1/ऊतक अवरोधक मैट्रिक्स मेटललोप्रोटीज़ 1-मध्यस्थता कोलेजन रिमॉडलिंग को उत्तेजित किया, जबकि सह-संस्कृति(चित्रा 6C)में कतरनी तनाव का स्थिर प्रभाव देखा गया। ये दीर्घकालिक सह-संस्कृति प्रयोग इस बायोरिएक्टर के साथ ऊतक इंजीनियर वैस्कुलर ग्राफ्ट में विभिन्न हेमोडायनामिक लोडिंग व्यवस्थाओं में बाद के चरण ऊतक रीमॉडलिंग चरण(चित्रा 4 ए)का अध्ययन करने की संभावना दिखाते हैं। के रूप में TEVG एक सिलिकॉन ट्यूब पर "अंदर बाहर" घुड़सवार हैं, परिपत्र खिंचाव और WSS लंबी संस्कृति अवधि के लिए लागू किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: बायोरिएक्टर का डिजाइन और अवलोकन। (A)बायोरिएक्टर बेस का निर्माण ड्राइंग और(बी)तरल संस्कृति कक्ष के सभी भागों के साथ विस्फोट दृश्य (चरण 2.4-2.8)। प्रवाह संस्कृति कक्ष के शीर्ष डिब्बे में एक प्रवाह सीधा होता है। (ग)गोलाकार कुंद नाक शंकु प्रवाह सीधा करने के बाद वलयाकार चैनल के माध्यम से प्रवाह वितरित करने के लिए तैनात है (प्रवाह गुलाबी में संकेत दिया दिशा) । (घ)एक साथ, इन घटकों को नियंत्रण और गाइड प्रवाह दिशात्मकता । व्यक्तिगत रूप से उल्लिखित भागों के कार्यात्मक विवरण के लिए तालिका 1 देखें। (ई)पूर्ण बायोरिएक्टर सेटअप (चरण 5.2) और(एफ)की तस्वीर प्रवाह संस्कृति कक्षों और वायवीय सिलेंडर (चरण 5.6.1)का एक क्लोज-अप दृश्य। (जी)सीडिंग से पहले इलेक्ट्रोस्पन पीसीएल-बीयू पाड़ की सकल उपस्थिति (शासक टिक 1 मिमी)। ट्यूबलर इलेक्ट्रोस्पन पीसीएल-बीयू पाड़ की इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म छवियों को स्कैन करना 3 मिमी आंतरिक व्यास और विभिन्न आवर्धन, स्केल बार(एच)100 माइक्रोन और(I)10 माइक्रोन (चरण 1.3)पर 5 माइक्रोन औसत फाइबर व्यास के साथ। (J)संस्कृति कक्ष की योजनाबद्ध छवि जिसमें एक ट्यूबलर इलेक्ट्रोस्पन पाड़ शामिल है, जिसमें बाहरी त्रिज्या(आर1)आंतरिक त्रिज्या(आर2)की कांच की ट्यूब में केंद्रित है। प्रवाह(क्यू)इनलेट्स और आउटलेट वलयाकार रिंग से जुड़े होते हैं, जिसमें वॉल कतरनी तनाव (टी) लगाने के लिए चैनल हाइट एच होता है। दबाव/खिंचाव(पी)इनलेट सिलिकॉन-माउंटेड पाड़ से जुड़ा हुआ है, जो अंदर से घुड़सवार इलेक्ट्रोस्पन मचान (चरण 6.1)के लिए एक परिधि खिंचाव(λ (टी))लागू करने के लिए है। संक्षिप्त: पॉलीकैप्रोलैकेक्टोन बिसुरिया (पीसीएल-बीयू)। पैनल सी, डी और जी-जे वान Haaften एट अल19से अनुकूलित किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

बायोरिएक्टर पार्ट्स कार्यात्मक विवरण
स्ट्रेच एप्लीकेशन
वायवीय सिलेंडर ऐक्टुट्स टेफ्लॉन बेलो।
टेफ्लॉन बेलो हाइड्रोलिक जलाशय लोड करता है।
हाइड्रोलिक जलाशय 8 प्रवाह संस्कृति कक्षों के साथ जोड़ा जा सकता है, डेमी पानी से भरा हुआ है, सिलिकॉन घुड़सवार निर्माण के लिए दबाव लागू होता है।
पेंच धागा प्रवाह संस्कृति कक्ष और हाइड्रोलिक जलाशय के बीच कनेक्शन। सिलिकॉन घुड़सवार निर्माण के लिए दबाव इनलेट।
सफेद ल्यूयर कनेक्टर हाइड्रोलिक जलाशय/बायोरिएक्टर बेस पर आठ पेंच धागे में से एक को तंग प्रवाह संस्कृति चैंबर पेंच करने के लिए इस्तेमाल किया ।
छोटे छेद के साथ दबाव नाली हाइड्रोलिक जलाशय में पानी से सीधे जुड़ा हुआ। जब हाइड्रोलिक जलाशय पर दबाव डाला जाता है, तो दबाव नाली सिलिकॉन ट्यूब (जो दबाव नाली पर घुड़सवार है) के बीच में पानी के साथ जगह भरती है, सिलिकॉन ट्यूबिंग को बाहर की ओर धकेलती है, जिसके परिणामस्वरूप सिलिकॉन पर एक परिधि खिंचाव होता है।
सिलिकॉन ट्यूबिंग दबाव नाली पर इलेक्ट्रोस्पन भ्रष्टाचार माउंट करने के लिए। सिलिकॉन ट्यूबिंग को परिस्थितिजन्य रूप से अंदर से फैलाया जाता है।
प्रवाह आवेदन
फ्लो पंप सिस्टम प्रवाह संस्कृति कक्षों में प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया। (हमारे उदाहरण में: एक आईबिदी पंप सिस्टम का उपयोग किया जाता है।
फ्लो इनलेट और आउटलेट के साथ ऊपर और नीचे के डिब्बे प्रवाह संस्कृति कक्ष को प्रवाह पाश में जोड़ता है।
ग्लास ट्यूब केंद्र में दबाव पाड़ शामिल है और पाड़ के परफ्यूजन की अनुमति देता है।
फ्लो स्ट्रेटनर अपेक्षाकृत कम बसने की लंबाई में प्रवाह को स्थिर करता है।
नाक शंकु प्रवाह को समान रूप से वितरित करता है।
एडाप्टर बुशिंग कांच की नली को ठीक करता है।
सिलिकॉन ओ-रिंग मीडियम के रिसाव को रोकता है।

तालिका 1: बायोरिएक्टर मुख्य विशेषताओं का कार्यात्मक विवरण, चित्रा 1A-D में इंगित भागों से मेल खाती है।

Figure 2
