En multi-cue bioreaktor för att utvärdera biomaterialens inflammatoriska och regenerativa kapacitet under flöde och sträckning

Summary

Målet med detta protokoll är att genomföra en dynamisk samkultur av mänskliga makrofager och myofibroblaster i rörformiga elektrospunställningar för att undersöka materialdriven vävnadsregenerering, med hjälp av en bioreaktor som möjliggör frikoppling av saxstress och cyklisk stretch.

Abstract

Användningen av resorbable biomaterial för att inducera regenerering direkt i kroppen är en attraktiv strategi ur ett translationellt perspektiv. Sådana material inducerar ett inflammatoriskt svar vid implantation, vilket är drivkraften för efterföljande resorption av materialet och regenerering av ny vävnad. Denna strategi, även känd som in situ vävnadsteknik, eftersträvas för att erhålla kardiovaskulära ersättningar såsom vävnadskonstruerade vaskulär ympkvistar. Både de inflammatoriska och regenerativa processerna bestäms av de lokala biomekaniska signalerna på ställningen (dvs. stretch och shear stress). Här beskriver vi i detalj användningen av en specialutvecklad bioreaktor som unikt möjliggör frikoppling av sträck- och savspänning på en rörformig byggnadsställning. Detta möjliggör systematisk och standardiserad utvärdering av den inflammatoriska och regenerativa kapaciteten hos rörformiga byggnadsställningar under påverkan av välkontrollerade mekaniska belastningar, vilket vi demonstrerar på grundval av ett dynamiskt samkulturexperiment med hjälp av mänskliga makrofager och myofibroblaster. De viktigaste praktiska stegen i detta tillvägagångssätt - konstruktion och inrättandet av bioreaktorn, beredning av byggnadsställningar och cellfröning, applicering och underhåll av sträck- och saxflöde och provskörd för analys - diskuteras i detalj.

Introduction

Kardiovaskulär vävnadsteknik (TE) eftersträvas som ett alternativt behandlingsalternativ till de för närvarande använda permanenta kardiovaskulära proteserna (t.ex. kärltransplantat, hjärtklaffbyten), som är suboptimala för stora kohorter av patienter^1,2,3,4. Mycket eftertraktade applikationer inkluderar vävnadskonstruerade kärltransplantat (TEVGs)^5,6 och hjärtklaffar (TV-apparater)^7,8. Oftast använder kardiovaskulära TE-metoder resorbable biomaterial (antingen naturliga eller syntetiska) som fungerar som en lärorik byggnadsställning för den nya vävnaden som ska bildas. Bildandet av ny vävnad kan antingen konstrueras helt in vitro, genom att så ställningen med celler och odling i en bioreaktor före implantation (in vitro TE)^9,10,11, eller direkt på plats, där den syntetiska byggnadsställningen implanteras utan förodling för att inducera bildandet av ny vävnad direkt i kroppen (in situ TE)^12,13,14. För både in vitro- och in situ kardiovaskulära TE-metoder är framgångsrik funktionell regenerering dominerande beroende av både värdens immunsvar på den implanterade konstruktionen och lämplig biomekanisk belastning.

Vikten av biomekanisk belastning för kardiovaskulär TE är väl erkänd¹⁵. När det gäller kardiovaskulära implantat utsätts cellerna som fyller ställningen för cyklisk stretch och saxspänningar som uppstår till följd av den hemodynamiska miljön. Många studier har rapporterat den stimulerande effekten av (cyklisk) sträckning på bildandet av matriskomponenter, såsom kollagen^16,17,18,19,glykosaminoglykaner (GAGs)²⁰, och elastin^21,22, av olika celltyper. Till exempel visade Huang et al. att biaxial stretch förhöjde nedfallet och organisationen av kollagen och elastin i in vitro TEVGs med hjälp av en vaskulär bioreaktor²³. Medan betoningen vanligtvis ligger på stretch som den dominerande belastningen, använder dessa studier ofta flödesdrivna bioreaktorer där provet också utsätts för saxflöde. Även om relativt lite är känt om den isolerade påverkan av skjuvspänningar på vävnadsbildning och inflammation i 3D, finns vissa data tillgängliga. Till exempel visade Hinderer et al. och Eoh et al. att savflödet, förutom en 3D-byggnadsställningsmikrostruktur, var viktigt för bildandet av mogna elastin av mänskliga vaskulära glatta muskelceller i ett in vitro-modellsystem^24,25. Sammantaget illustrerar dessa resultat relevansen av både cyklisk stretch och shear stress för kardiovaskulär TE.

En annan viktig avgörande faktor för framgången eller misslyckandet med TE-implantat är värdens immunsvar på det implanterade transplantatet²⁶. Detta är särskilt viktigt för materialdrivna IN situ TE-strategier, som faktiskt förlitar sig på det akuta inflammatoriska svaret på ställningen för att kickstarta de efterföljande processerna för cellulär tillströmning och endogen vävnadsbildning och ombyggnad²⁷. Makrofaget är en kritisk initiativtagare till funktionell vävnadsregenerering, vilket har visats av flera^{studier 28,29,30}. Analogt med sårläkning styrs regenereringen av vävnad av parakrina signalering mellan makrofager och vävnadsproducerande celler som fibroblaster och myofibroblaster^31,32,33. Förutom att samordna ny vävnad nedfall, makrofager är inblandade i aktiv resorption av främmande byggnadsställning material^34,35. Som sådan har in vitro-makrofagsvaret på ett biomaterial identifierats som en prediktiv parameter för in vivo-framgång av^{implantat 36,37,38}.

Makrofatsvaret på en implanterad byggnadsställning är beroende av byggnadsställningar design funktioner som materialkomposition och mikrostruktur^35,39,40. Förutom byggnadsställningar påverkas makrofatsvaret på en byggnadsställning och deras crosstalk med myofibroblaster också av hemodynamiska belastningar. Till exempel visade sig cyklisk sträcka vara en viktig modulator av makrofag fenotyp^41,42,43,44 och utsöndring av cytokiner^43,44,45,46 i 3D elektrospunställningar. Med hjälp av ett samkultursystem av makrofager och vaskulär glatt muskelceller visade Battiston et al. att förekomsten av makrofager ledde till ökade nivåer av elastin och GAGs och att måttliga nivåer av cyklisk stretch (1,07-1,10) stimulerade nedfallet av kollagen I och elastin⁴⁷. I tidigare arbeten har vi visat att savstress är en viktig determinant för monocytrekrytering till 3D-elektrospunställningar^48,49, och att både shear stress och cyklisk stretch påverkar parakrin signalering mellan mänskliga monocyter och mesenchymala stromal celler⁵⁰. Fahy et al. visade att savflödet ökade utsöndring av proinflammatoriska cytokiner med mänskliga monocyter⁵¹.

Sammantaget visar ovanstående bevis att en adekvat förståelse för och kontroll över hemodynamiska belastningar är avgörande för kardiovaskulär TE, och att det är viktigt att överväga det inflammatoriska svaret för att uppnå detta. Många bioreaktorer har beskrivits tidigare för in vitro^52,53 ,^{54,55,56,57,58 eller} ex vivo^59,60,61 kultur av kardiovaskulära vävnader. Alla dessa system är dock utformade för att efterlikna de fysiologiska hemodynamiska belastningsförhållandena så mycket som möjligt. Även om detta är mycket värdefullt för att skapa kardiovaskulära vävnader in vitro eller upprätthålla ex vivo kulturer, tillåter sådana system inte systematiska studier av de enskilda effekterna av enskilda signaler. Detta beror på att tillämpningen av både cyklisk stretch och savspänning i dessa bioreaktorer drivs av samma trycksatta flöde, som i sig länkar dem. Medan mikrosystem som möjliggör noggrann mekanisk manipulering med flera signaler har beskrivits för 2D-substrat⁶² eller 3D-hydrogelinställningar^63,64, tillåter sådana inställningar inte införlivande av elastomeric 3D biomaterialställningar.

Här presenterar vi tillämpningen av ett rörformigt bioreaktorsystem som unikt möjliggör frikoppling av saxstress och cyklisk stretch och hjälper till att mekanistiskt undersöka deras individuella och kombinerade effekter. Detta system möjliggör testning av ett brett utbud av vävnadskonstruerade kärltransplantat (t.ex. syntetiskt eller naturligt ursprung, olika mikroarkitektur, olika porositeter). För att effektivt frikoppla tillämpningen av savspänning och sträckning är de viktigaste begreppen som bioreaktorn använder (1) separation av kontrollen av savspänning och sträckning med hjälp av distinkta pumpsystem och (2) stimulering av byggnadsställningarna på ett "utifrån och ut"-sätt med beräkningsdrivna dimensioner. Flödet appliceras på den rörformiga byggnadsställningens utsida genom användning av en flödespump, medan byggnadsställningens omkretssträcka induceras genom att utöka ett silikonrör på vilket ställningen är monterad genom användning av en separat belastningspump. Dimensionerna på silikonröret och glasröret som innehåller konstruktionen väljs noggrant och valideras med hjälp av simuleringar av beräkningsvätskans dynamik, för att säkerställa att savspänningen på ställningen (på grund av flöde) och den cirkumferentiella sträckan (på grund av rörexpansion) inte påverkar varandra nämnvärt. Denna inifrån och ut-design har flera praktiska skäl. Om stretch appliceras av det luminala vätsketrycket (liknar fysiologisk belastning) kräver det i sig att provdesignen är läckagefri. Dessutom skulle det tryck som krävs för att sträcka provet helt bestämmas av provets styvhet, som kan variera mellan proverna och inom ett prov över tiden, vilket gör det svårt att kontrollera sträckan. Denna bioreaktor monterar det vävnadskonstruerade transplantatet runt ett silikonrör och möjliggör väggskjuvspänning (WSS) på transplantatets yttervägg och pressar transplantatet från insidan. På så sätt kan lika belastningsförhållanden mellan prover och inom prover över tid säkerställas, och dessutom får proverna vara läckande, vilket är vanligt för porösa kärlställningar¹⁹. Denna inifrån och ut bioreaktor är särskilt avsedd för systematiska studier på effekterna av sax och/eller stretch, snarare än konstruktion av ett inhemskt liknande blodkärl in vitro, för vilket traditionella vaskulär bioreaktorinställningar är mer lämpliga. Se figur 1A–B för bioreaktordesignritningarna och motsvarande tabell 1 för en funktionell beskrivning och motivering bakom bioreaktorns huvudkomponenter.

