Summary
Stimuleret Raman spredning (SRS) mikroskopi giver mulighed for selektiv, etiket-fri billeddannelse af specifikke kemiske moieties og det er blevet effektivt ansat til at billedet lipid molekyler in vivo. Her giver vi en kort introduktion til princippet om SRS mikroskopi og beskrive metoder til dets anvendelse i billedbehandling lipid opbevaring i Caenorhabditis elegans.
Abstract
Lipidmetabolisme er en grundlæggende fysiologisk proces, der er nødvendig for cellulær og organisme sundhed. Dysregulering af lipidmetabolisme fremkalder ofte fedme og mange tilknyttede sygdomme, herunder hjerte-kar-sygdomme, type II-diabetes og kræft. For at fremme den nuværende forståelse af lipid metabolisk regulering, kvantitative metoder til præcist at måle in vivo lipid opbevaringsniveauer i tid og rum er blevet stadig vigtigere og nyttige. Traditionelle metoder til at analysere lipidlagring er semiktativ for mikroskopisk vurdering eller mangler spatio-tidsmæssige oplysninger til biokemisk måling. Stimuleret Raman spredning (SRS) mikroskopi er en etiket-fri kemisk billeddannelse teknologi, der muliggør hurtig og kvantitativ påvisning af lipider i levende celler med en subcellulær opløsning. Da kontrasten udnyttes fra iboende molekylære vibrationer, tillader SRS-mikroskopi også firedimensionel sporing af lipider hos levende dyr. I det sidste årti har SRS mikroskopi været meget anvendt til små molekyle billeddannelse i biomedicinsk forskning og overvinde de store begrænsninger af konventionelle fluorescerende farvning og lipid ekstraktion metoder. I laboratoriet har vi kombineret SRS-mikroskopi med de genetiske og biokemiske værktøjer, der er tilgængelige for den magtfulde modelorganisme, Caenorhabditis elegans, for at undersøge fordelingen og heterogeniteten af lipiddråber på tværs af forskellige celler og væv og i sidste ende for at opdage nye bevarede signalveje, der modulerer lipidmetabolisme. Her præsenterer vi arbejdsprincipperne og den detaljerede opsætning af SRS-mikroskopet og giver metoder til dets anvendelse til kvantificering af lipidlagring på forskellige udviklingsmæssige tidspunkter af vildtype og insulinsignalerende mangelfuld mutant C. elegans.
Introduction
Fedme er blevet et globalt sundhedsproblem, der truer en tredjedel af befolkningen rundt om i verden, og det udgør en alvorlig medicinsk bekymring i betragtning af dets tilknytning til dårlig mental sundhed1 og dødelige sygdomme, herunder diabetes2, hjerte-kar-sygdomme3 og nogle typer kræft4. Undersøgelse af lipidmetabolisme er afgørende for bedre at forstå de biologiske problemer bag fedme. Hurtig og specifik kvantificering af lipidopbevaring indebærer påvisning af fedtsyrer og derivater heraf samt sterolholdige metabolitter med høj følsomhed og helst med rumlig information. Lipider er udfordrende mål til billedet, fordi de mangler iboende fluorescens og kan ikke let fluorescerende mærkes. De fluorescerende tags er ofte større end lipidmolekylerne og kan derfor være kemisk invasive og upraktiske til in vivo-applikationer. Etiketfri eller minimal mærkningsstrategi er nødvendig for at bevare lipidmolekylernes hydrofobe struktur5. Den seneste udvikling inden for billeddannelsesteknologier har skabt spændende muligheder for etiketfri billeddannelse af lipider i levende celler, væv og organismer.
Traditionelle tilgange til lipidlagringsanalyser i biologiske prøver omfatter biokemiske analyser og farvningsprotokoller med lipofile farvestoffer. Biokemiske kvantificeringsanalyser, der involverer massespektrometri (MS), er uovertruffen i deres molekylære opløsning, men de kræver meget store prøvemængder, og prøveforberedelse tager normalt flere timer, hvilket begrænser deres anvendelse til realtidsbilleddannelse af levende systemer5. En anden væsentlig begrænsning af disse analysemetoder er manglen på geografisk information. På den anden side giver lipofile farvestoffer som Oil Red O og Sudan Black væv og cellulær distribution af lipidopbevaringsorganeller, og sammenlignet med MS-teknikker er disse farvningsmetoder også lave i omkostninger og lette at udføre. Disse farvningsprotokoller kræver imidlertid fiksering, hvilket kan påvirke lipiddråbernes hydrofobe karakter, generere kunstige ændringer i deres struktur og resultere i uoverensstemmelser mellem forsøg6. De tekniske vanskeligheder forbundet med biokemiske og farvning teknikker har ført til søgen efter etiket-fri metoder til at billedet lipid molekyler og til den hurtige stigning i brugen af sammenhængende Raman spredning (CRS) mikroskopi i lipid imaging.