चित्रा 2: प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों के गलत निष्पादन के परिणाम। कुछ घटनाओं की तस्वीरें जो बायोरिएक्टर सेटअप में देखी जा सकती हैं जब महत्वपूर्ण कदम सही तरीके से नहीं किए जाते हैं। (क)यदि गाँठ पर्याप्त रूप से तंग नहीं है या उत्कीर्ण नाली (तीर द्वारा इंगित) में बिल्कुल नहीं रखा गया है, तो प्रवाह संस्कृति कक्ष में हाइड्रोलिक द्रव का मामूली रिसाव हो सकता है(चरण 2.5)। (ख)यदि टेफ्लॉन बेलो को प्रयोग से एक दिन पहले O/N का विस्तार करने की अनुमति नहीं थी या जब सिलिकॉन रिंग अच्छी तरह से नहीं रखा गया है, तो पेंच धागे और बायोरिएक्टर बेस के बीच संबंध में हाइड्रोलिक तरल से हाइड्रोलिक तरल रिसाव हो सकता है (तीर द्वारा इंगित) (चरण 1.4 और 5.2.3)। (ग)प्रवाह संस्कृति कक्ष में हवा बुलबुले (तीर द्वारा इंगित) परेशान कतरनी तनाव पैटर्न में परिणाम होगा । हमेशा संस्कृति माध्यम को डगैस करें और सुनिश्चित करें कि मध्यम जलाशयों में मध्यम स्तर को एक जलाशय को रोकने के लिए संतुलित किया जाता है जो शुष्क और हवा को प्रवाह कक्ष प्रणाली (चरण 1.2 और 5.5.4)में चूसा जा रहा है। (घ)जब नीचे के डिब्बे में सिलिकॉन रिंग को सही ढंग से नहीं रखा जाता है, तो माध्यम का बिखराव (तीर द्वारा इंगित) (चरण 2.4.2)मनाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: कतरनी तनाव और खिंचाव का नियंत्रण। चूंकि बायोरिएक्टर खिंचाव और कतरनी के स्वतंत्र और संयुक्त अनुप्रयोग के लिए अनुमति देता है,(ए)कई प्रयोगात्मक समूहों को एक प्रयोग में शामिल किया जा सकता है। (ख)अधिकतम हिस्सों में भिन्नता के उदाहरण और कतरनी चार अलग प्रणाली सेटिंग्स (रंगों द्वारा इंगित) के तहत परीक्षण समय में एक विशिष्ट बिंदु पर तनाव । काले आयत प्रत्येक सेटिंग के लिए माप के मानक विचलन ± मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं। बिंदीदार रेखाओं की गणना चार अलग-अलग लोडिंग स्थितियों को इंगित करने के लिए खंडों(क्षैतिज रेखा)और कतरनी तनाव(ऊर्ध्वाधर रेखा)के मतलब के रूप में की जाती है। (ग)चक्रीय खंड में चक्रीय परिधि फैला है और 20 दिनों के प्रयोग के दौरान संयुक्त समूहों, पाड़ के बाहरी व्यास माप के आधार पर उच्च गति कैमरा (चरण ६.२)की एक समय चूक के साथ निगरानी की निर्माण । (घ)निगरानी की दीवार कतरनी सिरिंज (चरण 6.1)में बदलते मध्यम स्तर के आधार पर प्रयोग के दौरान कतरनी तनाव और संयुक्त समूहों में तनाव । पैनल ए, सी और डी को वैन हाफटेन और विस्सिंग एट अल44से अनुकूलित किया गया था; पैनल बी वान Haaften एट अल से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: सीटू वैस्कुलर ऊतक इंजीनियरिंग, सेल वितरण, ऊतक उत्पादन, और पाड़ क्षरण में की अवधारणा। (क)मेजबान के कार्यात्मक स्थल पर पाड़ चालित ऊतक उत्थान के परिकल्पना चरणों को दर्शाते हुए एक योजनाबद्ध चित्रण । दिखाए गए परिणाम उन प्रयोगों से प्राप्त होते हैं जो प्रसारीय चरण पर केंद्रित होते हैं, जिसमें मैक्रोफेज और ऊतक उत्पादक कोशिकाओं ने पाड़ सामग्री को उपनिवेश किया है। (ख)तीसरे दिन इलेक्ट्रोस्पन पाड़(ग्रे)के बाहरी हिस्से में मानव सैफेनस नस(लाल)और पीबीएमसी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज(ग्रीन)वितरण से Myofibroblasts । स्केल बार 200 माइक्रोन(सी)सह-संस्कृति का क्रॉस-सेक्शन दिन 20 में काज़न टाइप 1(हरा),कोलेजन टाइप III(लाल)और डीएपीआई(सफेद)के लिए दागदार। स्केल बार 100 माइक्रोन, * निर्माण के बाहरी पक्ष को इंगित करता है, प्रवाह पक्ष के अनुरूप। (घ)8 दिनों के मैक्रोफेज मोनोकल्चर के डिसेलुलराइज्ड ग्राफ्ट की एसईएम छवियां मैक्रोफेज डिज क्षरण दिखाती हैं; स्केल बार 20 माइक्रोन। संक्षिप्त रूप: मानव सैफेनस वेनस कोशिकाएं (एचवीएससी); परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल (पीबीएमसी); 4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल (DAPI); इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) स्कैनिंग। पैनल ए को विस्सिंग और बोनिटो एट अल27से अनुकूलित किया गया था; पैनल बी और सी वैन Haaften और Wissing एट अल44से अनुकूलित किया गया; और पैनल डी Wissing एट अल43से अनुकूलित किया गया था . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5: हेमोडायनामिक रूप से लोड सह-संस्कृति में भड़काऊ वातावरण 3 दिन और 20 दिनों में निर्माण करता है। मानव पीबीएमसी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज और मानव माइफिलोस्ट की सह-संस्कृति सफीन नसों से। (A)मल्टीप्लेक्स एलिसा के माध्यम से सुपरनेंट में मापा गया कुल साइटोकिन स्राव का हीट मैप। (ख)20 दिन में साइटोकिन्स के चयन के लिए Boxplots, कुल डीएनए सामग्री के लिए सामान्यीकृत । पी-मानों की गणना डन के कई तुलना परीक्षण के साथ क्रुस्कल-वालिस परीक्षण का उपयोग करके की गई थी; * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** संक्षिप्त नाम: मेटललोप्रोटीन (टीएमपी), मैट्रिक्स मेटललोप्रोटीज़ (एमएमपी), इंटरल्यूकिन (आईएल), मोनोसाइट केमोएट्रेक्ट प्रोटीन 1 (एमसीपी-1) के ऊतक अवरोधक, विकास कारक बीटा को बदलने 1 (TGF-11), कनेक्टिव टिश्यू ग्रोथ फैक्टर (सीटीजीएफ), ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा (टीएनएफ-α), प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक (पीडीजीएफ), स्टैटिक (एसटी), चक्रीय खिंचाव (सीएस), कतरनी तनाव (एसएस) । पैनल ए और बी को वान हाफटेन और विस्सिंग एट अल44से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: 20 दिन में संवहनी निर्माणों में हीमोडायनामिक लोडिंग के जवाब में माइोफिब्रोब्लास्ट फेनोटाइप और मैट्रिक्स विकास और रीमॉडलिंग के मार्कर में परिवर्तन। (क)मायोफिब्रोब्लास्ट-विशिष्ट फेनोटाइपिक मार्कर की सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति। (ख)क्रॉस-सेक्शन αSMA(ग्रीन)और DAPI(ब्लू),स्केल बार 100 माइक्रोन के लिए दाग। (ग)कोलेजनस मैट्रिक्स, लोचदार मैट्रिक्स, प्रोटेओग्लाइकन, और रीमॉडलिंग