Användningen av bioreaktorn demonstreras på grundval av en serie nyligen genomförda studier av vår grupp där vi undersökte de individuella och kombinerade influenserna av savstress och cyklisk sträckning på inflammation och vävnadsbildning i resorbable elektrospunställningar för in situ kardiovaskulär^{vävnad 19,43,44}. För detta ändamål använde vi mänskliga makrofager och myofibroblaster antingen i mono- eller samkultur för att simulera de olika faserna av in situ regenerativ kaskad. Vi har visat att cytokin utsöndring av mänskliga makrofager påverkas tydligt av både cyklisk stretch och shear stress, påverkar matris nedfall och organisation av mänskliga myofibroblaster i dessa byggnadsställningar, både via parakrina signalering och direkt kontakt^19,43,44. Dessa studier visade särskilt att vid kombinerad applicering av saxstress och stretch domineras effekterna på vävnadsbildning och inflammation antingen av en av de två belastningarna, eller det finns synergistiska effekter av båda belastningarna. Dessa resultat illustrerar relevansen av frikoppling av båda belastningarna för att få en bättre förståelse för den mekaniska miljöns bidrag till TE-processer. Denna förståelse kan tillämpas för att systematiskt optimera byggnadsställningars designparametrar i relevanta hemodynamiska lastningsregimer. Dessutom kan mekanistiska data från sådana välkontrollerade miljöer fungera som indata för numeriska modeller som utvecklas för att förutsäga kursen för in situ-vävnadsrenovering, som nyligen rapporterades för TEVGs⁶⁵ eller TEHVs⁶⁶, för att ytterligare förbättra prediktiv kapacitet.

Protocol

I de studier som beskrivs i detta protokoll har primära mänskliga makrofager isolerade från perifert blod buffy coats och mänskliga myofibroblaster isolerade från saphenous ven efter födans by-pass kirurgi använts⁴⁴. De buffy coats erhölls från friska, anonymiserade frivilliga som gav skriftligt informerat samtycke, som godkändes av Sanquin Research Institutional Medical Ethical Committee. Användningen av humana vena saphena-celler (HVSC) var i enlighet med "Code Proper Secondary Use of Human Tissue" som utvecklats av Federation of Medical Societies (FMWV) i Nederländerna.

1. Allmänna förberedelser och nödvändiga åtgärder innan bioreaktorn inrättas

OBS: För detaljer om respektive isolerings- och odlingsprotokoll, se tidigare arbete^19,43,44. Alla beräkningar i protokollet ges som exempel för ett samkulturellt experiment med monocyter och myofibroblaster, såddade i 8 hemodynamiskt laddade byggnadsställningar och 2 statiska kontroller (n=10).

1. Starta cellisolering och cellkultur. Såtätheten för de samodlade proverna av monocyter och myofibroblaster (med ett såddförhållande på 2:1) är 30 ×^{10 6} monocyter/cm³ respektive 15 ×^{10 6} myofibroblaster/cm^3.
   OBS: Elektrospunmaterialet har en hög porositet (>90%). För att uppskatta det önskade antalet celler per transplantat beräknas byggnadsställningens volym med formeln för volym av en ihålig cylinder: π^{*(tjocklek) 2}*längd ≈ 0,04 cm³. Den totala mängden celler per transplantat är 1,2 × 10⁶ monocyter och 0,6 × 10⁶ myofibroblaster. För 10 prover krävs minst 12 × 10⁶ monocyter och 6 × 10⁶ myofibroblaster. börja med upp till ~ 10-15% fler celler för att ta hänsyn till möjliga pipettingfel.
2. Avgasar cellkulturmediet som ska användas för experiment som involverar bioreaktorn.
   1. Förbered mediet för samkulturer, som består av RPMI-1640:aDMEM (1:1), kompletterat med 10% fetala nötkreatursserum, 1% penicillin-streptomycin och 0,5% L-glutamin.
   2. Placera mediet över natten (O/N) i en inkubator i en cellkulturkolv med filterlock för avgasning.
   3. Byt ut filterlocket mot ett lufttät lock och förvara det vid 4 °C.
   4. Strax före användning, tillsätt 0,25 mg/ml L-askorbinsyra 2-fosfat (C-vitamin) till mediet.
      OBS: För beräkningar är mängden medium som krävs per flödeskulturkammare 50 ml. Uppdatera mediet tre gånger per vecka. 25 ml gammalt medium ersätts med 25 ml färskt medium. För 10 prover; Efter sådd krävs totalt 500 ml färskt medium, och för varje efterföljande mediumförändring används totalt 250 ml färskt medium. Förbered alltid medium färskt, särskilt vitamin C bör tillsättas strax innan du byter medium.
3. Förbered isotropiska elektrospunställningar (3 mm luminal diameter, 200 μm väggtjocklek) enligt beskrivningen av Van Haaften et al.¹⁹ (Figur 1G–I). Kort sagt, rörformiga polycaprolactone bisurea (PCL-BU) byggnadsställningar produceras genom elektrospinning från 15% (w/w) kloroform-polymer lösningar. Polymerlösningarna är elektrospun vid rumstemperatur och 30% relativ fuktighet, med en flödeshastighet på 40 μL/min, 16 cm avstånd från det roterande cylindriska målet (Ø 3 mm, 500 varv/min) och en anbringad spänning på 16 kV på det elektrospinnande munstycket och -1 kV på målet.
   OBS: Även om PCL-BU ympkvistar användes för dessa experiment, kan ett brett utbud av elastomervävnadskonstruerade ympkvistar monteras i denna bioreaktor (t.ex. av olika syntetiskt eller naturligt ursprung, olika mikroarchitecture, olika porositeter)
   1. Ta bort elektrospunställningarna från dornen.
      1. Gör ett litet hål i locket på ett 15 ml-rör för att "hålla" dornen i mitten och förhindra att den vidrör rör vid rörväggen.
      2. Placera dornen med elektrospunställningen i falkröret och fyll den med avjoniserat vatten.
      3. Frys rören O/N vid -20 °C.
      4. Placera rören i rumstemperatur (RT) och dra ut mandrelsna efter några minuter och lämna elektrospuntransplantaten i isen.
      5. Låt isen tina helt, ta bort elektrospunröret från det tinade vattnet och "häng" för att torka vertikalt i flera timmar. Se till att byggnadsställningarna inte "kollapsar" under sin egen vikt.
   2. Torra byggnadsställningar under vakuum O/N.
   3. Avbilda ett litet prov av elektrospuntransplantaten med hjälp av scanningelektronmikroskopi (SEM) för att bedöma deras mikrostruktur (t.ex. fibermorfologi, fiberdiameter). Transplantaten i exempelstudierna har en isotropisk fiberorientering och en fiberdiameter på 5 μm (Figur 1H–I).
4. En dag innan du påbörjar experimentet, placera den hydrauliska behållaren fylld med avjoniserat vatten i inkubatorn. Stäng alla åtta anslutningarna för flödeskulturkammare med vita Luer-kepsar. Anslut till tryckluftssystemet och sätt in trycksensorn. Kör belastningspumpen (se steg 5.6) O/N för att möjliggöra en liten expansion av Teflonbälgen.
   OBS: Se till att allt material och all nödvändig utrustning rengörs och/eller autoklaveras (se kolumnen Materialförteckning,Kommentarer/Beskrivning för vilken material får autoklaveras), enligt tillverkarens protokoll eller enligt beskrivningen i steg 7.3–7.6.
5. Se till att det finns sterila arbetsförhållanden under resten av protokollet.
   1. Utför steg 2–5.3 (inställning av systemet), steg 6.3 (medelförändring) och steg 7.1–7.2 (skörd av kärlkonstruktioner) i ett sterilt laminärt flödesskåp.
   2. Placera material som inte behövs direkt för de efterföljande stegen i slutna Petri-rätter för att hålla allt så rent som möjligt.
   3. Rengör eller torka materialytor regelbundet genom att blötlägga en pappersvävnad med 70% etanol och torka ytorna på bioreaktorkomponenterna och laminärflödesskåpet.

2. Ställa in bioreaktorn

OBS: Utför steg 2 i ett laminärt flödesskåp.

