Gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie maakt selectieve, labelvrije beeldvorming van specifieke chemische moieties mogelijk en het is effectief gebruikt om lipidemoleculen in vivo in beeld te brengen. Hier geven we een korte inleiding tot het principe van SRS-microscopie en beschrijven we methoden voor het gebruik ervan bij de opslag van beeldvormende lipiden in Caenorhabditis elegans.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Lipidenmetabolisme is een fundamenteel fysiologisch proces dat nodig is voor de gezondheid van cellulaire en organismen. Dysregulatie van lipidenmetabolisme roept vaak obesitas en vele bijbehorende ziekten op, waaronder cardiovasculaire aandoeningen, diabetes type II en kanker. Om het huidige begrip van lipide metabole regulatie te bevorderen, zijn kwantitatieve methoden om in vivo lipidenopslagniveaus in tijd en ruimte nauwkeurig te meten steeds belangrijker en nuttiger geworden. Traditionele benaderingen voor het analyseren van lipidenopslag zijn semi-kwantitatief voor microscopische beoordeling of ontbreken spatio-temporele informatie voor biochemische meting. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopie is een labelvrije chemische beeldvormingstechnologie die snelle en kwantitatieve detectie van lipiden in levende cellen met een subcellulaire resolutie mogelijk maakt. Omdat het contrast wordt benut door intrinsieke moleculaire trillingen, maakt SRS-microscopie ook vierdimensionale tracking van lipiden bij levende dieren mogelijk. In het afgelopen decennium is SRS-microscopie veel gebruikt voor beeldvorming van kleine moleculen in biomedisch onderzoek en overwint het de belangrijkste beperkingen van conventionele fluorescerende kleurings- en lipideextractiemethoden. In het laboratorium hebben we SRS-microscopie gecombineerd met de genetische en biochemische hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor het krachtige modelorganisme Caenorhabditis elegans, om de verdeling en heterogeniteit van lipidedruppels over verschillende cellen en weefsels te onderzoeken en uiteindelijk nieuwe geconserveerde signaleringsroutes te ontdekken die het lipidenmetabolisme moduleren. Hier presenteren we de werkprincipes en de gedetailleerde opstelling van de SRS-microscoop en bieden we methoden voor het gebruik ervan bij het kwantificeren van lipidenopslag op verschillende ontwikkelingsmomenten van wild-type en insulinesignaleringsdeficiënte mutant C. elegans.
Inleiding
Obesitas is een wereldwijd gezondheidsprobleem geworden dat een derde van de bevolking over de hele wereld bedreigt, en het vormt een ernstige medische zorg, gezien de associatie met slechte geestelijke gezondheid1 en dodelijke ziekten, waaronder diabetes2,hart- en vaatziekten3 en sommige soorten kanker4. Studie van lipidenmetabolisme is essentieel om de biologische problemen achter obesitas beter te begrijpen. Snelle en specifieke kwantificering van lipidenopslag omvat de detectie van vetzuren en derivaten daarvan, evenals sterolhoudende metabolieten, met een hoge gevoelig....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Instrumentale opstelling voor Stimulated Raman Scattering Microscopy
OPMERKING: Het SRS-microscopiesysteem is gebouwd op een picoseconde laser met geïntegreerde optische parametrische oscillator en een confocale laserscanmicroscoop. De oscillator levert twee picoseconde pulstreinen, waaronder een Stokes-straal bij 1.064 nm en een pompstraal met een afstembare pompstraal tussen 700-990 nm. Tijdelijke en ruimtelijke overlapping van de twee stralen worden bereikt in de laser. Een ingebouwde elektro-optische modulator (EOM) is speciaal ontworpen voor SRS-microscopie. Dit protocol zal zich richten op het koppelen van de laser aan de microscoop ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Insulinesignalering is een belangrijke endocriene route die van invloed is op ontwikkeling, reproductie, levensduur en metabolisme. Bij wormen bestaat insulinesignalering uit ongeveer 40 insuline-achtige peptide liganden, insuline-achtige groeifactor receptor ortholog DAF-2, downstream PI3K/AKT kinase cascade, en de FoxO transcriptie factor ortholog, DAF-1620. daf-2 mutanten, die de insulinereceptor missen, hebben meer lipidedruppels in hun darm, het wormlipideopslagweefsel
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Ter verdediging tegen obesitas en de bijbehorende metabole stoornissen zijn belangrijke onderzoeksinspanningen geïmplementeerd om de regulerende mechanismen van lipidehomeostase beter te begrijpen. Voor kwantitatieve detectie van lipidemoleculen in biologische monsters is bewezen dat labelvrije beeldvorming door SRS-microscopie een betrouwbaar alternatief is voor biochemische assays en andere kleuringsmethoden. Onze groep en anderen hebben nieuwe biologische mechanismen in lipide metabole regulatie onthuld door het gebru.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), March of Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.), en door HH.C.W.). We danken het Caenorhabditis Genetics Center (CGC) voor C. elegans stammen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| A/D converter | Olympus | Analog Unit | |
| Agarose | GeneMate | 3119 | Voor het maken van agarose pads |
| Alignment tool - adapter | Thorlabs | SM1A4 | Voor het monteren van het gereedschap op de scope |
| Alignment tool - target | Thorlabs | VRC2SM1 | Voor het bekijken van IR-laser |
| Alignment tool - tube | Thorlabs | SM1L40 | Lengte kan variëren |
| Autocorrelator (Optioneel) | APE | pulseCheck | |
| Bandpass filter | minicircuits | BBP-21.4+ als gemoduleerd op 20MHz of KR Electronics 2724 als gemoduleerd op 8 MHz | Voor signaal met modulatiefrequentie filteren |
| BNC kabels | |||
| Dissectiemicroscoop | Nikon | SMZ800 | Voor het handelen en plukken van wormen voor beeldvorming |
| Dodecane | Sigma-Aldrich | 44010 | Gebaat voor kalibratie van het SRS signaal |
| Filter | Chroma Technology | 890/220 CARS | Voor het verwijderen van de Stokes straal |
| Algemene laboratorium etiketteertape | VWR | 89097 | Voor het maken van agarose pads |
| Glazen dekglasjes | VWR | 48393-106 | Voor het bedekken van wormen voor beeldvorming |
| Glazen microscoopglaasje | VWR | 16004-422 | Voor het maken van agarose pads |
| Laser scanning microscoop | Olympus | FV3000 | |
| Lens | Thorlabs | L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B | Voor bundeluitbreider |
| Lock-in versterker | Zurich | HF2LI | |
| Laagdoorlaatfilter | minicircuits | BLP-1.9+ | Voor stroomvoorziening ruisonderdrukking |
| Spiegels | Thorlabs | BB1-E03 | Voor relais en periscoop |
| Objectief | Olympus | UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20 | |
| Fotodiode | Thorlabs | FDS1010 | |
| Picoseconde laserbron | APE | picoEmerald | |
| Voeding | TEKPOWER | TP1342U | Voor fotodiode, omgekeerde 50V spanning |
| Natriumazid | Sigma | S2002 | Voor het anestheseren van de wormen |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
Referenties
- Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).
- Eckel, R. H., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