जीन से संबंधित जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति। पी-मानों की गणना डन के कई तुलना परीक्षण के साथ क्रुस्कल-वालिस परीक्षण का उपयोग करके की गई थी; * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001. संक्षिप्त नाम: S100 कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन A4 (S100A4), अल्फा चिकनी मांसपेशी actin (αSMA या ACTA2), कैल्पोनिन 1 (CNN1), स्मूथलिन (SMTN), विमेंटिन (VIM), कोलेजन I (COL1A1), इलास्टिन (ELN), वर्सिकन (वीसीएएन), मैट्रिक्स मेटललोप्रोटीन (एमएमपी), मेटललोप्रोटीज़ (टीआईएमपी), स्टैटिक (एसटी), चक्रीय खिंचाव (सीएस), कतरनी तनाव (एसएस), 4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल (DAPI) के ऊतक अवरोधक। # पता लगाने की सीमा पर या उससे नीचे मापा जाता है। पैनल ए, बी, और सी वैन Haaften और Wissing एट अल४४से अनुकूलित किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा S1: प्रोटीन अभिव्यक्ति myofibroblast-और मैक्रोफेज-मोनोकल्चर व्यक्तिगत और संयुक्त हीमोडायनामिक भार के अधीन। (A)माइकोफीब्रोब्लास्ट्स की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां, ऐक्टिन फाइबर(हरे),नाभिक(लाल)और पाड़(नीला)के साथ 10 दिनों के लिए सुसंस्कृत, स्थिर नमूनों की तुलना में लोड किए गए नमूनों में एक स्पष्ट ऐक्टिन फाइबर ओरिएंटेशन दिखाती है, जिसमें कोई तरजीही कार्यन फाइबर दिशा नहीं देखी जा सकती है। स्केल बार 50 माइक्रोन (बी)कोलेजन(हरे)और नाभिक/पाड़(सफेद)के लिए दाग एक ही myofibroblast मोनोकल्चर की कॉन्फोकल छवियां । स्केल बार 50 माइक्रोन।(C)आईएल-6, टीएनएफ-α, एमसीपी-1 (प्रो-भड़काऊ) और आईएल-10, आईएल-13, एमएमपी-9 (एंटी-इंफ्लेमेटरी) के साइटोकिन स्राव स्तर के आधार पर गणना M1/M2 अनुपात के साथ, 8 दिनों के लिए स्थिर और गतिशील रूप से सुसंस्कृत THP1-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के प्रोटीन स्राव प्रोफाइल के Boxplots। एमसीपी-1 ग्राफ में डॉट एक सांख्यिकीय ग़ैर का प्रतिनिधित्व करता है । (घ)एरिसा डेटा 8 दिन में स्थिर और गतिशील रूप से सुसंस्कृत मैक्रोफेज के सापेक्ष प्रोटीन स्राव के स्तर के समर्थक भड़काऊ, विरोधी भड़काऊ, विकास, और रिमॉडलिंग प्रोटीन के औसत स्राव की तुलना में (प्रोटीन का स्तर प्रति समूह औसत डीएनए सामग्री के लिए सही किया गया) । डॉट्स और छायांकित क्षेत्रों में क्रमशः 50 वें और 25वें -75वें शतमक का संकेत मिलता है। संक्षिप्त: मोनोसाइट केमोट्रेक्टेंट प्रोटीन 1 (एमसीपी-1), इंटरल्यूकिन (आईएल), ग्रोथ फैक्टर बीटा (टीजीएफ-β), मैट्रिक्स मेटललोप्रोटीज (एमएमपी), प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक (पीडीजीएफ), कनेक्टिव टिश्यू ग्रोथ फैक्टर (सीटीजीएफ), ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा (टीएनएफ-α), एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा)। * पी < 0.05; ** पी < 0.01, *** पी < 0.001। पैनल ए और बी वैन Haaften एट अलसेअनुकूलित किया गया । पैनल सी और डी को विसिंग एट अल43से अनुकूलित किया गया था। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां वर्णित बायोरिएक्टर ट्यूबलर पुनर्संरभुज मचानों में सूजन और ऊतक उत्थान पर कतरनी तनाव और चक्रीय खिंचाव के व्यक्तिगत और संयुक्त प्रभावों के योगदान के व्यवस्थित मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण वैस्कुलर निर्माणों पर किए जाने वाले विभिन्न प्रकार के विश्लेषणों को भी सक्षम बनाता है, जैसा कि प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में उदाहरण है। ये परिणाम तेवजी निर्माण के विकास और पुनर्मॉडलिंग दोनों पर विभिन्न हीमोडायनामिक लोडिंग व्यवस्थाओं (यानी, कतरनी और खिंचाव के विभिन्न संयोजनों) के विशिष्ट प्रभाव को दर्शाते हैं। इन अंतर्दृष्टि, इस इन विट्रो मंच के माध्यम से एकत्र, सीटू TEVGs में नए विकसित के लिए पाड़ डिजाइन मापदंडों के अनुकूलन में सहायता । एक उचित प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह सुनिश्चित करने के लिए, महत्वपूर्ण कदमों और इस प्रोटोकॉल की सीमाओं की समझ महत्वपूर्ण है।

प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम नमूनों के लिए खिंचाव के आवेदन से संबंधित हैं। स्ट्रेच एप्लीकेशन के लिए यह जरूरी है कि सेटअप लीक-फ्री हो । सिस्टम में दो कमजोर बिंदु हैं: दबाव नाली और बायोरिएक्टर आधार और प्रवाह संस्कृति कक्षों के बीच संबंध के लिए इलेक्ट्रोस्पन ग्राफ्ट बढ़ते समुद्री मील। जैसा कि चरण 2.5.2 और 2.5.4 में वर्णित है, कई, तंग समुद्री मील को उत्कीर्ण नाली में बिल्कुल तैनात किया जाना चाहिए। यदि गाँठ पर्याप्त तंग नहीं है या नाली के थोड़ा ऊपर या नीचे रखा गया है, तो प्रवाह संस्कृति कक्ष में हाइड्रोलिक तरल पदार्थ का मामूली रिसाव हो सकता है। इस रिसाव का पता हाइड्रोलिक जलाशय में दबाव में गिरावट और सेट दबाव मूल्य तक पहुंचने के लिए तनाव पंप पर लगातार बढ़ती वोल्टेज के रूप में लगाया जा सकता है। इसके अलावा, यह प्रवाह संस्कृति कक्ष में एक परेशान प्रवाह की ओर जाता है, सेल संस्कृति के प्रदूषण का खतरा बढ़ जाता है, और माध्यम का कमजोर पड़ने। एक बार ऐसा होने के