1. Skär de elektrospunställningarna i rör med en längd av cirka 25 mm och dokumentera dem före användning (t.ex. fotografi för längden, väg med balans för den ursprungliga massan).
2. Dekontaminera elektrospunställningarna.
   1. Placera de elektrospunställningar som lutas i en brunnsplatta eller Petri-skål, med en öppning vänd mot den ultravioletta (UV) ljuskällan, så att UV-ljus (253,7 nm) kan belysa insidan av byggnadsställningarna.
   2. Exponera elektrospunställningarna för UV-ljus i 5 minuter.
   3. Vrid alla byggnadsställningar och upprepa UV-belysningen för den andra öppningen.
      OBS: Efter detta steg, rör bara vid elektrospunställningen vid behov. Använd alltid rena pincett eller rena handskar.
   4. Ta glasrören i flödeskulturkamrarna som lagras i 70%, tvätta glasrören i ultrapurevatten, torka och placera i en stor, sluten Petri-skål.
      OBS: Följande steg, särskilt steg 2.3–2.5, utförs idealiskt av två experimenterare.
3. Montera elektrospunställningarna på silikonslangen.
   1. Fäst 5-0-prolene suturen i ena änden av silikonslangen genom att ta suturen genom ena sidan av röret och ut ur den andra, vilket lämnar två motsatta spända suturer som sträcker sig över rörens tvärsnitt. Gör en liten knut på båda sidor av röret medan du komprimerar röret vid knutarna och lämna cirka 10 cm tråd på båda knutarna. Gör en tredje knut i slutet av de två 10 cm överbåriga ledningarna.
      1. Skär av suturnålen och alla fria trådar som kan sticka ut och skada insidan av elektrospunställningen. Skär bort silikonrörens kanter till en triangulär form för att hjälpa till att dra silikonrören genom elektrospunställningen.
   2. Doppa elektrospunställningen i 30% etanol (detta fungerar som extra dekontamineringssteg och hjälper till att skjuta elektrospunställningen över silikonrören) och placera elektrospunställningen över den fria 10 cm-tråden. Experimenterare A sträcker silikonrören genom att försiktigt dra i både silikonrören och knuten på 10 cm suturtråden, medan experimenteraren B försiktigt skjuter elektrospunställningen över silikonslangen med pincett med en slät innerspets för att förhindra skador på byggnadsställningarna.
   3. Släpp långsamt sträckan på silikonrören, samtidigt som elektrospunställningen jämnas ut med pincett. Doppa elektrospunställningen på silikonslangen i ultrapurvatten två gånger.
      OBS: Det är möjligt att någon rynkar av elektrospunställningen uppstår. Denna rynkning försvinner under den applicerade försträckan precis innan byggnadsställningarna fästs på tryckledningarna i steg 2.5.3.
   4. Upprepa steg 2.3.2 och 2.3.3 för de andra elektrospunställningarna. Beroende på silikonrörens längd kan flera elektrospunställningar monteras på samma silikonrör.
   5. När alla elektrospunställningar är monterade på silikonslangen, skär silikonrören runt ställningarna, alla i samma längd (5,5 cm); på ena sidan, nära änden av elektrospunställningen, på andra sidan, och lämnar ~ 2-3 cm av gratis silikonrör.
4. Konstruera bottenfacket i flödeskulturkammaren (figur 1A–B).
   1. Ta den övre delen av det nedre facket som innehåller flödesutloppet och stäng flödesuttaget med en hane Luer-kontakt.
   2. Tryck tryckröret med hål genom det nedre facket och placera en O-ring silikon runt tryckrörets nedre ände för att förhindra läckage. Skruva fast den nedre delen av det nedre facket i den övre delen av det nedre facket för att säkra tryckröret. Se till att tryckrörets nedre graverade spår är ca 3–5 mm ovanför kanten på adapterbussningen i det nedre utrymmet. Detta kommer senare att "hålla" suturtrådens snäva knut och fästa elektrospunställningen över silikonrören.
      OBS: Om tryckledningen lätt kan manövreras upp och ner indikerar det att det nedre facket inte är väl säkrat. Upprepa steg 2.4.2 för att förhindra läckage i senare skeden (figur 2D).
5. Fäst silikonrören med elektrospunställningen i tryckröret.
   1. Dra silikonröret med elektrospunställningen över tryckröret.
   2. Gör en knut med suturtråden i den nedre änden av elektrospunställningen på platsen för det graverade spåret på tryckröret. Gör en andra knut på motsatt sida för att tätt säkra silikonrören med elektrospuntransplantatet.
      VARNING: Detta är ett kritiskt steg. Se till att knuten exakt "faller" i tryckrörets graverade spår för att förhindra läckage av vattnet från hydraulbehållaren till flödeskulturkamrarna. Om du inte är säker, försök att dra åt suturtråden i flera lägen, ovanför eller under spårets förväntade placering, för att säkerställa att de slutliga knutarna är exakt vid det graverade spåret (Figur 2A).
   3. Placera saxklämman i silikonrörets övre ände och sträck silikonslangen uppåt (detta kommer direkt att testa den första knuten, om det är möjligt att flytta silikonrören med elektrospunställningen över tryckröret, drogs den inte åt tillräckligt bra). Med dragkraften är silikonslangen försträckt. För att säkerställa att silikonslangen är konsekvent mellan de olika proverna, fäst en linjal på saxklämman. Dra saxklämman uppåt tills linjalens nedre ände når höjden på ställningens nedre ände.
      OBS: Det är viktigt att hålla försträckan i varje prov ungefär densamma (~ 5%) av två skäl: (1) om silikonrören är försträckta, kommer det att resultera i mer homogen expansion längs provets längd när den trycksatt; (2) Försträckan kommer att påverka silikonens mekaniska egenskaper, och därför bör den vara densamma för alla prover för att säkerställa lika stretchförhållanden mellan proverna.
   4. Ta bort rynkor i elektrospunställningen genom att försiktigt dra i elektrospunställningen. Återigen, gör två knutar på båda sidor med en suturtråd på den övre änden av ställningen på platsen för det övre graverade spåret på tryckröret.
   5. Lossa saxklämman och skär bort överskottet av silikonrör med en kniv, vilket lämnar 20-30% av skruvgängan täckt med silikonrör, för att förhindra läckage när noskonen är monterad på skruvgängan.
      OBS: Upprepa steg 2.4 och 2.5 för alla dynamiska prover.
   6. För de statiska kontrollproverna, säkra den elektrospunställning som är monterad på silikonslangen på tryckledningar utan hål. Dessa ledningar kan hållas separat i ett 15 ml-rör fram till sådd (steg 4) och behöver inte monteras i flödeskulturkamrarnas fack.
6. Dekontaminera de delvis konstruerade flödeskulturkamrarna med elektrospunställning genom att utsätta den för UV-ljus i 10 minuter. Vrid flödeskulturkamrarna med elektrospunställningar till andra sidan och upprepa UV-ljusexponeringen i 10 minuter.
7. Skruva fast nosrören på tryckrörens skruvgänga med hål för de dynamiska proverna.
   1. Se till att silikonslangens övre ände passar in i noskonen för att förhindra läckage i senare skeden. Om det finns för mycket silikonrör, skär bort överskottet av slangar med en kniv.
   2. Placera de delvis konstruerade flödeskulturkamrarna i en stor petriskål och peka näskonen mot UV-ljuskällan. Applicera UV-belysning i 5 minuter.
8. Fullständig konstruktion av flödeskulturkammaren med glasröret och det övre facket i flödeskulturkammaren (Figur 1A-B).
   1. Förfukta elektrospunställningarna genom att doppa tryckröret med silikonrören och elektrospunställningen i 30% etanol, följt av ett dopp i ultrapurvatten två gånger.
   2. Placera glasröret över tryckröret och tryck försiktigt i bottenfacket och fäst det försiktigt.
   3. Ta det övre facket som innehåller flödesintaget, placera en O-ring i silikon, flödesrätaren och adapterbussningen i rätt ordning (figur 1A-B) och placera den över glasrörets öppna ände och fäst den försiktigt.
   4. Skruva fast ett vitt Luer-lock på inloppet i det övre facket.
   5. Ta bort luerpluggen från det nedre fackets flödesutlopp och rengör ytan runt den med en etanolindränkt pappersvävnad.
   6. Placera en spruta med 10 ml ultrapurevatten i flödesutloppet, öppna det vita Luer-locket på det övre facket och fyll kammaren med ultrapurevatten. Stäng det vita Luer-locket igen, ta bort sprutan, rengör igen med etanol och stäng flödesuttaget med en hane Luer-kontakt.
      OBS: Upprepa steg 2.6–2.8 för alla flödeskulturkammare.
   7. För de statiska kontrollerna, tillsätt 10 ml ultrapurevatten till de 15 ml-rör som håller proverna monterade på tryckledningarna utan hål.
9. Placera alla flödeskulturkammare i inkubatorn. Ersätt ultrapurvattnet med odlingsmedium en dag före cellsådd på samma sätt som beskrivs i steg 2.8.5 och 2.8.6 (se till att samla det "gamla" ultrapurvattnet med en etanolindränkt pappersvävnad placerad direkt på flödesutloppet).

[Protokollet kan pausas här]

3. Förberedelser för flödespumpens inställning

OBS: Utför steg 3 i ett laminärt flödesskåp.

1. Samla alla pumpinställningsmaterial och förbered för användning.
   OBS: Experimenterare hänvisas till tillverkarens protokoll för en detaljerad beskrivning av hur pumpen, de fluidiska enheterna och medelslangarna ska sättas upp genom den fluidiska enhetens ventiler.
   1. Ställ in pumpen på 200 mbar kapacitet.
   2. Skruva fast reservoarhållarna i 60 ml reservoarer på de fluidiska enheterna.
   3. Rengör de återanvändbara gummiluftfiltren med en pappersvävnad indränkt i etanol, se till att luftfiltret förblir torrt.
2. Placera 60 ml-reservoarerna i reservoarhållarna och placera standardmediumslangen genom den fluidiska enhetens ventiler. Anslut medelslangen med en större innerdiameter med kvinnliga Luer-låskopplingar i en sluten slinga.
3. Kläm fast det medelstora slangen med ett slangklämma, direkt under reservoarerna.
4. Fyll reservoarerna med 25 ml odlingsmedium per 60 ml reservoar. Släpp slangklämman och låt mediet komma in i slangen.
5. Stäng de medelstora reservoarerna med gummiluftfiltren och placera flödespumpens inställning i inkubatorn till steg 4.

4. Cell sådd med Fibrin som cellbärare

OBS: Utför steg 4 i ett laminärt flödesskåp.