Raman-effekten blev først anerkendt af Raman og Krishnan, hvor de rapporterede, at ved interaktion med en foton kan et molekyle generere spredt lys uden ændring i bølgelængde (kaldet Rayleigh-spredning) eller sjældent med en ændret bølgelængde (kaldet Raman-spredning), og denne ændring i bølgelængde er karakteristisk for de funktionelle kemiske grupper inden formolekylet 7. Når de kemiske bindinger i et molekyle bliver ophidset til et højere vibrationelt energiniveau af en hændelsesfoton, kaldet pumpefoton, bliver energien fra den spredte foton, kaldet Stokes photon, lavere. Ellers kan de kemiske bindinger nå et lavere vibrationelt energiniveau, hvis de oprindeligt er på et højere niveau, og den spredte foton får energi til at være anti-Stokes foton. Frekvensforskellen mellem hændelsen og spredte fotoner er kendt som Raman-skiftet. Hver kemisk binding i et molekyle har et karakteristisk og kvantificerbart Raman-skift. For eksempel har CH2-bindingen et Raman-skift på 2.845 cm-1, hvilket er rigeligt i fedtsyrekæder8. Dette spontane Raman-signal er generelt meget svagt, hvilket har stærkt begrænset billedhastigheden i konventionel spontan Raman-mikroskopi. I årenes løb er der udviklet forskellige tilgange til at øge billedhastigheden og følsomheden af spontan Raman-mikroskopi. Sammenhængende Raman sprede mikroskopi, herunder sammenhængende Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) mikroskopi og stimuleret Raman Scattering (SRS) mikroskopi, er den seneste fremskridt. CARS og SRS har lidt forskellige arbejdsprincipper, men begge er etiketfri teknikker, der har levende billeddannelseskapacitet, kan give rumlig og tidsmæssig information om lipidlagringsdynamik og kræver kun lille prøvestørrelse. CARS mikroskopi lider af ikke-resonant baggrund, som kommer fra forskellige ikke-lineære processer, og CARS-signaler har også ikke-lineært forhold til molekylekoncentrationen, hvilket tilsammen komplicerer kvantificeringsprocessen9. I modsætning til CARS mikroskopi genererer SRS-mikroskopi ikke ikke-resonante baggrundssignaler og tilbyder lineær afhængighed af koncentrationen af molekylet af interesse. Således er I øjeblikket SRS mikroskopi mere udbredt til lipid imaging.
I SRS mikroskopi, kan de svage spontane Raman signaler forstærkes, når ophidset af to synkroniserede laserstråler med deres frekvens forskel matcher den kemiske binding vibrationelle frekvens. Molekylet vil opleve en forbedret overgang til en ophidset tilstand på grund af sammenhængende excitation. Som et resultat, er antallet af Stokes foton generation boostet. Derfor øges intensiteten af den transmitterede "Stokes" stråle (stimuleret Raman gevinst, SRG) og intensiteten af den transmitterede "pumpe" stråle falder (stimuleret Raman tab, SRL). Påvisning af SRG- eller SRL-signaler ligger til grund for grundlaget for stimuleret Raman Scattering (SRS) mikroskopibilleddannelse af molekyler med specifikke kemiske bindinger10. Hvis frekvensforskellen mellem de to laserstråler ikke svarer til vibrationsfrekvensen for den kemiske binding inden for et molekyle af interesse, genereres der hverken SRG- eller SRL-signaler. Billedhastigheden af SRS-mikroskopi er omkring 2 μsec pr. pixel eller 1 sekund pr. ramme, hvilket er meget hurtigere end spontan Raman-mikroskopi11. Typisk sideværts opløsning for SRS mikroskopi er diffraktion begrænset og omkring 300 nm. Desuden giver de to fotonoptiske processer for SRS-mikroskopi mulighed for volumetrisk 3D-billeddannelse af relative tykke vævsprøver, og billeddybden kan nå op på 300-500 μm. Samlet set præsenterer SRS-mikroskopi en effektiv, etiketfri billedteknik til at opdage specifikke biomolekyler, især lipider.
Lipiddråber er enkeltmembranorganeller, som er det vigtigste cellulære opbevaringssted for neutrale lipider, herunder triacylglyceroler (TAGs) og kolesterolestere (CEs). CH2 bindinger i fedtsyre kæder af disse lipid molekyler generere stærke SRS signaler på 2.845 cm-1, når ophidset8, hvilket gør det muligt at opdage og kvantificere opbevaring lipid niveauer i intakte celler, væv sektioner og endda hele organismer12,13,14,15. Især C. elegans er nyttige til lipidbilledundersøgelser på grund af deres gennemsigtighed. Ligesom pattedyr, C. elegans også gemme lipider i lipid dråber og syntese og nedbrydning veje lipid molekyler er stærkt bevaret16. I denne protokol vil vi levere arbejdsprincippet for SRS-mikroskopi, dets grundlæggende opsætning og beskrive metoderne til dets anvendelse i lipidbilleddannelse i C. elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Instrumental opsætning til stimuleret Raman Scattering Mikroskopi
BEMÆRK: SRS mikroskopisystemet er bygget på en picosecond laser med pumpe integreret optisk parametrisk oscillator og en konfokal laserscanning mikroskop. Oscillatoren giver to picosecond pulstog, herunder en Stokes-stråle ved 1.064 nm og en pumpestråle, der kan indstilles mellem 700-990 nm. Tidsmæssige og rumlige overlapning af de to bjælker opnås inde i laseren. En indbygget elektrooptisk modulator (EOM) er designet specielt til SRS-mikroskopi. Denne protokol vil fokusere på at koble laseren med mikroskopet og den daglige drift af dette system (Figur 1). Konfigurationen af et SRS mikroskop system udvikler sig i det sidste årti. Det skal bemærkes, at følgende beskrivelse kun repræsenterer en af de mange konfigurationer.