बाद, फ्लो कल्चर चैंबर को प्रयोग से बाहर ले जाना पड़ता है, और हाइड्रोलिक जलाशय पर पेंच धागा को सफेद लुएर कैप के साथ बंद किया जाना चाहिए। एक पूर्ण नमूना लेने का यह प्रमुख उपाय, जो अन्य सात प्रवाह संस्कृति कक्षों के लिए प्रयोग को उचित रूप से जारी रखने के लिए आवश्यक है, वास्तव में उत्कीर्ण खांचे में तंग समुद्री मील रखने के महत्व पर जोर देता है। तभी हाइड्रोलिक जलाशय में पानी और प्रवाह संस्कृति कक्षों में माध्यम के बीच उचित पृथक्करण सुनिश्चित किया जा सकता है । मचान के बढ़ते की मजबूती में सुधार करने के लिए, दबाव नाली में खांचे बायोरिएक्टर के एक संशोधित संस्करण में थोड़ा गहरा बनाया जाएगा, आसान और बेहतर गाँठ प्लेसमेंट के लिए अनुमति देता है और इस प्रकार, माध्यम से हाइड्रोलिक तरल पदार्थ के सुरक्षित जुदाई ।

रिसाव का एक और संभावित स्रोत बायोरिएक्टर बेस के स्क्रू थ्रेड और प्रवाह संस्कृति कक्ष के सफेद लूयर कनेक्टर्स के बीच है। टेफ्लॉन सामग्री के संभावित पहनने और आंसू के कारण, रिसाव (चरण 5.2.3)को रोकने के लिए एक अतिरिक्त सिलिकॉन ओ-रिंग जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, तनाव पंप के टेफ्लॉन बेलो को प्रयोग (चरण 1.4)से एक दिन पहले O/N का थोड़ा विस्तार करने की अनुमति दी जानी चाहिए। यदि रिसाव होता है, तो खोए हुए हाइड्रोलिक तरल पदार्थ को आठ स्क्रू धागे (सुई और लचीले तार के साथ सिरिंज का उपयोग) के माध्यम से थोड़ी मात्रा में अल्ट्रापुरे पानी जोड़कर मुआवजा दिया जाना चाहिए। प्रवाह संस्कृति कक्ष के नीचे के डिब्बे पर स्क्रू थ्रेड और सफेद लुयर कनेक्टर के बीच पैराफिल्म के एक छोटे से टुकड़े के साथ प्रवाह संस्कृति कक्ष को वापस रखें। भविष्य के प्रयोगों में इस रिसाव के मुद्दे को दूर करने के लिए, बायोरिएक्टर बेस पर वर्तमान टेफ्लॉन स्क्रू धागे को सिस्टम के पहनने से रोकने के लिए बायोरिएक्टर के अगली पीढ़ी के संस्करण में स्टेनलेस स्टील धागे द्वारा प्रतिस्थापित किया जाएगा।

खिंचाव में भिन्नता(चित्रा 3सी)डब्ल्यूएसएस(चित्रा 3 डी)में भिन्नता से बड़ा है, क्योंकि खिंचाव को नियंत्रित करना अधिक कठिन है। फिर भी, रिसाव को रोकने के उपायों के अलावा, अन्य उपाय हैं जो खिंचाव में भिन्नता को सीमित करते हैं: (i) बांसुरी में हवा के बुलबुले से बचना (चरण 1.4 और 5.2.1),(ii) विभिन्न नमूनों (चरण 2.5.3) के बीच लगातार पूर्व-खिंचाव सुनिश्चित करना, और (iii) विभिन्न नमूनों (चरण 1.3)के बीच लगातार पाड़ गुणों को सुनिश्चित करना।

अंत में, सिलिकॉन ट्यूबिंग (चरण 2.3)पर इलेक्ट्रोस्पन पाड़ बढ़ते समय अतिरिक्त सावधानी की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, जब नाजुक इलेक्ट्रोस्पन पाड़ को फैला सिलिकॉन ट्यूबिंग पर खींचने की आवश्यकता होती है, तो यह महत्वपूर्ण है कि इलेक्ट्रोस्पन भ्रष्टाचार को क्षतिग्रस्त होने से रोकने के लिए बहुत अधिक बल लागू न किया जाए, विशेष रूप से इलेक्ट्रोस्पन भ्रष्टाचार के अंदर। यदि विद्युत कलम के अंदर नुकसान होता है, या तो सशक्त खींचने से या सिलिकॉन ट्यूब के बहुत कमजोर खींच से, इलेक्ट्रोस्पन फाइबर को नुकसान की हद तक केवल निर्माण काटा और विश्लेषण के बाद दिखाई देता है । वर्तमान सेटअप में, नमूने का त्याग करने के बाद, सीडिंग की सफलता की पुष्टि केवल इम्यूनोफ्लोरेसेंस या इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण पर की जा सकती है। हालांकि, सेल कैरियर के रूप में फाइब्रिन के साथ सीडिंग प्रक्रिया एक अच्छी तरह से स्थापित विधि67 है जो आम तौर पर पर्याप्त रूप से बड़े ताकना आकार के साथ मचान के लिए एक समरूप सेल वितरण की ओर जाता है। कोशिका सीडिंग के संबंध में सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक यह सुनिश्चित करना है कि पाड़ बीज बोने से पहले जितना संभव हो उतना सूखा है (चरण 4.4),कोशिकाओं के साथ फाइब्रिन जेल को गीले पाड़ से गुजरने से रोकने के लिए, जिसके परिणामस्वरूप असंगत सीडिंग होती है। अंत में, हालांकि यूवी विकिरण द्वारा इलेक्ट्रोस्पन भ्रष्टाचार की विसंदूषण विधि और 30% इथेनॉल में सूई के रूप में वीवो अध्ययन में के लिए तैयार इलेक्ट्रोस्पन ग्राफ्ट की नसबंदी के रूप में कठोर नहीं है, जो अक्सर एथिलीन ऑक्साइड या गामा विकिरण द्वारा निष्फल किए जाते हैं, यह इन विट्रो संस्कृति प्रयोगों के लिए पर्याप्त है जो संदूषण के किसी भी संकेत के बिना 20 दिनों तक चल सकते हैं (उदाहरण के लिए, चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6,और वान हैफटेन और विस्सिंग (2020)44)। इसके अलावा, पीसीएल-बीयू सामग्री जो यहां उपयोग की जाती है, उच्च इथेनॉल सांद्रता के लंबे संपर्क के लिए अनुमति नहीं देती है। उपयोग की जाने वाली सामग्री के आधार पर सबसे उपयुक्त नसबंदी विधि चुनी जा सकती है।