1. Förbered fibringelen för cellfrösteget. Mer information finns i Mol et al.⁶⁷ För fibringelen bör fibrinogenlösningen ha en slutlig koncentration på 10 mg/ml (korrekt för proteinbeståndets renhet) och trombinlösningen bör ha en slutlig koncentration på 10 U/ml.
   1. Tina fibrinogen till RT, innan du väger ~ 50 mg (tillräckligt för 10 prover) i en plastbehållare med ett rött lock.
   2. Tillsätt cellkulturmedium för att förbereda fibrinogenlösningen (vid en koncentration av 10 mg/ml, korrekt för proteinbeståndens renhet). Blanda väl och filtrera för att sterilisera fibrinogenlösningen med ett 0,2 μm sprutfilter i ett sterilt 15 ml-rör. Håll den filtrerade fibrinogenlösningen på is.
      OBS: Undvik att förbereda fibrinogenlösningen för länge i förväg, annars kan fibrinogenen koagör spontant.
   3. Tina trombin och gör en trombinlösning (vid en koncentration av 10 U/ml) i cellkulturmedium och lägg på is. Förbered 20 μL trombin + celllösning per prov. För n=10 prover behövs 200 μL. Förbered därför 250 μL trombinlösning för att ta hänsyn till eventuella rörfel.
2. Samla in och räkna cellerna från odlingskolvarna. Blanda cellerna i önskat förhållande och mängd (1,2 × 10⁶ monocyter och 0,6 × 10⁶ myofibroblaster per byggnadsställning). Se till att det finns tillräckligt med celler för n+1-prover för att korrigera för pipetting-fel. Centrifugera vid 350 × g i 10 min på RT. Ta bort supernaten.
3. Gör en blandning av de suspenderade cellerna och trombin.
   1. För varje prov, använd 20 μL av trombinlösningen. För n=10 prover, tillsätt 200 μL trombin till cellpelleten och blanda. Mät volymen på cellfjädringen (celler + trombin) och beräkna hur man delar jämnt över alla 10 byggnadsställningar (t.ex. om trombin + cellfjädring har en volym på 260 μL, kommer varje elektrospunprov att få 260 μL/10 prover = 26 μL trombin + cellupphängning).
   2. När sådden av byggnadsställningarna utförs i två steg, förbered två 1,5 ml mikrofugerör som kommer att hålla hälften av cellfjädringen för varje byggnadsställning (i exempelberäkningen av föregående steg: förbered två rör med 13 μL trombin + cellupphängning). Lägg på is.
      OBS: Följande steg, särskilt steg 4.4, utförs idealiskt av två experimenterare.
4. Torka de förtrfukta elektrospunställningarna med vakuum för att förbereda för cellsådd.
   1. Anslut ett glas Pasteurrör till vakuumsystemet i laminärt flödesskåp och placera i ett tomt 50 ml-rör för steril tillfällig förvaring.
   2. Ta ut flödeskulturkamrarna från inkubatorn, ta bort luerpluggen från flödesutloppet och ta bort mediet efter att du öppnat det vita Luer-locket och placerat en etanolindränkt pappersvävnad framför flödesutloppet.
   3. Ta av det övre facket och glasröret och placera i en steril Petri-skål för tillfällig förvaring.
   4. Placera vakuumpastatören på elektrospunställningen och ta bort så mycket medium som möjligt.
      VARNING: Dammsug elektrospunställningen mycket försiktigt. Istället för en fram och tillbaka linjär rörelse över ställningen placerar du vakuumröret på flera platser. Kläm fast vakuumslangen ovanpå Pasteurens rör mellan fingrarna för bättre kontroll.
   5. Blanda fibrinogenlösningen i ett 1:1-förhållande med trombin + cellfjädring (t.ex. blanda 13 μL fibrinogen med 13 μL trombin + cellfjädring). För att säkerställa att fibrinpolymeriserar i ställningen och inte i mikrofugeröret, rör fibrinogenen, vrid rörhjulet för "extra volym" av trombin + cellfjädring och rör upp och ner en gång i mikrofugeröret med cellfjädring att blanda.
   6. Droppa lösningen direkt homogent över hela längden på elektrospunställningen. Det rekommenderas att Experimenter A droppar fibrinblandningen, medan experimenteraren B håller det nedre facket med elektrospunställningen monterad på tryckröret.
   7. Efter att fibrinen med cellerna droppats över elektrospunställningen flyttar Experimenter B långsamt ställningen, från vänster till höger och upp och ner, för att ytterligare dela cellerna jämnt över ställningen.
   8. Upprepa steg 4.4.5 - 4.4.7 på andra sidan av elektrospunställningen.
   9. Montera flödeskulturkammaren igen genom att försiktigt placera glasröret (förhindra att fibrin fastnar och koaguleras på glasrörets inre sida) och tryck tillbaka det övre facket i flödeskulturkammaren. Placera direkt den sådda konstruktionen utan medium eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i flödeskulturkammaren i inkubatorn.
   10. Upprepa steg 4.4.1–4.4.9 för alla dynamiska prover. För de statiska proverna monterade på tryckledningar utan hål, frö enligt steg 4.4.1–4.4.8, och placera i ett 15 ml rör efteråt.
   11. Låt fibrinpolymeren 60 min i inkubatorn.

[Protokollet kan pausas här i 30–60 minuter.]

5. Efter polymerisation fyller du flödeskulturkamrarna (dynamiska prover) eller de 15 ml rören (statiska prover) med medium.

5. Koppling av bioreaktor- och flödespumpsystem innan experiment påbörjas

OBS: Utför steg 5.1–5.3 i ett laminärt flödesskåp.

1. Ta brickan som bär flödeskulturkamrarna och de fluidiska enheterna med fyllda medelstora reservoarer och anslutna medelstora slangar inuti laminära flödesskåp.
2. Placera flödeskulturkamrarna på bioreaktorbasen för de experimentella grupper som är laddade med cyklisk sträckning och med kombinerade hemodynamiska belastningar (figur 1E).
   1. Luta flödeskulturkammaren upp och ner och fyll tryckröret underifrån med ultrapurvatten med en spruta med tunna slangar (detta kan vara av vilken typ som helst, så länge den är flexibel och tunn, i detta experiment var en 10 cm lång, 0,15 mm innerdiametertråd fäst vid nålen).
   2. Placera det tunna slangen inuti tryckröret, och medan tryckröret är fyllt med ultrapurvatten genom att gradvis trycka ut vattnet ur sprutan, dra tråden ur tryckröret samtidigt, för att se till att det inte finns några luftbubblor inuti tryckröret.
   3. Placera flödeskulturkammaren på en av de åtta skruvgängorna på bioreaktorbasen. Placera en O-ring av silikon mellan bioreaktorbasen och den vita Luer-kontakten för att förhindra eventuellt läckage och dra åt den vita Luer-kontakten från det nedre facket.
   4. Upprepa steg 5.2.2 och 5.2.3 för alla cykliskt sträckta prover.
3. Anslut flödeskulturkamrarna för alla experimentella grupper, utom den statiska kontrollen, till flödespumpsystemet.
   1. Placera ett slangklämma på det medelstora slanget. Ta bort det vita Luer-locket som täcker flödesintaget i det övre facket i flödeskulturkammaren. Ta bort det kvinnliga Luer-ankaret på det medelstora slanget och anslut det medelstora slangen på ena sidan med flödesintaget på det övre facket och den andra sidan av det medelstora slangen med flödesutlopp i bottenfacket.
   2. Upprepa steg 5.3.1 för alla flödeskulturkammare. Vid denna tidpunkt fylls bioreaktorn och flödeskulturkamrarna med medium och ansluts till flödessystemen.
   3. För de statiska kontrollproverna placerar du proverna vertikalt i en cellkulturkolv med filterlock med hjälp av saxklämman. Fyll cellkulturkolven med medium och placera i inkubatorn.
4. Överför hela installationen från laminarflödesskåpet till inkubatorn och anslut de fluidiska enheterna till lufttrycksslangen och den elektriska kabeln.
5. Starta programvaran och initiera flödespumparna. Starta medelflödet för proverna en efter en.
   1. Kontrollera om fluidenhetens ventiler klickar.
   2. Ta bort slangklämman från det medelstora slangröret.
   3. Starta flödespumpen med 100 mbar och 10 s omkopplingstid.
   4. Kontrollera noggrant flödesriktningen för eventuellt läckage eller luftbubblor. Eventuella instängda luftbubblor kan avlägsnas genom att vända flödeskulturkammaren upp och ner.
      OBS: Se till att medelnivåerna i medelbehållaren är balanserade, för att förhindra sugning av luft i systemet och luftbubblor i flödeskulturkamrarna och för att inte låta reservoarerna torka (figur 2C).
   5. Upprepa steg 5.5 för alla fluidiska enheter en efter en.
6. Initiera belastningspumpen.
   1. Anslut den pneumatiska aktiverade pumpen via luftintaget på den pneumatiska cylindern till tryckluften. Anslut det nedre luftutloppet med det blå slangen för luftutlopp (Bild 1F).
   2. Öppna LabVIEW-programvaran, kör LabVIEW-skriptet och tryckluftstrycksapplikationssystemet, som beskrivs av Van Kelle et al.⁶⁸, ange deplacement och frekvens (börja med låg frekvens på 0,2 Hz). Pausa pumpen när Teflonbälgen är på sin lägsta nivå.
   3. Placera trycksensorn i trycksensorns inlopp på hydraulbehållaren.
7. Ändra pumpinställningarna till önskade inställningar (för 1,5 Pa, använd 150 mbar, 10 s växlingstid).
8. Starta belastningspumpen och använd önskad inställning (t.ex. 0,5 Hz, 1,05 stretch).

