In questo studio, presentiamo un metodo di imaging in tempo reale utilizzando la microscopia confocale per osservare le cellule che si muovono verso il tessuto danneggiato mediante incubazione ex vivo con l'epitelio cocleare contenente l'organo di Corti.
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Articolo metodologico
Imaging a cellule vive time-lapse in vitro per esplorare la migrazione cellulare verso l'organo di Corti
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Per studiare gli effetti delle cellule staminali mesenchimali (CSC) sulla rigenerazione e sul trattamento cellulare, questo metodo tiene traccia della migrazione MSC e dei cambiamenti morfologici dopo la co-coltura con epitelio cocleare. L'organo di Corti è stato immobilizzato su un coverslip di plastica premendo una porzione della membrana del Reissner generata durante la dissezione. I CSC confinati da un cilindro di vetro migrarono verso l'epitelio cocleare quando il cilindro fu rimosso. La loro localizzazione predominante è stata osservata nel modiolo dell'organo di Corti, allineato in una direzione simile a quella delle fibre nervose. Tuttavia, alcuni CSC erano localizzati nell'area limbus e mostravano una forma allungata orizzontalmente. Inoltre, la migrazione nell'area delle cellule cieche è stata aumentata e la morfologia dei CSC è cambiata in varie forme dopo il trattamento con kanamicina. In conclusione, i risultati di questo studio indicano che la cocultura dei CSC con epitelio cocleare sarà utile per lo sviluppo di terapie attraverso il trapianto cellulare e per studi di rigenerazione cellulare in grado di esaminare varie condizioni e fattori.
Introduzione
La perdita dell'udito può verificarsi congenitamente o può essere causata progressivamente da diversi fattori, tra cui invecchiamento, farmaci e rumore. La perdita dell'udito è spesso difficile da trattare perché è molto difficile ripristinare la funzione compromessa una volta che le cellule ciliate responsabili dell'udito sonodanneggiate 1. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità, si stima che 461 milioni di persone in tutto il mondo abbiano ipoacusia, che rappresenta il 6,1% della popolazione mondiale. Di coloro che hanno ipoacusia, il 93% sono adulti e il 7% sono bambini.
Sono stati tentati diversi approcci....
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Protocollo
Tutti i protocolli di ricerca che coinvolgono topi ICR sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Yonsei University presso il Wonju College of Medicine. Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo il Codice Etico della World Medical Association. In questo protocollo, i topi ICR in gravidanza sono stati tenuti in un ciclo chiaro / scuro di 12/12 h con libero accesso a cibo e acqua.
1. Dissezione delle cocche
- Sterilizzare la cappa di coltura del tessuto di flusso laminare accendendo la luce ultravioletta per ~ 30 minuti e spruzzare tutte le superfici con il 70% di etanolo prima dell'uso. Lasc....
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Risultati
La migrazione in vitro dei CSC in modalità tridimensionale è stata valutata da un sistema Transwell o dal tradizionale metodo di guarigione delle ferite per osservare la migrazione in modalità bidimensionale (2D)11. L'organo di Corti è una struttura complessa composta da varie cellule come cellule boettcher, cellule claudio, cellule deiters, cellule di pilastro, cellule di Hensen, cellule ciliate esterne, cellule ciliate interne, fibre nervose, membrana basiolare e.......
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Discussione
Il trapianto di MBC in siti danneggiati per promuovere la rigenerazione delle cellule danneggiate è stato ampiamente studiato e l'effetto terapeutico è evidente. Il trapianto e la successiva differenziazione dei CSC sono stati segnalati per ripristinare l'udito nei ratti con perdita dell'udito indotta da acido 3-nitropropionico13. Sebbene Lee et al. Fino a poco tempo fa, quasi 12 esperimenti sono stati condotti per ripristinare l'udito nel modello di roditore mediante trapi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da borse di ricerca (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) della National Research Foundation (NRF) della Corea e del Fondo di ricerca universitaria Hallym.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10X PBS Buffer | GenDEPOT | P2100-104 | |
| 4% Formalina | T& I | BPP-9004 | |
| Ampicillina | sigma | A5354-10ml | |
| BSA | sigma | A4503-100G | |
| piatto confocale | SPL | 200350 | |
| microscopio confocale | ZEISS | LSM800 | |
| vetrino coprioggetti | SPL | 20009 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-018 | |
| Siero fetale bovino | Thermo Fisher scientific | 16140071 | |
| Fluorsheild con | DAPI sigma | F6057 | |
| Pinza | Dumont | 0508-L5-P0 | |
| HBSS | Thermo Fisher scientific | 14065056 | |
| HEPES | Thermo Fisher scientific | 15630080 | |
| integratore N2 | Gibco | 17502-048 | |
| Falloidina-iFluor 647 Reagente | abcam | ab176759 | |
| Incubatore a tavolino | TOKAI HIT | WELSX | |
| Ceppo C57BL/6 cellule staminali menenchimali di topo con GFP | cyagen | MUBMX-01101 | |
| Triton X-100 | sigma | T8787 |
Riferimenti
- Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. Global hearing loss prevention. Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise revie....
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Ristampe e permessi