पहले किए गए सह-संस्कृति अध्ययनों के परिणामों के अलावा, एक ही प्रणाली के साथ अध्ययन की एक व्यापक विविधता का प्रदर्शन किया जा सकता है। इस प्रणाली को पहले myofibroblasts(अनुपूरक चित्रा 1A-B)और मैक्रोफेज(अनुपूरक चित्रा 1C-D)के गतिशील मोनोकल्चर प्रदर्शन करने के लिए नियोजित किया गया था ताकि व्यक्तिगत सेल प्रकारों पर हीमोडायनामिक लोडिंग के प्रभावों की जांच की जा सके और उनके पैराक्राइन सिग्नलिंग19,43। विभिन्न हीमोडायनामिक लोडिंग व्यवस्थाओं के परिणामस्वरूप 10 दिनों के बाद मायोफिब्रोब्लास्ट(अनुपूरक चित्रा 1 ए)और अलग-अलग कोलेजन जमाव(अनुपूरक चित्रा 1B)में स्पष्ट ऐक्टिन फाइबर ओरिएंटेशन हुआ। THP1-व्युत्पन्न मैक्रोफेज द्वारा साइटोकिन उत्पादन विभिन्न हीमोडायनामिक लोड(अनुपूरक चित्रा 1 सी)के बीच काफी अलग था और लोड होने पर एक अधिक समर्थक भड़काऊ प्रोफ़ाइल दिखाया गया(अनुपूरक चित्रा 1D)। अन्य मान्य संभावनाओं में एक अतिरिक्त पंप और तरल इकाई का उपयोग करके आदोलनीय प्रवाह का अनुप्रयोग शामिल है। माध्यम की चिपचिपाहट रक्त चिपचिपाहट की सीमा की ओर बढ़ाया जा सकता है (उदाहरण के लिए, xanthan गम जोड़कर)69. मध्यम चिपचिपाहट को मॉडुलन लागू कतरनी तनावों की सीमा को व्यापक बनाने के लिए एक अतिरिक्त चर का प्रतिनिधित्व करता है। अंत में, हालांकि वर्णित प्रोटोकॉल 'इबीडी' प्रवाह-कंडीशनिंग सेटअप को नियोजित करता है, अन्य निर्माताओं से सेटअप का उपयोग भी किया जा सकता है, जब तक कि समान प्रवाह व्यवस्थाएं लागू की जा सकती हैं।

इस बायोरिएक्टर सिस्टम का उपयोग करने के प्रमुख फायदों में से एक अपेक्षाकृत बड़ा निर्माण (लगभग 15 मिमी x 10.5 मिमी) है जिसे हेमोडायनामिक रूप से लोड किया जा सकता है, जिससे एक ही नमूने से विभिन्न प्रकार के संभावित रीडआउट पैरामीटर निकाले जा सकते हैं। साथ ही, निर्माण आकार को एक सीमा के रूप में भी देखा जा सकता है, क्योंकि इस सेटअप को अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में (कभी-कभी महंगी) सामग्री की आवश्यकता होती है, खासकर यदि प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है, या यदि संस्कृति माध्यम को महंगे योजक की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, सेटअप का थ्रूपुट अपेक्षाकृत कम है। नतीजतन, वर्तमान सेटअप विशेष रूप से परिकल्पना-चालित अनुसंधान के लिए अनुकूल है जिसमें सीमित संख्या में चरों का व्यापक परीक्षण किया जाता है, बजाय सीमित रीडआउट के साथ बड़ी संख्या में चरों की स्क्रीनिंग के बजाय। भविष्य के प्रयोगों के लिए, वर्तमान सेटअप पर छोटे सुधार किए जा रहे हैं ताकि छोटे मचान बढ़ते और मध्यम जलाशयों के आकार को डाउनस्केलिंग के लिए विकल्प मिल सके । उत्तरार्द्ध के संबंध में, मध्यम जलाशयों की वर्तमान मात्रा वांछित कतरनी तनावों को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त मात्रात्मक प्रवाह दरों को सक्षम करने के लिए आवश्यक है। आवश्यक प्रवाह दर- और उसके साथ, मध्यम जलाशयों की मात्रा को मध्यम की चिपचिपाहट बढ़ाकर कम किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एक्सथन गम जोड़कर, जैसा कि पहलेस्थापित 69)।

समाप्त करने के लिए, यह बायोरिएक्टर टिश्यू ग्रोथ पर कतरनी तनाव और चक्रीय खिंचाव के व्यक्तिगत और संयुक्त प्रभावों के मात्राकरण के लिए अनुमति देता है और इलास्टोमेरिक 3 डी बायोमैटेरियल मचानों की एक विस्तृत विविधता पर रीमॉडलिंग करता है। बायोरिएक्टर विभिन्न लोडिंग शर्तों के तहत आठ संवहनी निर्माणों तक संस्कृति कर सकता है। इसके डिजाइन के कारण, बायोरिएक्टर विशेष रूप से हीमोडायनामिक्स और सीटू वैस्कुलर टी प्रक्रियाओं के बीच परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को एलएसएच 2Treat कार्यक्रम (436001003) और डच किडनी फाउंडेशन (14a2d507) के हिस्से के रूप में ZonMw द्वारा आर्थिक रूप से समर्थित किया गया है। N.A.K. यूरोपीय अनुसंधान परिषद (८५१९६०) से समर्थन स्वीकार करते हैं । हम कृतज्ञता से गुरुत्वाकर्षण कार्यक्रम "सामग्री संचालित उत्थान" स्वीकार करते हैं, जो नीदरलैंड ऑर्गनाइजेशन फॉर साइंटिफिक रिसर्च (024.003.013) द्वारा वित्त पोषित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM) Gibco 12491-015 cell culture medium for fibroblasts
Aqua Stabil Julabo 8940012 prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogen Sigma F8630 to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombin Sigma T4648 to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Centrifuge Eppendorf 5804 to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor - "kelly forceps" Almedic P-422 clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubators Sanyo MCO-170AIC-PE for cell culturing
Compressed air reservoir Festo CRVZS-5 smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretches Matlab R2017. The Mathworks, Natick, MA calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition board National Instruments BNC-2090 data processing in between amplifier system and computer