6. Kör experiment i flera dagar; Övervakning av sav och stretch under kultur och medium ersättning

1. Beräkna WSS vid ställningsväggen.
   1. Registrera flödesstorleken varannan dag (se flödespumpens bruksanvisning för mer information). Kort sagt, observera förändringen av vätskenivåerna (i ml) i de medelstora reservoarerna mellan omkopplingen av den fluidiska enhetsbehållaren i 10 s. Utför minst fem mätningar, beräkna medelvärdet och multiplicera med 6 för att få flödeshastigheten Q i ml/min.
   2. Flödet beskrivs av ett Poiseuilleflöde genom en ringformad kanal. Anta odlingsmedium som en newtonsk vätska, beräkna WSS vid ställningsväggen, r₁, med ekvation 1.
      (1)
      där WSS τ_{w vid} ställningsväggen (r₁, här r₁ = 1,7 mm), till följd av ett steady state-flöde, bestäms av det applicerade trycket p och glasrörets inre radie r₂ (här r₂ = 2,3 mm). Tryckgradienten i axiell riktning antas vara enhetlig mellan flödesintaget och flödesutloppet och anges i ekvation 2 (figur 1J).
      (2)
      med μ den dynamiska viskositeten (här antogs medelviskositet konstant, μ = 0,7 × 10^-3 Pa▼s vid 37 °C) och Q det applicerade flödet.
2. Övervaka sträckan som appliceras på byggnadsställningarna varannan dag.
   1. Placera en mörk bakgrund bakom flödeskulturkammaren för att öka kontrasten mellan ställningen och bakgrunden. Placera LED-lamporna, som pekar mot ställningen, för att hjälpa visualiseringen av ställningen.
   2. Ta timelapse-fotografier av ställningen med en frekvens av 30 Hz för 6 s (dvs. 3 stretchcykler) med en höghastighetskamera.
      OBS: En lägre inspelningsfrekvens kan räcka om kameran tillåter det. Den minsta erforderliga frekvensen fastställdes dock inte.
   3. Bestäm manuellt ställningens lägsta och maximala diameter från bilderna.
   4. Beräkna den minsta och högsta ytterdiametern för elektrospunställningen för att beräkna de maximala sträckorna enligt ekvation 3.
      (3)
      omkretssträckan (λ_θ) anges genom förhållandet mellan byggnadsställningens ytterdiameter d₁och dess ursprungliga diameter, d_0.
3. Korrigera för medium avdunstning och uppdatera medium tre gånger per vecka.
   1. Stoppa och frikoppla kablarna till flödessystemen och belastningspumpen.
   2. Placera slangklämmorna på det medelstora slanget.
   3. Bestäm hur mycket medium som avdunstat baserat på volymindikatormärkena på medelbehållare.
   4. Överför brickan med bioreaktorn och de fluidiska enheterna till laminärt flödesskåp.
   5. Ta bort gummiluftfiltren i de medelstora reservoarerna; tillsätt autoklaverat ultrapurvatten för att kompensera för den avdunstade volymen av medium. Stäng de medelstora reservoarerna igen och anslut till pumpen igen för att blanda mediet med ultrapurvattnet.
   6. Upprepa steg 6.3.1–6.3.5. Ta bort gummiluftfiltren igen, ta ut 25 ml odlingsmedium och snurra ner vid 300 × g i 5 minuter på RT.
      1. Samla in 1,5 ml supernatant och förvara vid -30 °C för analys av sekretoriska profiler (för analys med enzymlänkad immunosorbentanalys (ELISA)).
      2. Samla den önskade volymen av supernatant för parakrina signalering studier, genom att använda supernatant som konditionerat medium⁴³.
   7. Tillsätt 25 ml färskt medium till de medelstora reservoarerna.
   8. Placera tillbaka gummiluftfilter på de medelstora reservoarerna.
   9. Placera hela installationen i inkubatorn igen. ansluta alla kablar och luftrör till pumpen och spännpumpen. Lossa slangklämmorna och upprepa steg 5.4–5.8.
4. Kontrollera om kiseldioxidtorkningspärlor i torkflaskorna som är anslutna till pumpen är fuktiga (vitt utseende) och ersätt med torra kiseldioxidpärlor om det behövs (orange utseende).

7. Avsluta experiment, provsamling och rengöring och lagring av utrustning

1. På experimentets sista dag, korrigera för medelhög avdunstning enligt beskrivningen i steg 6.3.1–6.3.5 och skörda proverna en efter en.
   1. För att skörda proverna en efter en måste flödespumpen och stampumpen pausas flera gånger. Placera ett slangklämma på medelstora slangar. Stoppa tillfälligt flödespumpen och belastningspumpen. Koppla bort en flödeskulturkammare från bioreaktorbasen; ersättas med ett vitt Luer-lock på bioreaktorbasen. Ta flödeskulturkammaren och den fluidiska enheten till laminärt flödesskåp. Starta flödespumpen och spännpumpen igen för att applicera den hemodynamiska belastningen på de andra proverna fram till skörden.
   2. Samla medium från de medelstora reservoarerna för parakrina cytokinproduktionsanalys via ELISA.
2. Frikoppla flödesenheter och skörda rörformig konstruktion. Sektion enligt önskat skärschema. Delar av konstruktionen kan förvaras vid 4 °C (efter 15 min fixering i 3,7% formaldehyd och 3 x 5 min tvättning i PBS) eller -30 °C (efter snäppfrysning i flytande kväve) tills vidare analys.
3. Rengör bioreaktor- och pumpkomponenterna. Dessutom nämns den rekommenderade rengöringsmetoden per artikel i materialförteckningen.
   1. Rengör gummiluftfiltren med 70% etanol. Var mycket noga med att inte fukta det inre filtret!
   2. Samla alla separata komponenter: medelstora slangar, medelstora reservoarer, glasrör, hane Luer-pluggar och kvinnliga Luer-lås, vita Luer-lock, tryckledningar, nosrör, silikon O-ringar, adapterbussning, flödesrätångor (exklusive pumpar, fluidiska enheter, gummiluftfilter, bioreaktorbasen) och skölj i rinnande kranvatten.
   3. Placera O/N i 0,1% natriumdcylsulfat i avjoniserat vatten.
      OBS: Använd inte ultrapurevatten eftersom delarna kan rosta.
   4. Skölj med kranvatten och diskmedel.
   5. Doppa i avjoniserat vatten, följt av 70% etanol två gånger, följt av avjoniserat vatten.
   6. Placera alla material separat på pappersvävnader och låt dem torka. Använd tryckluft för att torka slangar.
   7. Rengör alla icke-autoklaverbara material med en pappersvävnad indränkt i 70% etanol. Detta inkluderar gummiluftfiltret (tänk på att luftfiltret ska förbli torrt) och bioreaktorbasen (Teflon bälg och pneumatisk cylinder).
   8. Koppla automatiskt komponenterna i den fluidiska kammaren (inklusive silikon-O-ringen), de medelstora slangarna, de medelstora reservoarerna (utan gummiluftfiltret), hanproppar och kvinnliga Luer-koppling, vita Luer-lock, slangklämmor och standardutrustning (t.ex. pincett, klämsax)
   9. För bekväm användning under nästa experiment, kombinera de separata komponenterna för en komplett fluidisk kammare i en autoklaverbar låda.
4. Ta bort vatten från hydraulbehållaren. Rengör med 70% etanol, följt av avjoniserat vatten. Låt det torka. Fyll på med avjoniserat vatten och några droppar vattenbadsbevarande desinfektionsmedel.
5. Förvara glasrören till flödeskulturkammaren i 70% etanol.
6. Placera de fuktiga kiseldioxidtorkningspärlorna (vitt utseende) i ugnen O/N vid 120 °C för att låta dem torka (orange utseende) och förvara dem i en lufttät kolv.

Representative Results

Denna bioreaktor utvecklades för att studera de individuella och kombinerade effekterna av sax stress och cykliska stretch på vaskulär vävnad tillväxt och ombyggnad i 3D biomaterial byggnadsställningar. Utformningen av bioreaktorn möjliggör odling av upp till åtta kärlkonstruktioner under olika belastningsförhållanden(figur 1A). Kärlkonstruktionerna placeras i en flödeskulturkammare (figur 1B) där både den omkretssträcka och WSS kan styras oberoende. Det övre utrymmet i flödeskulturkammaren håller en flödesräta för att stabilisera flödet i en relativt kort sedimenteringslängd (Figur 1C). Direkt nedströms flödesrätaren fördelar munstyckskonen flödet jämnt genom den ringformiga kanalen (figur 1D). När alla steg i protokollet utförs på rätt sätt kan kärlställningarna i flödeskulturkammaren utsättas för ett kontinuerligt enkelriktat flöde genom den ringformiga kanalen mellan ställningen och glasväggen och är cirkumferentiellt sträckta av den pneumatiska pumpen (figur 1E-F). Innan ställningen monteras ska elektrospunröret skäras i 25 mm rör (figur 1G) och kan undersökas med SEM för att analysera mikroarchitecturen (Figur 1H-I). Det är viktigt att notera att PCL-BU-transplantaten i detta exempel kan ersättas av andra elastomeriska vävnadskonstruerade transplantat (naturligt eller syntetiskt ursprung, olika mikroarchitecture eller porositet). Inifrån och ut-designen gör det möjligt att testa mycket porösa transplantat eftersom det inte nödvändigtvis behöver vara läckagefritt. Den schematiska bilden av flödeskulturkammaren visar den fysiska tolkningen av de parametrar som används i ekvationerna för att beskriva WSS (ekvation 1), tryckgradienten (ekvation 2) och den cirkumferentiella sträckan (ekvation 3) (figur 1J).

