L’insertion co-translationnelle dans des nanodisques préformés permet d’étudier des protéines membranaires synthétisées acellulaires dans des environnements lipidiques définis sans contact avec des détergents. Ce protocole décrit la préparation des composants essentiels du système et les paramètres critiques pour améliorer l’efficacité de l’expression et la qualité de l’échantillon.
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Article de méthode
Insertion co-translationnelle de protéines membranaires dans des nanodisques préformés
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les systèmes d’expression acellulaires permettent la conception sur mesure d’environnements de réaction pour soutenir le repliement fonctionnel de protéines même complexes telles que les protéines membranaires. Les procédures expérimentales pour l’insertion et le repliement co-translationnels de protéines membranaires dans des membranes préformées et définies fournies sous forme de nanodisques sont démontrées. Le protocole est totalement exempt de détergent et peut générer des milligrammes d’échantillons purifiés en une journée. Les échantillons de protéines membranaires/nanodisques qui en résultent peuvent être utilisés pour une variété d’études fonctionnelles et d’applications structurelles telles que la cristallisation, la résonance magnétique nucléaire ou la microscopie électronique. La préparation de composants clés de base tels que les lysats acellulaires, les nanodisques avec des membranes conçues, les solutions mères critiques ainsi que l’assemblage de réactions d’expression sans cellules à deux compartiments sont décrites. Étant donné que les exigences de repliement des protéines membranaires peuvent être très diverses, l’un des principaux objectifs de ce protocole est la modulation des paramètres et des étapes de réaction importantes pour la qualité de l’échantillon, tels que les composés réactionnels de base critiques, la composition membranaire des nanodisques, l’environnement redox et chaperon, ou la conception de modèles d’ADN. L’ensemble du processus est démontré avec la synthèse de la protéorhodopsine et d’un récepteur couplé aux protéines G.
Introduction
Les protéines membranaires (MP) sont des cibles difficiles dans les études de production de protéines en raison de leur insolubilité dans des environnements aqueux. Les plates-formes de production MP conventionnelles comprennent des systèmes cellulaires tels que E. coli, la levure ou les cellules eucaryotes. Les MP recombinants synthétisés sont soit extraits des membranes cellulaires, soit repliés à partir des corps d’inclusion1. Après solubilisation du détergent, les MP peuvent être transférés dans des environnements membranaires appropriés par des protocoles de reconstitution in vitro établis. Outre les vésicules et les liposomes, la....
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Protocole
1. Préparation du lysat S30
- Jour 1 : Extraire les cellules des stocks de glycérol sur une plaque de gélose LB et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
- Jour 2 : Inoculer 200 mL de milieu LB avec les cellules de la plaque de gélose et incuber à 37 °C pendant 12-14 h.
- Jour 3 : Inoculer 10 L de milieu YPTG stérile (extrait de levure de 10 g/L, 16 g/L de tryptone, 5 g/L de NaCl, 19,8 g/L de glucose, 4,4 mM KH2PO4, 8 mMK2HP4) tempéré à 37 °C dans un réacteur en cuve agitée de 15 L avec 100 mL de préculture (1:100). Cultiver à 37 °C, 500 tr/min et une fort....
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Résultats
L’impact du réglage fin des composés réactionnels sur le rendement final ou la qualité des MP synthétisés est illustré. Une approche de routine fréquente consiste à ajuster la concentration optimale de Mg2+ dans les réactions de mucoviscidose par expression de protéine fluorescente verte (GFP) comme moniteur pratique de l’efficacité du système. À titre d’exemple, la GFP a été synthétisée à partir d’un vecteur pET-21a(+) à des concentrations de Mg 2+ comprises entre 14 et24 mM (f.......
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Discussion
La configuration et les stratégies visant à optimiser l’expression de la mucoviscidose et l’insertion co-translationnelle de MP fonctionnels dans les nanodisques sont décrites. L’équipement requis comprend un bioréacteur, un dispositif de presse à Français ou similaire, un lecteur UV/VIS et de fluorescence, des cuves de réaction CF adaptées à une configuration à deux compartiments et un incubateur à température contrôlée. D’autres équipements standard sont des centrifugeuses pour la récolte de cellules E. coli a.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous tenons à remercier la subvention BE1911/8-1 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), le projet LOEWE GLUE et le centre de recherche collaborative Transport and Communication across Membranes (SFB807) pour leur soutien financier.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycérol) (sel de sodium) (DMPG) | Avanti Polar Lipids (États-Unis) | 840445P | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids (États-Unis) | 850345C | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sel de sodium) (DOPC) | Avanti Polar Lipids (États-Unis) | 850375C | |
| 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycérol) (sel de sodium) (DOPG) | Avanti Polar Lipids (États-Unis) | 840475C | |
| 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycéro-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids (États-Unis) | 850457C | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycérol) (sel de sodium) (POPG) | Avanti Polar Lipids (États-Unis) | 840034C | |
| 2-Amino-2-(hydroxyméthyl)- propan-1,3-diol (Tris) | Carl Roth (Allemagne) | 4855 | |
| 2-Mercaptoéthanol | Carl Roth (Allemagne) | 4227 | |
| 2-Propanol | Carl Roth (Allemagne) | 9781 | |
| [3H]-dihydroalprénolol Chlorhydrate | American Radiomarked Chemicals (États-Unis) | ART0134 | |
| Acétylphosphate de lithium sel de potassium (ACP) | Merck ( Allemagne) | 1409 | |
| Adénosine 5'-triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich (Allemagne) | A9251 | |
| Chlorhydrate d’alprénolol | Merck (Allemagne) | A0360000 | |
| Matériau de la colonne de chromatographie échangeuse d’anions : Q-sepharose® ; | Sigma-Aldrich (Allemagne) | Autoclave Q1126 | |
| Type GE 446EC-1 | Gettinge (Allemagne) | ||
| Bioréacteur Type 884 124/1 | B.Braun (Allemagne) | ||
| Centrifugeuse | Sorvall RC12BP+ ; Thermo Scientific (Allemagne) ; Sorvall RC-5C ; Thermo Scientific (Allemagne) ; Mikro 22 R ; Hettich (Allemagne) | ||
| Acide cholique | Carl Roth (Allemagne) | 8137 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Carl Roth (Allemagne) | 3862 | |
| Fioles de culture 500 ml à chicanes, 2 l à chicanes | Schott Duran (Allemagne) | ||
| Cytidine 5'-triphosphate sel disodique | Sigma-Aldrich (Allemagne) | C1506 | |
| D-glucose monohydraté | Carl Roth (Allemagne) | 6780 | |
| Di-potassiumhydrophosphate trihydraté | Carl Roth (Allemagne) | 6878 | |
| Tube de dialyse SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Tube RC standard | Fisher Scientific (Allemagne) | 8700152 | |
| Dithiothreit | Carl Roth (Allemagne) | 6908 | |
| Éthanol | Carl Roth (Allemagne) | K928 | |
| Acide folinique hydrate de sel de calcium | Sigma-Aldrich (Allemagne) | 47612 | |
| Perturbateur de cellules de pression | français SLM ; Amico Instruments (États-Unis) | ||
| Glycérol | Carl Roth (Allemagne) | 3783 | |
| Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP) | Sigma-Aldrich (Allemagne) | G8877 | |
| Acide chlorhydrique | Carl Roth (Allemagne) | K025 | |
| Colonne IMAC : HiTrap IMAC HP 5 mL | GE Life Sciences (Allemagne) | GE17-5248 | |
| Imidazole | Carl Roth (Allemagne) | 3899 | |
| Isopropyl-&beta ;-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth (Allemagne) | 2316 | |
| Kanamycine | Carl Roth (Allemagne) | T832 | |
| L-Alanine | Carl Roth (Allemagne) | 3076.1 | |
| L-Arginine | Carl Roth (Allemagne) | 6908 | |
| L-Asparagine | Carl Roth (Allemagne) | HN23 | |
| Acide L-aspartique | Carl Roth (Allemagne) | T202 | |
| L-cystéine | Carl Roth (Allemagne) | T203 | |
| Acide L-glutamique | Carl Roth (Allemagne) | 3774 | |
| L-Glutamine | Carl Roth (Allemagne) | 3772 | |
| L-Glycine | Carl Roth (Allemagne) | 3187 | |
| L-Histidine | Carl Roth (Allemagne) | 3852 | |
| L-Isoleucine | Carl Roth (Allemagne) | 3922 | |
| L-Leucine | Carl Roth (Allemagne) | 1699 | |
| L-Lysine | Carl Roth (Allemagne) | 4207 | |
| L-Méthionine | Carl Roth (Allemagne) | 9359 | |
| L-Proline | Carl Roth (Allemagne) | 1713 | |
| L-Phénylalanine | Carl Roth (Allemagne) | 1709 | |
| L-Serine | Carl Roth (Allemagne) | 4682 | |
| L-Thréonine | Carl Roth (Allemagne) | 1738 | |
| L-Tryptophane | Carl Roth (Allemagne) | 7700 | |
| L-Tyrosine | Carl Roth (Allemagne) | T207 | |
| MD100 unités de dialyse | Scienova (Allemagne) | 40077 | |
| N-2-Hydroxyethylpipérazine-N'-2-acide éthansulfonique (HEPES) | Carl Roth (Allemagne) | 6763 | |
| n-dodecylphosphocholine | Antrace (États-Unis) | F308S | |
| Chambre PAGE : Mini-Protean Tetra Cell | Biorad (Allemagne) | ||
| Système de coulée de gel PAGE : Mini Protean Handcast systems | Biorad (Allemagne) | ||
| Alimentation gel PAGE : Power Pac 3000 | Biorad (Allemagne) | ||
| Tryptone/peptone à partir de caséine | Carl Roth (Allemagne) | 6681 | |
| Pompe péristaltique : ip-12 | Ismatec (Allemagne) | ||
| Phosphoenol pyruvate monopotassique sel | Sigma Aldrich (Allemagne) | 860077 | |
| Dihydrogénophosphate de potassium | Carl Roth (Allemagne) | P018 | |
| Acétate de potassium | Carl Roth (Allemagne) | 4986 | |
| Chlorure de potassium | Carl Roth (Allemagne) | 6781 | |
| Pyruvate kinase | Roche (Allemagne) | 10109045001 | |
| Compteur à scintillation : Hidex 300 SL | Hidex (Finlande) | ||
| Granulés SDS | Carl Roth (Allemagne) | 8029 | |
| Azoture de sodium | Sigma-Aldrich (Allemagne) | K305 | |
| Chlorure de sodium | Carl Roth (Allemagne) | Spectrophotomètre P029 | |
| Nanodrop | Peqlab (Allemagne) | ||
| Spectrophotomètre/lecteur de fluorescence Spark® ; | Tecan (Suisse) | ||
| ARNt (E. coli) | Roche (Allemagne) | 10109550001 | |
| Ultra sonificateur | Labsonic U, B. Braun (Allemagne) | ||
| Uridine 5'-triphosphate tri-sodique (UTP) | Sigma-Aldrich (Allemagne) | U6625 | |
| Y-30 antimousse | Sigma-Aldrich (Allemagne) | A6457 | |
| Extrait de levure | Carl Roth (Allemagne) | 2904 |
Références
- Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
- Ritchie, T. K., et al.
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Réimpressions et autorisations