- Fodring af laserstråler i mikroskopet
- Indstil periskopet til at løfte strålen fra picosecond lyskilde udgang til IR laser input port på scanneren af mikroskopet.
ADVARSEL: Læs lasersystemmanualen før drift, og tag alle nødvendige forholdsregler, fordi nær infrarød stråling genereret af dette klasse IV lasersystem kan forårsage alvorlig skade på øjne og hud. Fuldfør de kurser, der kræves af de institutionelle miljøsikkerhedsafdelinger. Brug beskyttelsesbriller og kittel med manchet ærmer. - Først skal du indstille pumpestrålen til 750 nm og sænke lasereffekten ned til 50 mW, som kan inspiceres visuelt, hvilket affilierende justeringen. Brug derefter en stråleudvider (Figur 1, L1 og L2) til at justere strålediameteren, så den passer til bagsiden af mikroskopmål. Brug to relæspejle(figur 1,M1 og M2) til at guide laserstrålen til periskopet(Figur 1,P1 og P2). Periskopet løfter strålen til scanneråbningens højde og fungerer også som styrespejl til justering.
- Indstil knapperne på periskopet i midten af tuningområdet, og vælg den første position og vinkel på hvert spejl, så laserstrålen rammer midten af spejlet, ca.
- Udfør den grove justering ved hjælp af en tom port på det objektive tårn, og placer effektmålersonden for at måle kraften i det transmitterede lys. Indstil scanneren af mikroskopet ved højeste zoom (50x), og mål derefter kraften i det transmitterede lys med det fokuserede laserstrålepunkt. Optimer knapperne på hvert spejl, M1 og M2, iterativt for at opnå den højeste transmitterede lasereffekt.
- Udfør den fine justering med justeringsværktøjet. Sæt fluorescens måljusteringshætten på det tomme objektive sæde og juster knapperne på M1 for at centrere stedet. Derefter introduceres forlængerrøret til målet og tune knapperne på M2 for at centrere stedet.
- Gentag trin 1.1.4 og 1.1.5, indtil strålen centrerer målet på begge positioner.
- Indstil periskopet til at løfte strålen fra picosecond lyskilde udgang til IR laser input port på scanneren af mikroskopet.
- Registrering af forbindelse og elektronik
- Konfigurer SRS-registreringsmodulet. Placer en stråle splitter cuber efter kondensatoren til direkte den overførte laser til fotodiode modulet. Modulet indeholder et teleskop til at relæ og ændre strålen størrelse til at passe det aktive område af fotodiode, samt et optisk filter til at fjerne moduleret Stokes stråle og lad pumpen stråle gå igennem for demodulation.
- Opsætning af elektronikforbindelsen (Figur 1). Intensiteten af Stokes-strålen moduleres af en indbygget EOM ved 20 MHz inde i picosecond-tunet laser. Modulationsfrekvensudgangen fra laseren indtastes i låseforstærkeren som referencefrekvens for demodulation. Indføring af fotodiodens udgangssignal i låseforstærkeren for at demodulere SRL'en.
BEMÆRK: One-box lasersystemerne kan opgraderes, og deres specifikationer kan derfor variere på grund af forskellige produktionsdatoer. Den tidligere version af picosecond tunable laser system, der anvendes i denne protokol, har en Stokes stråle på 1.064 nm, men den seneste version har en Stokes stråle på 1.031 nm. Modulationsfrekvensen for EOM, der bruges i denne protokol, tilpasses til 8 MHz, men standardmodulationsfrekvensen for det seneste system kan være 10 eller 20 MHz. - Til sidst føres lock-in-forstærkerudgangen ind i mikroskopets analoge boks for at konvertere elektrisk analogt signal til digitalt signal. Systemet skal være klar til at behandle SRS-signalet.
- Optimere billedbehandlingsforhold
- Lav en kemisk prøve til systemjustering. Brug for eksempel dodekane til at optimere mikroskopet, fordi dodekanen har et meget stærkt SRS-signal fra C-H-bindingerne. Brug en sikker forsegling til at lave et minikammer; 5 μL dodekan og dæk den med en coverlip.
BEMÆRK: Udskift dodekanprøven, når den ser uklar ud eller præsenterer snavs, med en ny prøve, der kan bruges til justering i 2-3 måneder. - Prøven anbringes på mikroskopstadiet. Fokuser korrekt på væskedråben. Det kan gøres hurtigere ved at kigge efter kanten af dodekane pad. Juster kondensatoren til Kohler belysning.
- Angiv billedparametrene. Kontroller, om forsinkelsesfasen er på de rigtige tal. Sæt pumpestrålebølgelængden til 795,8 nm. Ved hjælp af et IR-sensorkort og en IR-fremviser skal du kontrollere, om pumpestrålestien stadig er korrekt.
- Sæt pumpestrålens effekt til 200 mW, og Stokes-strålen til 400 mW på billedsekunders systemkontrolpanel.
BEMÆRK: Laseroverførselshastighederne fra laserudgang til postmål for de to bjælker er ca. 25% for pumpe og 14% for Stokes til dette systemopsætning. Derfor er en postmålkraft af pumpestråle ca. 50 mW, og for Stokes stråle er den omkring 56 mW. Pulsbredden af det seneste picosecond lasersystem er ændret fra 6 ps til 2 ps, derfor bør den anvendte laserkraft være endnu lavere. - Indstil låseforstærkerforstærkeren til maksimum. Åbn lukkeren for både bjælker, samt de vigtigste lukkeren af laseren.
- Scan eksemplet, og kontroller billedet på computerskærmen. Skift skærmtilstanden til Hi-Lo i billedbehandlingssoftwaren. Juster intervallet for at se en ~ 50% mætning. Kontroller, om mætningen er centreret i billedet. Hvis ikke, skal du omhyggeligt justere styrespejlene, M1 og M2, for at maksimere billedintensiteten og for at centrere topintensiteten.
- Finjuster forsinkelsesfasen, og find den maksimale SRS-signalintensitet fra dodekanprøven. Systemet er derefter klar til brug.
- Lav en kemisk prøve til systemjustering. Brug for eksempel dodekane til at optimere mikroskopet, fordi dodekanen har et meget stærkt SRS-signal fra C-H-bindingerne. Brug en sikker forsegling til at lave et minikammer; 5 μL dodekan og dæk den med en coverlip.
2. Fremstilling af C. eleganprøver til SRS-mikroskopibilleddannelse
BEMÆRK: Som modelorganismer har Caenorhabditis elegans vist sig at være meget nyttige til flere billeddannelsesteknikker. De er hele kroppen gennemsigtige, derfor kan forskellige væv afbildes i det intakte dyr uden behov for dissektion. I C. elegans opbevares neutrale lipider i lipiddråber placeret i tarmen, som består af 20 epitelceller placeret bisymmetrisk omkring tarm lumen16. Hypodermale celler og oocytter også gemme lipider. Den vigtigste form for opbevaring lipider i C. elegans lipid dråber er triacylglyceroler (TAGs)17, som genererer stærke SRS signaler på grund af overflod af CH2 obligationer til stede i deres fedtsyre kæder. Dette afsnit vil fokusere på, hvordan man forbereder C. elegans prøver til SRS mikroskopi billeddannelse og kvantificering af deres samlede tarm lipid opbevaringsniveauer.
- Forberedelse af billeddias
- Først skal du forberede 2% agaroseopløsning i destilleret H2O, og sørg for, at alle agarose smelter, før du forbereder agarosepuderne.
- Tilføj en dråbe varm 2% agarose på et tomt dias (ca. 100 μL), der er placeret mellem støtte dias med to lag laboratoriebånd og hurtigt placere et andet dias på toppen af det første dias. Tryk forsigtigt for at skabe en tynd, selv agarose pad.
- Sæt disse dias til side i lukket position, og adskil dem ikke, før ormene er klar til at blive monteret. Forbered friske dias før hver billedbehandlingssession, da puderne tørrer efter 1 dag.
BEMÆRK: Brug multi-well imaging kamre, hvis billeddannelse flere orme i høj-throughput genetiske skærme18. Brug live billedbehandling opsætninger til billedet spatio-tidsmæssige dynamik lipid metabolisme gennem udvikling ogaldring 19.
- Tilslutning af ormene
- Bedøvelsesmidlet fremstilles ved at tilsætte natriumazid eller levamisole i M9-bufferen til den endelige koncentration på henholdsvis 100 mM eller 1 mM.
BEMÆRK: Brug levamisole, hvis ormene skal genvindes efter billeddannelse til genotyping efter genetiske skærme.
ADVARSEL: Flere bedøvelsesmidler, herunder natriumazid og levamisol, er skadelige ved indånding. Brug beskyttelseshandsker og tøj, samt brug en kemisk røghætte, når du forbereder disse arbejdsløsninger. - Der anbringes en dråbe bedøvelsesmiddel på en coverlip (ca. 4-5 μL for 10-20 orme).
BEMÆRK: Juster mængden af bedøvelsesmidlet i henhold til ormens nummer for at holde ormene så tæt på hinanden som muligt. Brug af for meget væske til få orme kan få ormene til at sprede sig på agarosepuden. - Vælg de orme, der skal afbildes under dissektionsmikroskopien, og overfør dem til bedøvelsesmiddeldråben. Når alle ormene er føjet til dråben, skal du flytte dem rundt ved hjælp af ormevælgeren og sørge for, at de ikke overlapper hinanden.
- Adskil glasrutsjebanerne (fra trin 2.1) uden at forstyrre agarosepuden.
- Dæk ormen dråbe med glasrutschebane, der har agarose pad. Sørg for, at agarosepuden vender mod ormene. Alternativt kan bedøvelsesdråben også tilføjes på agarosepuden, og orme kan dækkes med coverlip.
- Endelig skal du markere ormenes placering ved hjælp af en permanent markør på glasrutschebanen.
- Bedøvelsesmidlet fremstilles ved at tilsætte natriumazid eller levamisole i M9-bufferen til den endelige koncentration på henholdsvis 100 mM eller 1 mM.
3. Erhvervelse og analyse af billeder
- Erhvervelse af billederne ved hjælp af SRS mikroskop system.
- Før du tager billedbehandling af et eksempel, skal du bestemme billedparametrene og kontrollere SRS-signaler (som forklaret i protokol 1).
- Monter rutsjebanen med coverlip vender mod den objektive linse. Tænd den lyse feltlyskilde, og ret den til okularet for at finde ormene.
BEMÆRK: Brug en 20x objektiv linse til at afbilde lipid opbevaring i hele tarmen. Overvej at bruge en 60x objektiv linse til at billedet hypodermal fedt opbevaring eller til at kvantificere lipid dråbe størrelse / nummer. - Bring ormene i fokus og juster kondensatorens position i overensstemmelse hermed.
- Sluk for den lyse feltlyskilde, og skift til laserscanningsenheden. Begynd at scanne den første orm med en hurtig scanningshastighed (f.eks. 512 x 512 pixel), og juster det fine fokus for at finde interesseområdet. Hvis den første prøve skal afbildes, skal du justere laserkræfterne til det niveau, hvor SRS-signaler ikke er mættede.
- Skift til en langsommere scanningshastighed (f.eks. 2 μs/pixel) og højere opløsning (f.eks. 1024 x 1024 pixel) for at få SRS-billedet.
BEMÆRK: Hold laserkræfterne konstante for hver prøve, der skal afbildes under billedsessionen. - Gem SRS-billedet i det ønskede format, der muliggør høj opløsning (f.eks. en .tiff fil). Afhængigt af den anvendte billedbehandlingssoftware og installationsprogrammet skal du gemme placeringen af den første orm, før du går videre til den næste.
- Komplet billedbehandling af alle orme, der var monteret på diaset. Sluk for lukkeren for at blokere laserstrålerne. Sluk ikke for laserkilden, før alle prøver er afbildet.
- Fjern diaset, før du placerer det næste eksempeldias. Gentag trin 3.1.2-3.1.7.
- Når alle prøverne er blevet afbildet, sætte laserkilden på standby og slukke for det tilhørende udstyr, herunder forstærkeren, detektoren, mikroskopet og computeren.
- Analyse af billeder ved hjælp af ImageJ
- Åbn de billedfiler (normalt .tiff), der skal kvantificeres i ImageJ, ved at markere filerne og trække og slippe dem til ImageJ-vinduet. Hent de relevante ImageJ-plug-ins, hvis du bruger bestemte Olympus-mikroskopformater (f.eks. .oib-filer).
- Vælg de egenskaber, der skal analyseres (Analyser > Angiv målinger). Vælg Område, Min og Maks.
- Brug polygonmarkeringsværktøjet, og konturer det område af ormens tarm, der skal kvantificeres. Hvis du vil måle de parametre, der er valgt i trin 3.2.2, skal du klikke på Analyser > målpunkt. Der vises et nyt vindue med måleresultaterne. Gentag dette trin for alle de åbne billeder.
- Vælg målene for alle orme i en given genotype, og kopier/indsæt resultaterne i et nyt regneark. Gentag trin 3.2.1-3.2.4 for alle genotyper i samme billedsession.
- Vælg et område i nærheden af ormen, der ikke har noget SRS-signal, for at kvantificere som baggrund. Sørg for, at det område, der er valgt til baggrundsmåling, ikke indeholder bakterier eller snavs, der også kan give et SRS-signal.
- Træk den gennemsnitlige grå baggrundsværdi fra målingerne for hver enkelt orm. Beregne den gennemsnitlige og standardafvigelse for baggrundsen fratrækkede gennemsnitlige grå værdier fra alle ormene i en given genotype/testgruppe. Normaliser denne værdi til gennemsnittet af kontrolgruppen.
- Endelig skal du udføre den relevante statistiske analyse ved hjælp af den gennemsnitlige grå værdi som et mål for lipidniveauer i hver orm. Brug typisk Student's t-testfor to grupper og brug envejs ANOVA med en passende multisammenligningstest for mere end to grupper.
BEMÆRK: Når du vælger billeder til figurpræsentation, skal du sikre dig, at de markerede billeder har samme pixelintensitetsfordeling. Angiv lysstyrken og kontrasten til de samme værdier for alle billederne i samme figur (Billede > Juster > lysstyrke og kontrast).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Insulinsignalering er en vigtig endokrine vej, der påvirker udvikling, reproduktion, levetid og stofskifte. I orme består insulinsignalering af ca. 40 insulinlignende peptidetaler, insulinlignende vækstfaktorreceptor ortholog DAF-2, downstream PI3K/AKT kinase kaskade og FoxO transskriptionsfaktor ortholog, DAF-1620. daf-2 mutanter, der mangler insulinreceptoren, har flere lipiddråber i tarmen, ormen lipidopbevaringsvæv21,22. Ved hjælp af SRS mikroskopi kvantificerede vi tarm lipidniveauerne i alderssynkronerede orme af vild type og daf-2 mutanter i voksenalderen. I overensstemmelse med de tidligere resultater, fandt vi, at daf-2 mutanter har højere lipid niveauer23,24 (Figur 2A). Vi observerede et fald i lipidniveauer i orme af vildtype, der startede dag 1 indtil voksenalderens dag 9(Figur 2A). Lipidniveauerne i daf-2-mutanter steg imidlertid, indtil de var 5 dage gamle, og så var de konstante omkring niveauet 2,5-3,0 gange højere end den vilde type (Figur 2A).
DAF-16, C. elegans FoxO transskription faktor ortholog, orkestrerer de fleste af de nedstrøms funktioner insulin signalering vej. daf-16 null mutationer undertrykke flere fænotyper observeret i daf-2 mutanter, herunder fedt ophobning. daf-16 genomiske locus koder for 8 forskellige udskrifter (daf-16a-h), der genereres af enten alternative transskription startsted, eller alternativ splejsning20. Blandt dem er daf-16a, daf-16b og daf-16d/f/h de mest rigelige udskrifter, og de koder for proteiner med forskellige N termini. Undersøgelser med isoformspecifikke mutationer og transgener tydede på , at DAF-16A og DAF-16D/F/H isoformer regulerer udviklingen af dauer og levetiden24,25, mens DAF-16B er vigtig for svælg remodeling under dauer formation26. I denne undersøgelse undersøgte vi ved hjælp af SRS-mikroskopi ISOFORM-specificiteten af DAF-16 i reguleringen af tarmlæbelagring. Vi fandt, at daf-16 inaktivering undertrykker stigningen i lipid niveauer af daf-2 mutanter(Figur 2B, C). Udtrykke daf-16a eller daf-16b isoform i daf-2; daf-16 dobbelt mutanter ikke genoprette lipid niveauer. Udtrykket af daf-16d/f/h isoform er imidlertid tilstrækkeligt til at genoprette lipidniveauerne i daf-2; daf-16 til de niveauer, der er observeret i daf-2 enkelt mutanter (Figur 2B,C). Disse resultater viste, at specifikt DAF-16D/F/H isoformer modulerer lipid metabolisme i daf-2 mutant orme. Dette er også i overensstemmelse med resultaterne fra en nylig undersøgelse, der viste olfaktorisk regulering af lipidlagring er også medieret gennem transskriptionelle aktiviteter DAF-16D/F/H27.
Figur 1: Illustration af SRS-mikroskopsystemet. Alt-i-en-laseren giver tidsmæssigt og rumligt kombineret pumpe og Stokes-bjælker, indbygget elektrooptisk modulator (EOM) og referencefrekvens for lock-in forstærker. Den kombinerede stråle udvides af teleskopet (L1 og L2), videresendt af to relæspejle (M1 og M2) og løftes af periskopet (P1 og P2) og sendes derefter ind i scanneren af mikroskopet. Den kombinerede stråle scannes af scanningsenheden (SU) i mikroskopet og fokuseres på prøven. Transmitteret lys opsamles af kondensatoren. Et filter vil fjerne Stokes-strålen og lade pumpestrålen blive opdaget af fotodioden (PD). De grå stiplede pile viser forbindelsen mellem elektronikken. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Reduceret insulinsignalering i C. elegans fører til øget lipidopbevaring. (A) Ved hjælp af SRS mikroskopi, intestinal lipid niveauer af vilde-type og daf-2 mutanter orme er kvantificeret i dag 1, 3, 5, 7 og 9 i voksenalderen. I vilde orme falder lipidniveauerne over tid, mens daf-2-mutanter akkumulerer lipider indtil dag 5, og de har omkring 2,7 gange flere lipider sammenlignet med orme af vild type. (B) daf-16 sletning undertrykker den øgede lipid niveauer i daf-2 mutanter. Gendannelse af isoformen daf-16d/f/h i daf-2; daf-16 dobbelt mutanter er tilstrækkelig til at øge lipid niveauer til daf-2 mutanter 'niveauer, mens genoprette udtryk for daf-16a eller daf-16b isoforme er ikke. *** p < 0,001, n.s. ikke signifikant ved envejs ANOVA med Bonferroni's flere sammenligninger test. (C)Repræsentative SRS-billeder. Gule pixel angiver højere lipidniveauer. Kvantificeret tarmområde vises i stiplede linjer. Skalabjælken er 40 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil. Klik her for at hente denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til forsvar mod fedme og de tilhørende metaboliske lidelser er der gennemført vigtige forskningsindsatser for bedre at forstå de lovgivningsmæssige mekanismer i lipidhomøostase. Til kvantitativ påvisning af lipidmolekyler i biologiske prøver har etiketfri billeddannelse ved SRS-mikroskopi vist sig at være et pålideligt alternativ til biokemiske assays og andre farvningsmetoder. Vores gruppe og andre har afsløret nye biologiske mekanismer i lipid metabolisk regulering ved at kombinere brugen af C. elegans og SRS mikroskopi12,18,28,29,30,31. I denne protokol, ved hjælp af SRS mikroskopi vi vist, at nedregulere insulin signalering i orme fører til en stigning i den samlede intestinal lipid niveauer. Vi observerede, at start dag 1 af voksenalderen, lipider ophobes i tarmen af daf-2 mutanter, som har tab-of-funktion mutation i insulin receptor genet, mens der i vilde-type orme intestinal lipid niveauer falde. Derudover, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser23,24, fandt vi, at daf-16 inaktivering fuldt ud kan undertrykke lipidlagringsstigningen i daf-2-mutanter og blandt de forskellige daf-16 isoformer regulerer daf-16d/f/h isoform specifikt lipidhomøostase. Som tidligere undersøgelser antydede, skyldes forskellen i det samlede intestinale lipidlagringsniveau i daf-2-mutanter sandsynligvis en kombination af faktorer: øget de novo lipidsyntese32, nedsat lipidudnyttelse33, samt reduceret reproduktion og æggeblommeakkumulering34. Nylige fremskridt inden for sammenhængende Raman-spektroskopiteknikker (SRS og CARS) vil bidrage yderligere til at belyse mekanismerne for, hvordan insulinsignalering bidrager til regulering af forskellige lipidlagringstyper i forskellige væv, herunder tarm, hypodermis og oocytter.
SRS mikroskopi er blevet udnyttet til at billedet ikke kun lipider, men også andre biomolekyler, herunder DNA35, RNA14, proteiner13, og glukose36. Det er blevet implementeret for at give vigtig indsigt i mange aspekter af biologi såsom cellebiologi, mikrobiologi, kræftbiologi og udviklingsbiologi11. For nylig har brugen af bioorthogonale tags (f.eks. alkyne- og deuteriumtags) minimalt mærket molekylerne af interesse yderligere forbedret detektionsfølsomheden og specificiteten. Disse minimale vibrationelle tags forstyrrer ikke molekylets kemiske egenskaber, men giver specifik kemisk kontrast, da deres Raman-signal er inden for det "tavse vindue" i Raman-spektret14,37. Ud over at forbedre følsomhed og specificitet, opnå super-opløsning SRS billeddannelse er også et spændende forskningsområde. Flere forskergrupper har også bestræbelser på at minimere udstyrets størrelse ved at skabe håndholdt SRS mikroskop38. Således har anvendelsen af SRS billeddannelse til biomedicinsk forskning åbnet nye steder for teknologiske og kemiske forbedringer for at fremme lipid imaging.
Sammenlignet med traditionelle metoder til lipid quantitation har SRS-mikroskopi flere fordele. Først og fremmest udføres den på en etiketfri måde, og selvom en etiket skal bruges, kan etiketten være så lille som to atomer. Derfor lider det heller ikke af fotobleaching-problemet som andre fluorescerende mærknings- og farvningsmetoder. For det andet gør evnen til levende billeddannelse ved hjælp af hele organismer det muligt at spore dynamikken i specifikke metabolitter29,39,40. Endelig tillader SRS-mikroskopi en højere grad af multipleksering og kan derfor implementeres til at afbilde flere biomolekyler i forskellige cellulære rum samtidigt. Hyperspektral SRS/CARS mikroskopi rummer en stor fremtid med hensyn til at udforske den metaboliske dynamik i flere forskellige biomolekyler samt forskellige typer lipidopbevaringsrum såsom æggeblommepartikler i C. elegans41 eller cholesterylester og TAG rige lipiddråber i forskellige pattedyrsceller og væv31. På den anden side står SRS-mikroskopi over for begrænsninger som høje omkostninger i hardware og mangel på fuld kommerciel tilgængelighed. Derudover kræver det ekspertise til at vedligeholde og køre systemet, hvilket kan komplicere dets vedtagelse. Udviklingen inden for lyskilde- og systemintegration forbedrer situationen. Fiberbaserede lavprislaserkilde og fuldt integrerede systemer giver nye muligheder inden for kommercialisering og vil bidrage til at reducere omkostningerne i fremtiden11,42,43. På trods af de nye teknologiske tilgange til forbedring af billedhastigheden og den rumlige opløsning af SRS-billeddannelse kan den begrænsede detektionsfølsomhed desuden fortsat hindre evnen til at undersøge metabolitter med lav overflod. Samlet set er brugen af SRS-mikroskopi i biomedicinsk forskning vokset enormt i det sidste årti. SRS-billeddannelse vil yderligere drage fordel af de teknologiske forbedringer i detektionsfølsomhed, rumlig opløsning og multiplexingkapacitet og i sidste ende udvide brugen af det i kvantitativ overvågning af biomolekyler, især lipider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), Marts Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.), og af HHMI investigator (M.C.W.). Vi takker Caenorhabditis Genetics Center (CGC) for C. elegans stammer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A/D converter | Olympus | Analog Unit | |
| Agarose | GeneMate | 3119 | For making agarose pads |
| Alignment tool - adapter | Thorlabs | SM1A4 | For mounting the tool on scope |
| Alignment tool - target | Thorlabs | VRC2SM1 | For viewing IR laser |
| Alignment tool - tube | Thorlabs | SM1L40 | Length can vary |
| Autocorrelator (Optional) | APE | pulseCheck | |
| Bandpass filter | minicircuits | BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz | For signal with modulation frequency filtering |
| BNC cables | |||
| Dissection microscope | Nikon | SMZ800 | For handling and picking worms for imaging |
| Dodecane | Sigma-Aldrich | 44010 | Used for calibration of the SRS signal |
| Filter | Chroma Technology | 890/220 CARS | For removing Stokes beam |
| General purpose laboratory labeling tape | VWR | 89097 | For making agarose pads |
| Glass coverslips | VWR | 48393-106 | For covering worms for imaging |
| Glass microscope slide | VWR | 16004-422 | For making agarose pads |
| Laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Lens | Thorlabs | L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B |
For beam expander |
| Lock-in amplifier | Zurich | HF2LI | |
| Lowpass filter | minicircuits | BLP-1.9+ | For power supply noise suppression |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E03 | For relay and periscope |
| Objective | Olympus | UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20 | |
| Photodiode | Thorlabs | FDS1010 | |
| Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
| Power supply | TEKPOWER | TP1342U | For photodiode, reversed 50V voltage |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | For anaesthesizing the worms |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
References
- Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).
- Eckel, R. H., et al. Obesity and type 2 diabetes: what can be unified and what needs to be individualized. Diabetes Care. 34 (6), 1424-1430 (2011).
- Poirier, P., et al. Obesity and cardiovascular disease: pathophysiology, evaluation, and effect of weight loss. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (5), 968-976 (2006).
- Bhaskaran, K., et al. Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5.24 million UK adults. Lancet. 384 (9945), 755-765 (2014).
- Shen, Y., Hu, F., Min, W. Raman imaging of small biomolecules. Annual Review of Biophysics. 48, 347-369 (2019).
- Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
- Syed, A., Smith, E. A. Raman imaging in cell membranes, lipid-rich organelles, and lipid bilayers. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), Palo Alto, Calif. 271-291 (2017).
- Thomas, G. J. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 1-27 (1999).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, Palo Alto, Calif. 883-909 (2008).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
- Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (28), 11226-11231 (2013).
- Wei, L., et al. Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering. Nature Methods. 11 (4), 410-412 (2014).
- Ramachandran, P. V., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Label-free biomedical imaging of lipids by stimulated Raman scattering microscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 31 (2015).
- Srinivasan, S. Regulation of body fat in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Physiology. 77, 161-178 (2015).
- Vrablik, T. L., Petyuk, V. A., Larson, E. M., Smith, R. D., Watts, J. L. Lipidomic and proteomic analysis of Caenorhabditis elegans lipid droplets and identification of ACS-4 as a lipid droplet-associated protein. Biochimca Et Biophysica Acta. 1851 (10), 1337-1345 (2015).
- Yu, Y., Mutlu, A. S., Liu, H., Wang, M. C. High-throughput screens using photo-highlighting discover BMP signaling in mitochondrial lipid oxidation. Nature Communications. 8 (1), 865 (2017).
- Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12 (10), 2081-2096 (2017).
- Murphy, C. T., Hu, P. J. Insulin/insulin-like growth factor signaling in C. elegans. WormBook. , 1-43 (2013).
- Shi, X., et al. Regulation of lipid droplet size and phospholipid composition by stearoyl-CoA desaturase. Journal of Lipid Research. 54 (9), 2504-2514 (2013).
- Watts, J. L., Ristow, M. Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (2), 413-446 (2017).
- Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277 (5328), 942-946 (1997).
- Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
- Chen, A. T., et al. Longevity genes revealed by integrative analysis of isoform-specific daf-16/FoxO mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (2), 613-629 (2015).
- Lee, R. Y., Hench, J., Ruvkun, G. Regulation of C. elegans DAF-16 and its human ortholog FKHRL1 by the daf-2 insulin-like signaling pathway. Current Biology. 11 (24), 1950-1957 (2001).
- Mutlu, A. S., Gao, S. M., Zhang, H., Wang, M. C. Olfactory specificity regulates lipid metabolism through neuroendocrine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 11 (1), 1450 (2020).
- Chen, A. J., et al. Fingerprint Stimulated Raman Scattering imaging reveals retinoid coupling lipid metabolism and survival. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (19), 2500-2506 (2018).
- Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
- Lin, C. J., Wang, M. C. Microbial metabolites regulate host lipid metabolism through NR5A-Hedgehog signalling. Nature Cell Biology. 19 (5), 550-557 (2017).
- Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
- Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metabolism. 8 (3), 266-274 (2008).
- Elle, I. C., Rodkaer, S. V., Fredens, J., Faergeman, N. J. A method for measuring fatty acid oxidation in C. elegans. Worm. 1 (1), 26-30 (2012).
- Ezcurra, M., et al. elegans eats its own intestine to make yolk leading to multiple senescent pathologies. Current Biology. 28 (16), 2544-2556 (2018).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Long, R., et al. Two-color vibrational imaging of glucose metabolism using stimulated Raman scattering. Chemical Communications. 54 (2), Cambridge, England. 152-155 (2018).
- Zhao, Z., Shen, Y., Hu, F., Min, W. Applications of vibrational tags in biological imaging by Raman microscopy. Analyst. 142 (21), 4018-4029 (2017).
- Liao, C. S., et al. In vivo and in situ spectroscopic imaging by a handheld Stimulated Raman Scattering Microscope. ACS Photonics. 5 (3), 947-954 (2018).
- Lee, H. J., et al. Assessing cholesterol storage in live cells and C. elegans by stimulated Raman scattering imaging of phenyl-Diyne cholesterol. Scientific Reports. 5, 7930 (2015).
- Wang, P., et al. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angewandte Chemie (International Edition in English). 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1087-1095 (2020).
- Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman Scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
- Brinkmann, M., et al. Portable all-fiber dual-output widely tunable light source for coherent Raman imaging. Biomedical Optics Express. 10 (9), 4437-4449 (2019).