Felaktig körning av protokollets kritiska steg kan resultera i några scenarier. Läckage från hydraulbehållaren kan till exempel uppstå till följd av felaktigt monterade knutar, vilket leder till läckage av hydraulvätska från tryckledningarna med hål som passerar silikonröret och kommer in i flödeskulturkammaren (figur 2A). Läckage av hydraulvätskan vid anslutningen mellan skruvgängorna och bioreaktorbasen kan också uppstå när silikonringen inte är väl placerad eller om Teflonbälgen inte tilläts expandera O/N något en dag före försöket (figur 2B). När mediet inte avgasas, eller om medelnivåerna i medelreservoarerna inte är välbalanserade och en medelstor reservoar torkar, vilket resulterar i att luft sugs in i systemet, kan luftbubblor uppstå i flödeskulturkammaren (figur 2C), vilket stör WSS-patterna, vilket äventyrar cellens livskraft och efterföljande vävnadstillväxt. Slutligen, när silikon O-ringen i det nedre utrymmet inte är korrekt placerad, kan medelspill observeras under flödeskulturkammaren (figur 2D).

Eftersom denna bioreaktorinställning möjliggör tillämpning av individuella och kombinerade hemodynamiska belastningar kan flera hemodynamiskt laddade experimentella grupper inkluderas i ett experiment (figur 3A). Tidigare validerades olika hemodynamiska belastningar (dvs. två savspänningsregimer och två stretchregimer) genom tillämpning av olika möjliga systeminställningar (figur 3B). När stretch (figur 3C) och WSS (figur 3D) övervakades under långsiktiga kulturperioder, bekräftades det att dessa kan bibehållas på relativt konstanta nivåer under en period på upp till 20 dagar.

Bioreaktorn är särskilt väl lämpad för att studera påverkan av hemodynamisk belastning på tillväxt och ombyggnad i ett in situ vaskulär TE-sammanhang. Stadierna i in situ TE är hypotetiska för att spegla stadierna i det naturliga sårläkningssvaret (figur 4A). Samkulturerna av monocyt-härledda makrofager och myofibroblaster som härrör från mänskliga saphenous vener, som beskrivs här, fastställdes som en in vitro härma av den proliferative fasen. Tre dagar efter sådd visade immunofluorescensfärgning en homogen fördelning av båda celltyperna i hela ställningen (figur 4B). Efter 20 dagars samkultur resulterade cyklisk sträckning ensam i nedfallet av fler talrika och tjockare kollagen typ I-fibrer, medan i gruppen med kombinerade hemodynamiska belastningar, denna effekt av cyklisk stretch överskreds av shear stress, vilket resulterar i mindre uttalad kollagen typ I nedfall, illustreras här av immunofluorescens färgning (Figur 4C). För framgångsrik in situ vävnad regenerering krävs en snäv balans mellan vävnad produktion och byggnadsställningar resorption. Förutom vävnadsbildning möjliggör bioreaktorn induktion av celldriven ställningsresorption. Till exempel, när man odlar en monokultur av makrofager i 8 dagar på elektrospuntransplantat observerades fibererosion och fiberklyvning i alla hemodynamiska belastningsregimer, med den mest uttalade resorptionen i den statiska gruppen och minst uttalad resorption i savspänningsgruppen (Figur 4D). Tillsammans visar dessa resultat hur de olika hemodynamiska lastningsregimerna påverkar både tillväxt och ombyggnad. Dessa insikter är användbara för att optimera designparametrarna för nyutvecklade in situ TEVGs.

En annan viktig bestämningsfaktor för vävnadsregenereringsprocessen är närvaron av pro- och antiinflammatoriska cytokiner. Eftersom bioreaktorn är ett slutet loopsystem kommer cellerna i systemet kontinuerligt att utsättas för parakrina stimuli av utsöndrade faktorer. Cytokinutsöndringsprofilerna i mediet av de dynamiskt laddade samkulturerna i humant perifert blod mononukleära celler (PBMC)-härledda makrofager och mänskliga myofibroblaster från saphenous vener analyserades i tidiga och senare stadier (Figur 5A). Dessa representativa resultat illustrerar effekten av både cyklisk stretch och shear stress på cytokin utsöndring profilen i co-culture setup. Intressant nog visade de kombinerade effekterna av båda belastningarna antingen dominans av en av de två belastningarna (t.ex. cyklisk sträckning för interleukin-6 (IL-6) och monocyt kemoattraktivt protein-1 (MCP-1)) eller synergistiska effekter av båda belastningarna (t.ex. för IL-10) (figur 5B). Dessa insikter, som samlas in med hjälp av denna in vitro-testplattform, ger värdefull information för utveckling av in situ TEVGs som baseras på logiken hos makrofagdriven in situ-vävnadsregenerering.

Samkultur experiment av makrofager och myofibroblast visade att den mekaniska miljön och de resulterande lastberoende inflammatoriska miljöer modulerade fenotypen av myofibroblaster. Efter 20 dagars hemodynamisk belastning visade genuttryck av myofibroblastmarkörer tydliga skillnader i den individuella och kombinerade effekten av belastningen och i direkt och parakrinisk signalering av makrofager på myofibroblaster (Figur 6A). Dessutom är genuttrycksmönstren för kontraktil markör alfa glatt muskelaktin korrelerat med proteinsyntesen(figur 6B). Dessutom stimulerade cyklisk stretch kollagen och elastisk matris genuttryck och försvagad matris metalloproteinas 1/vävnadshämmare matris metalloproteinas 1-medierad kollagen ombyggnad, medan en stabiliserande effekt av shear stress observerades i samkulturen (Figur 6C). Dessa långsiktiga samkulturexperiment visar möjligheten att studera den senare fasen av vävnadsrenovering (figur 4A) i olika hemodynamiska laddningsregimer i vävnadskonstruerade kärltransplantat med denna bioreaktor. Eftersom TEVG är monterade "inifrån och ut" på ett silikonrör kan den cirkulära sträckan och WSS appliceras för längre odlingsperioder.

Bild 1: Utformning och översikt över bioreaktorn. a)Konstruktionsritning av bioreaktorbasen och(B) sprängdvy över vätskekulturkammaren med alla angivna delar (steg 2.4–2.8). Det övre facket i flödeskulturkammaren rymmer en flödesräta. C)Den sfäriskt trubbiga noskonen placeras efter flödesrätningsen för att fördela flödet genom den ringformiga kanalen (flödesriktningen anges i rosa). D)Tillsammans styr och styr dessa komponenter flödesriktning. Se tabell 1 för en funktionell beskrivning av de individuellt nämnda delarna. e)Fotografi av fullständig bioreaktorinställning (steg 5.2) och(F)en närbild av flödeskulturkamrarna och pneumatisk cylinder (steg 5.6.1). G)Elektrospun PCL-BU-ställningens bruttoutseende före sådd (linjalen tickar 1 mm). Scanning av elektronmikroskopiska bilder av rörformiga elektrospun PCL-BU-byggnadsställningar med 3 mm innerdiameter och 5 μm genomsnittlig fiberdiameter vid olika förstoringar, skalstänger (H) 100 μm och (I) 10 μm (steg 1. 3). J)Schematisk bild av kulturkammaren bestående av en rörformig elektrospunställning, med ytterradie (r₁) centrerad i ett glasrör med inre radie(r₂). Inloppen ochutloppen( Q ) är anslutna till ringformiga ringen, med kanalhöjd h för applicering av väggsjuvspänning (t). Inloppettryck/sträckning (P)ansluts till silikonmonterade byggnadsställningar för applicering av en omkretssträcka(λ(t))på de monterade elektrospunställningarna inifrån (steg 6.1). Förkortningar: polycaprolactone bisurea (PCL-BU). Panelerna C, D och G–J har anpassats från Van Haaften et al.¹⁹. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Bioreaktordelar	Funktionell beskrivning
Stretch-applikation
Pneumatisk cylinder	Aktivera Teflon bälg.
Teflon bälg	Laddar hydraulbehållaren.
Hydraulisk reservoar	Kan anslutas med upp till 8 flödeskulturkammare, fylls med demi-vatten, applicerar tryck på silikonmonterade konstruktioner.
Skruvgänga	Anslutning mellan flödeskulturkammaren och hydraulbehållaren. Tryckinloppet för silikonmonterade konstruktioner.
Vit luerkontakt	Används för att skruva flödeskulturkammaren tätt till en av de åtta skruvgängorna på hydraulbehållaren/bioreaktorbasen.
Tryckrör med små hål	Direkt ansluten till vatten i hydraulbehållare. När hydraulbehållaren trycksatt fyller tryckledningarna utrymmet mellan silikonröret (som är monterat på tryckröret) med vatten och trycker silikonslangen utåt, vilket resulterar i en omkretssträcka på silikonmonterad transplantat inifrån.
Silikonrör	För att montera elektrospuntransplantatet på tryckröret. Silikonslangen är omkretssträckt inifrån.
Flödesprogram
Flödespumpsystem	Används för att styra flödet i flödeskulturkamrarna. (i vårt exempel: ett ibidi-pumpsystem används.)
Övre och nedre facket med flödesintag och utlopp	Ansluter flödeskulturkammaren till flödesslingan.
Glasrör	Innehåller den trycksatta ställningen i mitten och tillåter perfusion av byggnadsställningarna.
Flödesräta	Stabiliserar flödet i en relativt kort sedimenteringslängd.
Noskon	Fördelar flödet jämnt.
Adapterbussning	Fixar glasröret.
O-ringen silikon	Förhindrar läckage av medium.

Tabell 1: Funktionell beskrivning av bioreaktorns huvudfunktioner, motsvarar angivna delar i figur 1A-D.