Ethanol VWR VWRK4096-9005 to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS) Greiner 758087 cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipet Assistant HE40567002 apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamber Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology n.a. part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMax Gibco 35050061 cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed camera MotionScope M-5 to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens Nikon JAA616AB to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clip ibidi GmbH 10821 block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads ibidi GmbH 10902 set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped) Swann Morton 0301; 0933 to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW Software National Instruments version 2018 to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV light Labconco 302310001 to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishes Greiner 664-160 for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C) Sigma A8960 cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500 Zeiss Schott AG to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps ibidi GmbH various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories) to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS) PEEKEL instruments B.V. n.a. to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders ibidi GmbH 10974 medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter Rubber BV 1805 to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio Software Idtvision 2.15.00 to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G) BD Microlance 301700 together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driver Adson 2429218 to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissues Kleenex 38044001 for cleaning of the equipment with 70% ethanol
Parafilm Sigma P7793-1EA quick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S) Lonza DE17-602E cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P4417-100TAB for storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw caps Greiner 206202 to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinder Festo AEVC-20-10-I-P to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length) SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands n.a. produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control) Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducer BD TC-XX and P 10 EZ the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensor Festo MPPES-3-1/8-2-010, 159596 provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) Gibco A1049101 cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL) Eppendorf 30120086 multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20% Sigma 5030 Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.  
Silicone O-rings Technirub 1250S to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness) Rubber BV 1805 to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL) Falcon 352095 multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle Ethicon, Johnson&Johnson EH7404H Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL) B. Braun Melsungen AG 2057932 to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm) Satorius 17597-K to filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter cap Nunc 178983 to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter cap Nunc 156499 to culture static control samples
Teflon bellow Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel) PolarWare 15-248 for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
Tweezers Wironit 4910 sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure water Stakpure Omniapure UV 18200002 to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV light Philips TUV 30W/G30 T8 for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding

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References

  1. Chlupác, J., Filová, E., Bacáková, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiological Research. 58, Suppl 2 119-139 (2009).
  2. Huygens, S. A., et al. Bioprosthetic aortic valve replacement in elderly patients: Meta-analysis and microsimulation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 157 (6), 2189-2197 (2019).
  3. Huygens, S. A., et al. Contemporary outcomes after surgical aortic valve replacement with bioprostheses and allografts: a systematic review and meta-analysis. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (4), 605-616 (2016).
  4. Loh, S. A., et al. Mid- and long-term results of the treatment of infrainguinal arterial occlusive disease with precuffed expanded polytetrafluoroethylene grafts compared with vein grafts. Annals of Vascular Surgery. 27 (2), 208-217 (2013).
  5. Tara, S., et al. Vessel bioengineering. Circulation Journal. 78 (1), 12-19 (2014).
  6. Huang, A. H., Niklason, L. E. Engineering of arteries in vitro. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (11), 2103-2118 (2014).
  7. Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M., Baaijens, F. P. T. Can we grow valves inside the heart? Perspective on material-based in situ heart valve tissue engineering. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 54 (2018).
  8. Fioretta, E. S., et al. Next-generation tissue-engineered heart valves with repair, remodelling and regeneration capacity. Nature Reviews Cardiology. , (2020).
  9. Kirkton, R. D., et al. Bioengineered human acellular vessels recellularize and evolve into living blood vessels after human implantation. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
  10. Gutowski, P., et al. Arterial reconstruction with human bioengineered acellular blood vessels in patients with peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. , (2020).
  11. Syedain, Z., et al. Tissue engineering of acellular vascular grafts capable of somatic growth in young lambs. Nature Communications. 7 (12951), 12951 (2016).
  12. Sugiura, T., et al. Tissue-engineered vascular grafts in children with congenital heart disease: intermediate term follow-up. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery. 30 (2), 175-179 (2018).
  13. Kluin, J., et al. In situ heart valve tissue engineering using a bioresorbable elastomeric implant - material design to 12 months follow-up in sheep. Biomaterials. 125, 101-117 (2017).
  14. Fioretta, E. S., et al. Differential leaflet remodeling of bone marrow cell pre-seeded versus nonseeded bioresorbable transcatheter pulmonary valve replacements. JACC. Basic to Translational Science. 5 (1), 15-31 (2020).
  15. Van Haaften, E. E., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A. Vascular mechanobiology: towards control of. Cells. , 1-24 (2017).
  16. De Jonge, N., et al. Matrix production and organization by endothelial colony forming cells in mechanically strained engineered tissue constructs. PLoS ONE. 8 (9), 73161 (2013).
  17. Schmidt, J. B., Chen, K., Tranquillo, R. T. Effects of intermittent and incremental cyclic stretch on ERK signaling and collagen production in engineered tissue. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (1), 55-64 (2016).
  18. Luo, J., et al. Tissue-engineered vascular grafts with advanced mechanical strength from human iPSCs. Cell Stem Cell. 26 (2), 251-261 (2020).
  19. Van Haaften, E. E., et al. Decoupling the effect of shear stress and stretch on tissue growth and remodeling in a vascular graft. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (7), 418-429 (2018).
  20. Gupta, V., Tseng, H., Lawrence, B. D., Jane Grande-Allen, K. Effect of cyclic mechanical strain on glycosaminoglycan and proteoglycan synthesis by heart valve cells. Acta Biomaterialia. 5 (2), 531-540 (2009).
  21. Lin, S., Mequanint, K. Bioreactor-induced mesenchymal progenitor cell differentiation and elastic fiber assembly in engineered vascular tissues. Acta Biomaterialia. 59, 200-209 (2017).
  22. Venkataraman, L., Bashur, C. A., Ramamurthi, A. Impact of cyclic stretch on induced elastogenesis within collagenous conduits. Tissue Engineering. Part A. 20 (9-10), 1403-1415 (2014).
  23. Huang, A. H., et al. Biaxial stretch improves elastic fiber maturation, collagen arrangement, and mechanical properties in engineered arteries. Tissue Engineering Part C Methods. 22 (6), 524-533 (2016).
  24. Hinderer, S., et al. In vitro elastogenesis: instructing human vascular smooth muscle cells to generate an elastic fiber-containing extracellular matrix scaffold. Biomedical Materials. 10 (3), 034102 (2015).
  25. Eoh, J. H., et al. Enhanced elastin synthesis and maturation in human vascular smooth muscle tissue derived from induced-pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 52, 49-59 (2017).
  26. Smits, A. I. P. M., Bouten, C. V. C. Tissue engineering meets immunoengineering: Prospective on personalized in situ tissue engineering strategies. Current Opinion in Biomedical Engineering. 6, 17-26 (2018).
  27. Wissing, T. B., Bonito, V., Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M. Biomaterial-driven in situ cardiovascular tissue engineering-a multi-disciplinary perspective. npj Regenerative Medicine. 2 (1), 18 (2017).
  28. Hibino, N., et al. A critical role for macrophages in neovessel formation and the development of stenosis in tissue-engineered vascular grafts. The FASEB Journal. 25 (12), 4253-4263 (2011).
  29. Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. Macrophages are required for adult salamander limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).
  30. Godwin, J. W., Debuque, R., Salimova, E., Rosenthal, N. A. Heart regeneration in the salamander relies on macrophage-mediated control of fibroblast activation and the extracellular landscape. npj Regenerative Medicine. 2 (1), 22 (2017).
  31. McBane, J. E., Cai, K., Labow, R. S., Santerre, J. P. Co-culturing monocytes with smooth muscle cells improves cell distribution within a degradable polyurethane scaffold and reduces inflammatory cytokines. Acta Biomaterialia. 8 (2), 488-501 (2012).
  32. Battiston, K. G., Ouyang, B., Labow, R. S., Simmons, C. A., Santerre, J. P. Monocyte/macrophage cytokine activity regulates vascular smooth muscle cell function within a degradable polyurethane scaffold. Acta Biomaterialia. 10 (3), 1146-1155 (2014).
  33. Ploeger, D. T., et al. Cell plasticity in wound healing: paracrine factors of M1/ M2 polarized macrophages influence the phenotypical state of dermal fibroblasts. Cell Communication and Signaling. 11 (1), 29 (2013).
  34. McBane, J. E., Santerre, J. P., Labow, R. S. The interaction between hydrolytic and oxidative pathways in macrophage-mediated polyurethane degradation. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 82 (4), 984-994 (2007).
  35. Wissing, T. B., et al. Macrophage-driven biomaterial degradation depends on scaffold microarchitecture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 87 (2019).
  36. Wolf, M. T., Vodovotz, Y., Tottey, S., Brown, B. N., Badylak, S. F. Predicting in vivo responses to biomaterials via combined in vitro and in silico analysis. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (2), 148-159 (2015).
  37. Grotenhuis, N., Bayon, Y., Lange, J. F., Van Osch, G. J. V. M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M. A culture model to analyze the acute biomaterial-dependent reaction of human primary macrophages. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 115-120 (2013).
  38. Jannasch, M., et al. A comparative multi-parametric in vitro model identifies the power of test conditions to predict the fibrotic tendency of a biomaterial. Scientific Reports. 7 (1), 1689 (2017).
  39. Wang, Z., et al. The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(ε-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration. Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).
  40. McWhorter, F. Y., Davis, C. T., Liu, W. F. Physical and mechanical regulation of macrophage phenotype and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (7), 1303-1316 (2014).
  41. Ballotta, V., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Strain-dependent modulation of macrophage polarization within scaffolds. Biomaterials. 35 (18), 4919-4928 (2014).
  42. Dziki, J. L., et al. The effect of mechanical loading upon extracellular matrix bioscaffold-mediated skeletal muscle remodeling. Tissue Engineering. Part A. 24 (1-2), 34-46 (2018).
  43. Wissing, T. B., et al. Hemodynamic loads distinctively impact the secretory profile of biomaterial-activated macrophages - implications for in situ vascular tissue engineering. Biomaterials Science. 8 (1), 132-147 (2020).
  44. Van Haaften, E. E., Wissing, T. B., Kurniawan, N. A., Smits, A. I. P. M., Bouten, C. V. C. Human in vitro model mimicking material-driven vascular regeneration reveals how cyclic stretch and shear stress differentially modulate inflammation and matrix deposition. Advanced Biosystems. 4 (6), 1900249 (2020).
  45. Ballotta, V., Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Synergistic protein secretion by mesenchymal stromal cells seeded in 3D scaffolds and circulating leukocytes in physiological flow. Biomaterials. 35 (33), 9100-9113 (2014).
  46. Bonito, V., de Kort, B. J., Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M. Cyclic strain affects macrophage cytokine secretion and extracellular matrix turnover in electrospun scaffolds. Tissue Engineering Part A. 25 (17-18), 1310-1325 (2019).
  47. Battiston, K. G., Labow, R. S., Simmons, C. A., Santerre, J. P. Immunomodulatory polymeric scaffold enhances extracellular matrix production in cell co-cultures under dynamic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 24, 74-86 (2015).
  48. Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. A mesofluidics-based test platform for systematic development of scaffolds for in situ cardiovascular tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (6), 475-485 (2012).
  49. Smits, A. I. P. M., Ballotta, V., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. T. Shear flow affects selective monocyte recruitment into MCP-1-loaded scaffolds. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (11), 2176-2188 (2014).
  50. Ballotta, V., Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Synergistic protein secretion by mesenchymal stromal cells seeded in 3D scaffolds and circulating leukocytes in physiological flow. Biomaterials. 35 (33), 9100-9113 (2014).
  51. Fahy, N., Menzel, U., Alini, M., Stoddart, M. J. Shear and dynamic compression modulates the inflammatory phenotype of human monocytes in vitro. Frontiers in Immunology. 10, 383 (2019).
  52. Pennings, I., et al. Layer-specific cell differentiation in bi-layered vascular grafts under flow perfusion. Biofabrication. 12 (1), 015009 (2019).
  53. Wang, J., et al. Ex vivo blood vessel bioreactor for analysis of the biodegradation of magnesium stent models with and without vessel wall integration. Acta Biomater. 50, 546-555 (2017).
  54. Huang, A. H., et al. Design and use of a novel bioreactor for regeneration of biaxially stretched tissue-engineered vessels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (8), 841-851 (2015).
  55. Huang, A. H., Niklason, L. E. Engineering biological-based vascular grafts using a pulsatile bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (52), e2646 (2011).
  56. Bono, N., et al. A Dual-mode bioreactor system for tissue engineered vascular models. Annals of Biomedical Engineering. 45 (6), 1496-1510 (2017).
  57. Wolf, F., et al. VascuTrainer: a mobile and disposable bioreactor system for the conditioning of tissue-engineered vascular grafts. Annals of Biomedical Engineering. 46 (4), 616-626 (2018).
  58. Ramaswamy, S., et al. A novel bioreactor for mechanobiological studies of engineered heart valve tissue formation under pulmonary arterial physiological flow conditions. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (12), 121009 (2014).
  59. Piola, M., et al. A compact and automated ex vivo vessel culture system for the pulsatile pressure conditioning of human saphenous veins. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (3), 204-215 (2016).
  60. Vanerio, N., Stijnen, M., de Mol, B. A. J. M., Kock, L. M. An innovative ex vivo vascular bioreactor as comprehensive tool to study the behavior of native blood vessels under physiologically relevant conditions. Journal of Engineering and Science in Medical Diagnostics and Therapy. 2 (4), (2019).
  61. Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplantation. 27 (9), 1375-1389 (2018).
  62. Sinha, R., et al. A medium throughput device to study the effects of combinations of surface strains and fluid-flow shear stresses on cells. Lab on a Chip. 15 (2), 429-439 (2015).
  63. Beca, B. M., Sun, Y., Wong, E., Moraes, C., Simmons, C. A. Dynamic bioreactors with integrated microfabricated devices for mechanobiological screening. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 581-592 (2019).
  64. Liu, H., Usprech, J., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform with hydrogel arrays for 3D mechanical stimulation of cells. Acta Biomaterialia. 34, 113-124 (2016).
  65. Szafron, J. M., Ramachandra, A. B., Breuer, C. K., Marsden, A. L., Humphrey, J. D. Optimization of tissue-engineered vascular graft design using computational modeling. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 561-570 (2019).
  66. Emmert, M. Y., et al. Computational modeling guides tissue-engineered heart valve design for long-term in vivo performance in a translational sheep model. Science Translational Medicine. 10 (440), (2018).
  67. Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26 (16), 3113-3121 (2005).
  68. van Kelle, M. A. J., et al. A Bioreactor to identify the driving mechanical stimuli of tissue growth and remodeling. Tissue Engineering Part C: Methods. 23 (6), (2017).
  69. van den Broek, C. N., et al. Medium with blood-analog mechanical properties for cardiovascular tissue culturing. Biorheology. 45 (6), 651-661 (2008).

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