Figur 2: Resultat av felaktig körning av de kritiska stegen i protokollet. Fotografier av vissa händelser som kan observeras i bioreaktorinställningen när kritiska steg inte utförs på rätt sätt. a)Om knuten inte är tillräckligt tät eller inte exakt placerad i det graverade spåret (indikerad med pil), kan ett litet läckage av hydraulvätska i flödeskulturkammaren uppstå (steg 2.5). B) Om teflonbälgen inte tilläts expandera O/N en dag före försöket eller när silikonringen inte är väl placerad, kan hydrauliskt vätskeläckage från hydraulvätskan vid anslutningen mellan skruvgängorna och bioreaktorbasen uppstå (indikerad med pil) (steg 1.4 och 5.2.3). C)Luftbubblor i flödeskulturkammaren (indikeras med pil) resulterar i störda snjuvspänningsmönster. Avgasa alltid odlingsmediet och se till att medelnivåerna i medelbehållaren är balanserade för att förhindra att en behållare blir torr och luft sugs in i flödeskammarens system (steg 1.2 och 5.5.4). d)När silikonringen i det nedre utrymmet inte är korrekt placerad kan spill av mediet observeras (indikeras med pil) (steg 2.4.2). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 3: Kontroll av savspänning och sträckning. Eftersom bioreaktorn möjliggör oberoende och kombinerad tillämpning av stretch och savning kan (A) flera experimentella grupper ingå i ett experiment. B)Exempel på variationer i maximala sträckor och saxspänningar vid en viss tidpunkt som testats under fyra olika systeminställningar (anges med färgerna). Svarta rektanglar representerar ± standardavvikelse för mätningarna för varje inställning. De prickade linjerna beräknas som medelvärdet avsträckorna (horisontell linje) och savspänningarna(vertikal linje)för att indikera de fyra distinkta belastningsförhållandena. C)Cykliska omkretssträckor i den cykliska sträckan och kombinerade grupper under försökets gång på 20 dagar, baserat på mätningar av byggnadsställningens ytterdiameter som övervakas med en tidsfördröjning av höghastighetskameran (steg 6.2). D)Övervakade väggsjuvspänningar i savspänningen och kombinerade grupper under experimentet, baserat på de förändrade medelnivåerna i sprutan (steg 6.1). Panelerna A, C och D har anpassats från Van Haaften och Wissing^m.fl. panel B har anpassats från Van Haaften et al.¹⁹. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 4: Begrepp om in situ kärlvävnadsteknik, cellfördelning, vävnadsproduktion och nedbrytning av byggnadsställningar. A)En schematisk illustration som visar de hypotetiska faserna av byggnadsställningsdriven vävnadsregenerering på värdens funktionella plats. Resultaten som visas härrör från experiment som fokuserade på den proliferativa fasen, där makrofager och vävnadsproducerande celler har koloniserat ställningsmaterialet. B)Myofibroblaster från mänsklig saphenous ven(röd)och PBMC-härledd makrofag(grön)fördelning på utsidan av elektrospunställningen(grå)vid dag 3. Skala stång 200 μm. (C) Tvärsnitt av samkulturkonstruktionen dag 20 färgad för kollagen typ I (grön), kollagen typ III (röd) och DAPI (vit). Skalstång 100 μm, *anger konstruktionens yttre sida, motsvarande flödessidan. D)SEM-bilder av decellulerade transplantat med 8 dagars makrofagmonokultur som visar makrofagnedbrytning. skalstång 20 μm. Förkortningar: mänskliga saphenous venous celler (HVSC); perifert blod mononukleära celler (PBMC); 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI); skanna elektronmikroskopi (SEM). Panel A har anpassats från Wissing och Bonito^m.fl. panelerna B och C har anpassats från Van Haaften och Wissing^m.fl. och panel D har anpassats från Wissing et al.⁴³. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 5: Inflammatorisk miljö i hemodynamiskt laddade samkulturkonstruktioner vid 3 dagar och 20 dagar. Co-kultur av mänskliga PBMC-härledda makrofager och mänskliga myofibroblaster från saphenous vener. (A) Värmekarta över total cytokinsekretion mätt i supernatant via multiplex ELISA. B)Boxplots för ett urval av cytokiner dag 20, normaliserade till totalt DNA-innehåll. P-värden beräknades med Kruskal-Wallis-test med dunns flerfaldiga jämförelsetest. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** Förkortningar: vävnadshämmare av metalloproteinas (TIMP), matrismetalloproteinas (MMP), interleukin (IL), monocytkemoattraktivt protein 1 (MCP-1), transformerande tillväxtfaktor beta 1 (TGF-β1), bindväv tillväxtfaktor (CTGF), tumör nekros faktor alfa (TNF-α), trombocyt-härledda tillväxtfaktor (PDGF), statisk (ST), cyklisk stretch (CS), shear stress (SS). Panelerna A och B har anpassats från Van Haaften och Wissing et al.⁴⁴. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 6: Förändringar i myofibroblast fenotyp och markörer för matristillväxt och ombyggnad som svar på hemodynamisk belastning i kärlkonstruktionerna dag 20. (A) Relativt genuttryck av myofibroblastspecifika fenotypiska markörer. B)Tvärsnitt färgade för αSMA(grön) ochDAPI(blå),skalstång 100 μm. (C) Relativt uttryck av gener relaterade till kollagenmatris, elastisk matris, proteoglykaner och ombyggnad av gener. P-värden beräknades med Kruskal-Wallis-test med dunns flerfaldiga jämförelsetest. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Förkortningar: S100 kalciumbindande protein A4 (S100A4), alfa-glatt muskelaktin (αSMA eller ACTA2), kalponin 1 (CNN1), smoothelin (SMTN), vimentin (VIM), kollagen I (COL1A1), elastin (ELN), versican (VCAN), matrismetalloproteinas (MMP), vävnadshämmare av metalloproteinas (TIMP), statisk (ST), cyklisk stretch (CS), savspänning (SS), 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). # uppmätt vid eller under detektionsgränsen. Panelerna A, B och C har anpassats från Van Haaften och Wissing et al.⁴⁴. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Kompletterande figur S1: Proteinuttryck myofibroblast- och makrofagmonokulturer som utsätts för individuella och kombinerade hemodynamiska belastningar. (A) Representativa konfikala bilder av myofibroblaster, odlade i 10 dagar med aktinfibrer(gröna),atomkärnor (röd) och byggnadsställning (blå), visar en tydlig aktinfiberorientering i de laddade proverna, jämfört med de statiska proverna där ingen förmånlig aktinfiberriktning kan observeras. Skala stång 50 μm. (B) Konfokala bilder av samma myofibroblast monokultur färgade för kollagen(grön)och atomkärnor / byggnadsställningar (vit). Skala stången 50 μm. (C) Boxplots av proteinutsöndringsprofiler av statiskt och dynamiskt odlade THP1-härledda makrofager i 8 dagar, med beräknade M1/M2-förhållanden baserade på cytokinsekretionsnivåerna IL-6, TNF-α, MCP-1 (proinflammatorisk) och IL-10, IL-13, MMP-9 (antiinflammatorisk). Pricken i MCP-1-diagrammet representerar en statistisk avvikande. D)ELISA-data om de relativa proteinsekretionsnivåerna för statiskt och dynamiskt odlade makrofager dag 8 jämfört med den genomsnittliga utsöndring av proinflammatoriska, antiinflammatoriska, tillväxt- och ombyggnadsproteiner (proteinnivåerna korrigerades för det genomsnittliga DNA-innehållet per grupp). Prickarna och skuggade områden indikerar respektive 50:e respektive25:e –75:e percentilen. Förkortningar: monocyt kemoattractant protein 1 (MCP-1), interleukin (IL), transformerande tillväxtfaktor beta (TGF-β), matrismetalloproteinas (MMP), trombocyt-härledda tillväxtfaktor (PDGF), bindväv tillväxtfaktor (CTGF), tumör nekros faktor alfa (TNF-α), enzym-linked immunosorbent analys (ELISA).* p < 0,05; ** p < 0,01, *** p < 0,001. Panelerna A och B har anpassats från Van Haaften et al.¹⁹. Panelerna C och D har anpassats från Wissing et al.⁴³. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Discussion

Den bioreaktor som beskrivs häri möjliggör systematisk utvärdering av bidrag från individen och kombinerade effekter av sax stress och cykliska stretch på inflammation och vävnad regenerering i tubular resorbable byggnadsställningar. Detta tillvägagångssätt gör det också möjligt att utföra ett stort antal analyser på kärlkonstruktioner, vilket exemplifieras i avsnittet representativa resultat. Dessa resultat visar den distinkta effekten av de olika hemodynamiska lastningsregimerna (dvs. olika kombinationer av sav och stretch) på både tillväxt och ombyggnad av TEVG-konstruktionen. Dessa insikter, som samlas in via denna in vitro-plattform, hjälper till att optimera byggnadsställningars designparametrar för nyutvecklade in situ TEVGs. För att säkerställa ett korrekt experimentellt arbetsflöde är det viktigt att förstå de kritiska stegen och begränsningarna i det här protokollet.

De mest kritiska stegen i protokollet är relaterade till tillämpningen av stretch till exemplen. För stretchapplikation är det viktigt att installationen är läckagefri. Det finns två svaga punkter i systemet: knutarna som monterar elektrospuntransplantaten på tryckledningarna och anslutningen mellan bioreaktorbasen och flödeskulturkamrarna. Som beskrivs i steg 2.5.2 och 2.5.4 måste flera, snäva knutar placeras exakt vid det graverade spåret. Om knuten inte är tillräckligt tät eller placeras något ovanför eller under spåret kan ett litet läckage av hydraulvätska i flödeskulturkammaren uppstå. Läckaget kan upptäckas som ett tryckfall i hydraulbehållaren och en stadigt ökande spänning på belastningspumpen för att nå det inställda tryckvärdet. Dessutom leder detta till ett stört flöde i flödeskulturkammaren, en ökad risk för förorening av cellkulturen och en utspädning av mediet. När detta händer måste flödeskulturkammaren tas ut ur experimentet, och skruvgängan på hydraulbehållaren ska stängas med ett vitt Luer-lock. Detta viktiga mått på att ta ett komplett prov, som behövs för att säkerställa en korrekt fortsättning av experimentet för de andra sju flödeskulturkamrarna, betonar vikten av att exakt placera snäva knutar, exakt i de graverade spåren. Först då kan korrekt separation säkerställas mellan vattnet i hydraulbehållaren och mediet i flödeskulturkamrarna. För att förbättra robustheten i monteringen av byggnadsställningarna kommer spåren i tryckledningarna att göras något djupare i en reviderad version av bioreaktorn, vilket möjliggör enklare och bättre knutplacering och därmed säker separation av hydraulvätskan från mediet.

En annan potentiell läckagekälla är mellan skruvgängorna på bioreaktorbasen och de vita Luer-kontakterna i flödeskulturkammaren. På grund av eventuellt slitage på Teflon-materialet kan en extra silikon O-ring tillsättas för att förhindra läckage (steg 5.2.3). Dessutom bör töjningspumpens Teflonbälg tillåtas att expandera O/N något en dag före försöket (steg 1.4). Om läckage uppstår bör den förlorade hydraulvätskan kompenseras genom att tillsätta en liten mängd ultrapurevatten via en av de åtta skruvgängorna (använd en spruta med nål och flexibel tråd). Placera flödeskulturkammaren tillbaka med en liten bit parafilm mellan skruvgängan och den vita Luer-kontakten på bottenfacket i flödeskulturkammaren. För att komma till rätta med läckageproblemet i framtida experiment kommer de nuvarande Teflon-skruvgängorna på bioreaktorbasen att ersättas av gängor av rostfritt stål i nästa generations version av bioreaktorn för att förhindra utslitning ur systemet.

Variationen i sträckning (figur 3C) är större än variationen i WSS (Figur 3D), eftersom stretch är svårare att kontrollera. Förutom åtgärderna för att förhindra läckage finns det dock andra åtgärder som begränsar variationen i sträckning: i) undvika luftbubblor i flöjten (steg 1.4 och 5.2.1),ii) säkerställa konsekvent försträcka mellan de olika proverna (steg 2.5.3) och iii) säkerställa konsekventa byggnadsställningars egenskaper mellan olika prover (steg 1.3).

Slutligen krävs extra försiktighet vid montering av elektrospunställningen på silikonslangen (steg 2.3). Specifikt, när den bräckliga elektrospunställningen måste dras över den sträckta silikonslangen, är det viktigt att inte applicera för mycket kraft för att förhindra att elektrospuntransplantatet skadas, särskilt på insidan av elektrospuntransplantatet. Om skador uppstår på insidan av elektrospuntransplantatet, antingen från kraftfull dragning eller från för svag sträckning av silikonröret, blir omfattningen av skadorna på elektrospunfibrerna synliga först efter att konstruktionen skördats och analyserats. I den aktuella inställningen kan framgången för sådd endast bekräftas vid immunofluorescens eller immunohistokemisk analys, efter att ha offrat provet. Såddförfarandet med fibrin som cellbärare är dock en väletablerad metod⁶⁷ som vanligtvis leder till en homogen cellfördelning för byggnadsställningar med en tillräckligt stor porstorlek. En av de viktigaste aspekterna när det gäller cellfröning är att se till att ställningen är så torr som möjligt före sådd (steg 4.4), för att förhindra att fibringelen med cellerna passerar genom den våta ställningen, vilket resulterar i inhomogen seedning. Slutligen, även om dekontamineringsmetoden för elektrospuntransplantatet genom UV-strålning och doppning i 30% etanol inte är lika strikt som steriliseringen av elektrospuntransplantat som förberetts för in vivo-studier, som ofta steriliseras genom etylenoxid eller gammastrålning är det tillräckligt för in vitro-odlingsexperiment som kan pågå i upp till 20 dagar utan tecken på kontaminering (för exempel, se figur 3, figur 4, figur 5, figur 6och Van Haaften och Wissing (2020)⁴⁴). Dessutom tillåter PCL-BU-materialet som används här inte lång exponering för höga etanolkoncentrationer. Den lämpligaste steriliseringsmetoden kan väljas beroende på vilket material som används.

Förutom resultaten från tidigare utförda samkulturstudier kan ett bredare utbud av studier utföras med samma system. Systemet användes tidigare för att utföra dynamiska monokulturer av myofibroblaster (kompletterande figur 1A–B) och makrofager (kompletterande figur 1C–D) för att undersöka effekterna av hemodynamisk belastning på enskilda celltyper och deras parakrina signalering^19,43. Olika hemodynamiska lastning regimer resulterade i tydlig aktin fiber orientering i myofibroblaster(kompletterande figur 1A)och tydligt olika kollagen nedfall (Kompletterande figur 1B) efter 10 dagar. Cytokinproduktionen av THP1-härledda makrofager var drastiskt annorlunda mellan de olika hemodynamiska belastningarna(kompletterande figur 1C)och visade en mer proinflammatorisk profil när den laddades (Kompletterande figur 1D). Andra validerade möjligheter inkluderar applicering av svängningsflöde, genom att använda en extra pump och fluidisk enhet. Mediets viskositet kan ökas mot intervallet av blodviskositet (t.ex. genom att tillsätta xantangummi)⁶⁹. Modulering av medelviskositeten representerar ytterligare en variabel för att bredda utbudet av tillämpliga savspänningar. Slutligen, även om det beskrivna protokollet använder flödeskonditioneringsinställningarna "Ibidi", kan även inställningar från andra tillverkare användas, så länge liknande flödesscheman kan tillämpas.

En av de största fördelarna med att använda detta bioreaktorsystem är den relativt stora konstruktionen (ca 15 mm x 10,5 mm) som kan laddas hemodynamiskt, vilket gör det möjligt att extrahera en mängd möjliga avläsningsparametrar från ett enda prov. Samtidigt kan konstruktionsstorleken också ses som en begränsning, eftersom den här inställningen kräver en relativt stor mängd (ibland dyrt) material, särskilt om primära celler används eller om odlingsmediet kräver kostsamma tillsatser. Dessutom är genomströmningen av installationen relativt låg. Följaktligen är den nuvarande inställningen särskilt lämpad för hypotesdriven forskning där ett begränsat antal variabler testas omfattande, snarare än screening av ett stort antal variabler med begränsad avläsning. För framtida experiment görs små förbättringar av den aktuella installationen för att möjliggöra möjligheten att montera mindre byggnadsställningar och minska storleken på de medelstora reservoarerna. När det gäller den senare krävs den aktuella volymen av medelreservoarerna för att möjliggöra tillräckliga volymetriska flödeshastigheter för att uppnå önskade savspänningar. De önskade flödeshastigheterna – och med det volymen av medelbehållare – kan minskas genom att öka mediets viskositet (t.ex. genom att tillsätta xantangummi, som tidigare fastställts⁶⁹).

Sammanfattningsvis möjliggör denna bioreaktor kvantifiering av de individuella och kombinerade effekterna av saxstress och cyklisk sträckning på vävnadstillväxt och ombyggnad på en mängd olika elastomeriska 3D biomaterialställningar. Bioreaktorn kan odla upp till åtta kärlkonstruktioner under olika belastningsförhållanden. På grund av sin design är bioreaktorn särskilt lämpad för att studera samspelet mellan hemodynamik och in situ vaskulär TE-processer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM)	Gibco	12491-015	cell culture medium for fibroblasts
Aqua Stabil	Julabo	8940012	prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombin	Sigma	T4648	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Centrifuge	Eppendorf	5804	to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor - "kelly forceps"	Almedic	P-422	clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubators	Sanyo	MCO-170AIC-PE	for cell culturing
Compressed air reservoir	Festo	CRVZS-5	smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretches	Matlab	R2017. The Mathworks, Natick, MA	calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition board	National Instruments	BNC-2090	data processing in between amplifier system and computer
Ethanol	VWR	VWRK4096-9005	to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS)	Greiner	758087	cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipet	Assistant	HE40567002	apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamber	Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology	n.a.	part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMax	Gibco	35050061	cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed camera	MotionScope	M-5	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens	Nikon	JAA616AB	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clip	ibidi GmbH	10821	block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads	ibidi GmbH	10902	set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)	Swann Morton	0301; 0933	to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW Software	National Instruments	version 2018	to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV light	Labconco	302310001	to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishes	Greiner	664-160	for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)	Sigma	A8960	cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500	Zeiss	Schott AG	to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps	ibidi GmbH	various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)	to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS)	PEEKEL instruments B.V.	n.a.	to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders	ibidi GmbH	10974	medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter	Rubber BV	1805	to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio Software	Idtvision	2.15.00	to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G)	BD Microlance	301700	together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driver	Adson	2429218	to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissues	Kleenex	38044001	for cleaning of the equipment with 70% ethanol
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	quick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S)	Lonza	DE17-602E	cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	for storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw caps	Greiner	206202	to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinder	Festo	AEVC-20-10-I-P	to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length)	SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands	n.a.	produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control)	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducer	BD	TC-XX and P 10 EZ	the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensor	Festo	MPPES-3-1/8-2-010, 159596	provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)	Gibco	A1049101	cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)	Eppendorf	30120086	multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20%	Sigma	5030	Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.
Silicone O-rings	Technirub	1250S	to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)	Rubber BV	1805	to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL)	Falcon	352095	multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle	Ethicon, Johnson&Johnson	EH7404H	Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL)	B. Braun Melsungen AG	2057932	to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm)	Satorius	17597-K	to filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter cap	Nunc	178983	to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter cap	Nunc	156499	to culture static control samples
Teflon bellow	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel)	PolarWare	15-248	for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
Tweezers	Wironit	4910	sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure water	Stakpure	Omniapure UV 18200002	to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV light	Philips	TUV 30W/G30 T8	for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding