Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Locatie, dissectie en analyse van het Murine Stellate Ganglion

14.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62026

⸱

22 december 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, EVK Düsseldorf, cNEP, cardiac Neuro- and Electrophysiology Research Consortium, 2DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 3Institute of Neural and Sensory Physiology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Düsseldorf, 4Clinic for Cardiology, University Heart & Vascular Centre, University Hospital Hamburg-Eppendorf, 5Department of Cardiology, Leiden University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Pathofysiologische veranderingen in het cardiale autonome zenuwstelsel, vooral in de sympathische tak, dragen bij aan het ontstaan en onderhoud van ventriculaire aritmieën. In dit protocol laten we zien hoe we murine stellate ganglia kunnen karakteriseren om het begrip van de onderliggende moleculaire en cellulaire processen te verbeteren.

Samenvatting

Het autonome zenuwstelsel is een belangrijke aanjager van hartelektrofysiologie. Vooral de rol van zijn sympathische tak is een lopende kwestie van onderzoek in de pathofysiologie van ventriculaire aritmieën (VA). Neuronen in de stellate ganglia (SG)   – bilaterale stervormige structuren van de sympathische keten –   zijn een belangrijk onderdeel van de sympathische infrastructuur. De SG zijn een erkend doelwit voor behandeling via cardiale sympathische denervatie bij patiënten met therapierefractaire VA. Hoewel neuronale remodellering en gliaactivering in de SG zijn beschreven bij patiënten met VA, worden de onderliggende cellulaire en moleculaire processen die mogelijk voorafgaan aan het begin van aritmie slechts onvoldoende begrepen en moeten ze worden opgehelderd om autonome modulatie te verbeteren. Muismodellen stellen ons in staat om sympathische neuronale remodellering te bestuderen, maar identificatie van de murine SG is een uitdaging voor de onervaren onderzoeker. Zo ontbreken diepgaande cellulaire en moleculair biologische studies van de muriene SG voor veel voorkomende hartziekten. Hier beschrijven we een basisrepertoire voor het ontleden en bestuderen van de SG bij volwassen muizen voor analyses op RNA-niveau (RNA-isolatie voor genexpressieanalyses, in situ hybridisatie), eiwitniveau (immunofluorescente whole mount staining) en cellulair niveau (basismorfologie, celgroottemeting). We presenteren mogelijke oplossingen om uitdagingen in de bereidingstechniek te overwinnen en hoe we kleuring kunnen verbeteren door autofluorescentie te doven. Dit maakt de visualisatie van neuronen en gliacellen via gevestigde markers mogelijk om de celsamenstelling en remodelleringsprocessen te bepalen. De hier gepresenteerde methoden maken het mogelijk om de SG te karakteriseren om meer informatie te krijgen over autonome disfunctie bij muizen die vatbaar zijn voor VA en kunnen worden aangevuld met aanvullende technieken die neuronale en gliale componenten van het autonome zenuwstelsel in het hart onderzoeken.

Inleiding

Het autonome hart zenuwstelsel is een strak gereguleerd evenwicht van sympathische, parasympathische en zintuiglijke componenten waarmee het hart zich kan aanpassen aan omgevingsveranderingen met de juiste fysiologische respons1,2. Verstoringen in dit evenwicht, bijvoorbeeld een toename van sympathische activiteit, zijn vastgesteld als een belangrijke drijfveer voor het ontstaan en het behoud van ventriculaire aritmieën (VA)3,4. Daarom is autonome modulatie, bereikt via farmacologische vermindering van sympathische activiteit met bètablokkers, al tientallen jaren een hoeksteen in de behandeling van patiënten met VA5,6. Maar ondanks farmacologische en kathetergebaseerde interventies lijdt een relevant aantal patiënten nog steeds aan terugkerende VA7.

Sympathische input voor het hart wordt meestal gemedieerd via neuronale cellichamen in de stellate ganglia (SG), bilaterale stervormige structuren van de sympathische keten, die informatie doorgeven via tal van intrathoracale zenuwen van de hersenstam naar het hart8,9,10. Zenuw ontkiemen uit de SG na letsel wordt geassocieerd met VA en plotselinge hartdood11,12, met de nadruk op de SG als een doelwit voor autonome modulatie13,14. Een vermindering van de sympathische input in het hart kan tijdelijk worden bereikt via percutane injectie van lokale anesthetica of permanent door gedeeltelijke verwijdering van de SG via video-ondersteunde thoracoscopie15,16. Cardiale sympathische denervatie biedt een optie voor patiënten met therapie-refractaire VA met veelbelovende resultaten14,16,17. We hebben van explanted SG van deze patiënten geleerd dat neuronale en neurochemische remodellering, neuro-ontsteking en gliaactivering kenmerken zijn van sympathische remodellering die autonome disfunctie kunnen bijdragen of verergeren18,19. Toch blijven de onderliggende cellulaire en moleculaire processen in deze neuronen tot op heden onduidelijk, bijvoorbeeld de rol van neuronale transdifferentiatie in een cholinerge fenotype20,21. Experimentele studies presenteren nieuwe benaderingen om VA te behandelen, bijvoorbeeld de vermindering van sympathische zenuwactiviteit via optogenetica22, maar diepgaande karakterisering van de SG ontbreekt nog steeds in veel hartpathologieën die hand in hand gaan met VA. Muismodellen die deze pathologieën nabootsen, maken het mogelijk neuronale remodellering te bestuderen die mogelijk voorafgaat aan het begin van aritmieën12,23. Deze kunnen worden aangevuld door verdere morfologische en functionele analyses voor autonome karakterisering van het hart en het zenuwstelsel. In dit protocol bieden we een basisrepertoire van methoden waarmee de murine SG kan worden ontleed en gekarakteriseerd om het begrip van VA te verbeteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot dieren zijn goedgekeurd door het Comité voor verzorging en gebruik van dieren van de staat Hamburg (ORG870, 959) en het Noordrijn-Westfalense staatsagentschap voor natuur, milieu en consumentenbescherming (LANUV, 07/11) en voldoen aan de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de Nationale Instituten voor gezondheid (2011). Studies werden uitgevoerd met mannelijke en vrouwelijke (leeftijd 10-24 weken) C57BL/6 muizen (stamnummer 000664, Jackson Laboratories) en muizen homozygoot (db/db) of heterozygoot (db/het; controle) voor de diabetes spontane mutatie (Leprdb; BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, voorraadnummer 000642, Jackson Laboratories). De auteurs hebben de protocollen gebruikt zonder variaties voor muizen tot 60 weken oud.

1. Locatie en dissectie van murine stellate ganglia

OPMERKING: Hoewel beschrijvingen en tekeningen meestal beschikbaar zijn in grotere soorten, hebben sommige publicaties eerder de locatie van de SG beschreven bij ratten24 en muizen25 met behulp van anatomische methoden en fluorescerende verslaggeverlijnen, respectievelijk.

  1. Bereid 50 ml ijskoude (3-4 °C) gepariniseerde (20 eenheden/ml, zie tabel met materialen)fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Dissectie van de SG uitvoeren bij kamertemperatuur (RT).
  2. Verdoof de muis diep door inademing van 3%-5% isofluraan volgens de institutionele en lokale richtlijnen. Controleer de juiste anesthesie door verlies van pedaalontwenningsreflex. Onthoofd muizen of voer cervicale dislocatie uit.
    OPMERKING: Onjuiste cervicale dislocatie kan leiden tot breuk van de wervelkolom en schade van de borstvaten die leiden tot bloedingen die de voorbereiding of het verbreken van de sympathische keten belemmeren, zodat SG niet in hun juiste positie is. Daarom is het van cruciaal belang om ervaren personeel cervicale dislocatie te laten uitvoeren of dieren te onthoofden in diepe sedatie.
  3. Besproei de huid met ethanol en open de thorax met twee incisies langs de voorste oksellijnen met behulp van een Mayo-schaar en een smalle patroondarm. Snijd het membraan door en verwijder de voorkant van de ribbenkast.
  4. Verwijder het hart-longpakket door de aorta en vena cava recht boven het middenrif vast te pakken met behulp van een Londense tang en snijd alle vaten en bindweefsel dicht bij de wervelkolom eronder met de Strabismus-schaar.
  5. Spoel de thorax grondig met gepariniseerde PBS met behulp van een plastic wegwerppipet totdat alle sporen van bloed zijn verwijderd.
  6. Plaats de romp onder de verrekijker van de stereomicroscoopvoorbereiding en zorg voor een goede verlichting in de thorax met externe lichtbronnen.
  7. Zoek de eerste rib en de longus botsen spieren.
    OPMERKING: De SG bevinden zich bilateraal, evenwijdig aan de wervelkolom bij de tak tussen de eerste rib en de wervelkolom, in een groef zijdelings aan de longus colli spieren24. De vlakke kant van de SG bevindt zich naast de longus colli spieren. Afhankelijk van het preparaat kunnen delen van de sympathische keten al zichtbaar zijn als witte, schuine vezels parallel aan de wervelkolom. Deze zijn te traceren naar de SG.
  8. Gebruik voorzichtig de punt van de Dumont #5/45 tang om het bindweefsel zijdelings bloot te stellen aan de longus colli spier.
  9. Draai de tang 180° om en gebruik de vlakke kant om de SG vast te pakken en er met minimale druk uit te trekken.
  10. Herhaal dit met de tweede SG.
  11. Plaats beide SG in een schaal (6 cm diameter) gevuld met koude PBS en inspecteer met de juiste vergroting. Verwijder indien nodig overtollige bloedvaten, vetweefsel en grotere zenuwen.
    OPMERKING: Autonome ganglia zijn omgeven door een bindweefselcapsule bestaande uit collageenvezels en fibroblasten26,27. De permeabiliteit van deze capsules lijkt te variëren tussen soorten, verschillende soorten ganglia26 en leeftijd28. Verwijder zoveel mogelijk bindweefsel met dumont #5/45 tang en, indien nodig, een veerschaar.
  12. Afhankelijk van het doel van het experiment gaat u verder met sectie 2, 3 of 5 van dit protocol.

2. Hele mount immunohistochie protocol

OPMERKING: Dit protocol is aangepast van cardiale hele mount kleuringen4,29. Voer incubatiestappen uit voor elke SG in één put van een plaat met 96 put en gebruik 100 μL (voor antilichaamhoudende oplossingen) tot 200 μL (voor alle andere oplossingen) van de oplossing om een volledige dekking te garanderen. Controleer regelmatig de dekking en de juiste onderdompeling van de SG met een verrekijker. Verwijder vloeistoffen handmatig met een pipet van 200 μL met een extra tip van 10 μL bovenop de 200 μL-tip. Dit voorkomt aspiratie van de SG in de pipetpunt. Gebruik vers bereide oplossingen en steriele vloeistoffen om bacteriegroei te voorkomen.

  1. Fix SG voor histologie gedurende 2 uur bij RT in 4% methanolvrij paraformaldehyde (PFA)/PBS.
  2. Verwerk SG zo snel mogelijk, maar ze kunnen 2-4 weken bij 4-6 °C worden bewaard in PBS met 0,02% (m/v) natrium azide op dit punt.
  3. Bereid soedan zwarte voorraadoplossing (1% Soedan zwart met v in 100% ethanol) voor op vermindering van autofluorescentie en verbetering van signaal-achtergrondverhouding30. Los gedurende 2-3 uur op op een magneetroerder bij RT.
    OPMERKING: Gebruik de stamoplossing maximaal 6-8 weken, gooi deze eerder weg wanneer sedimentatie verschijnt.
  4. Bereid soedan zwarte werkoplossing voor door de voorraadoplossing gedurende 30 minuten op volle snelheid (13.000 x g)te centrifugeren om vuil te verwijderen en de voorraad in 70% ethanol te verdunnen tot een uiteindelijke concentratie van 0,25% Soedanzwart.
  5. Behandel SG met het bleekmiddel van Dent om de antilichaampermeabilisatie te verbeteren31. Bereid het bleekmiddel van Dent vers door methanol (MeOH), waterstofperoxideoplossing 30% (m/w) in H2O en dimethylsulfoxide (DMSO) te mengen in een verhouding van 4:1:1. Voeg 200 μL per SG toe en plaats de plaat gedurende 1 uur bij RT op een orbitale shaker.
  6. Voer een dalende MeOH-serie uit voor rehydratatie door elk 10 minuten te broeden op een orbitale shaker: 100% MeOH, 75% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS, 25% MeOH/PBS.
  7. Voer permeabilisatie uit door SG tweemaal gedurende 60 minuten te incuberen in PBS/1% Triton-X-100 bij RT.
  8. Verwijder permeabilisatieoplossing van de SG en voeg Soedan zwarte werkoplossing toe. Incubeer gedurende 2 uur bij RT op een orbitale shaker.
  9. Bereid ondertussen een blokkerende oplossing voor door 5% receptorkwaliteit runderserumalbumine (BSA) en 0,1% Triton-X-100 in PBS een vat van 15 ml toe te voegen en laat het ongeveer 5-10 minuten oplossen op een rolvaatje. Decanteer door een voorgeplooid papierfilter om vuil te verwijderen.
  10. Verwijder Soedanzwart zeer voorzichtig door de plaat te kantelen en voorzichtig van de rechtopstaande kant te pipetten.
    OPMERKING: Het is niet mogelijk om de SG in Soedan zwart te zien. Gebruik een sterke lichtbron en werk langzaam. Vanaf deze stap is SG zwart gekleurd, wat de zichtbaarheid verbetert. Als er op dit punt extra bindweefsel rond SG wordt gezien, verwijder het dan met dumont #5/45 tang en veerschaar.
  11. Voeg 200 μL PBS/0,1% Triton-X-100 (PBS-T) toe en was gedurende 5 minuten bij RT op een orbitale shaker.
  12. Verwijder PBS-T door het met een pipet te aspireren en herhaal dit 2 keer.
  13. PBS verwijderen; voeg 200 μL blokkeeroplossing toe en incubeer 's nachts bij 4 °C op een orbitale shaker.
  14. Bereid de volgende dag oplossingen voor door primaire antilichamen toe te voegen aan de blokkerende oplossing. Antilichaamconcentraties aanpassen aan vastgestelde protocollen.
    OPMERKING: Neem één SG op als antilichaamcontrole zonder primair antilichaam (geïncubeerd met antigeen-voorgeabsorbeerd antilichaam of IgG, indien beschikbaar, of blokkerende buffer).
  15. Voer primaire antilichaamincubering uit gedurende 36-48 uur bij 4 °C op een orbitale shaker. Gebruik voor celgroottemetingen en kleuring van sympathische neuronen antilichamen tegen tyrosinehydroxylase (zie tabel met materialen voor aanbevelingen voor antilichamen).
    OPMERKING: Plaats de 96-putplaat in een natte kamer (bijv. plastic doos bekleed met ddH2O-bevochtigde papieren handdoeken) om verdamping op dit punt te voorkomen.
  16. Verwijder de antilichaamoplossing zorgvuldig en voeg 200 μL PBS-T toe. Plaats de plaat 30 minuten op een orbitale shaker.
  17. Verwijder PBS-T en herhaal de wasstap 5 keer.
  18. Bereid de secundaire antilichaambewerkingsoplossing voor door fluorescerende Alexa-gelabelde secundaire antilichamen gedurende 1 min op volle snelheid (13.000 x g)voor gebruik te centrifugeren. Verdun de juiste secundaire antilichamen volgens de primaire antilichamen 1:500 in de blokkeeroplossing en voeg toe aan SG. Voeg 1 μg/ml bisbenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst-kleuring) toe als nucleaire kleuring gewenst is. Incubeer gedurende 12-24 uur bij 4 °C op een orbitale shaker.
  19. Verwijder de antilichaamoplossing voorzichtig en voeg 200 μL PBS-T toe. Plaats de plaat 30 minuten op een orbitale shaker.
  20. Verwijder PBS-T en herhaal de wasstap 5 keer. Gebruik PBS voor de laatste stap zonder Triton.
  21. Voor inbedding, spreid 50-100 μL fluorescerend montagemedium (zie tabel met materialen)op een glazen glijbaan en plaats onder voorbereiding verrekijker. Gebruik Dumont #5/45 tang om SG van de 96-putplaat op te halen en overtollige vloeistof te verwijderen door het ene uiteinde op een filterpapier (bijv. Whatman-droogkussen) te dompelen en op de druppel te plaatsen.
  22. Gebruik Dumont #5/45 tang om de positionering met de juiste vergroting te corrigeren.
  23. Plaats voorzichtig een glazen afdeklip (20 mm x 20 mm) naast de SG en daal langzaam af.
    OPMERKING: Het gebruik van te veel montagemedium zal resulteren in beweging van de SG of klitten van zenuwen. Als dat gebeurt, verwijder dan snel de afdeklip en herhaal stap 2.9-2.21.
  24. Laat de dia's 's nachts in het donker drogen bij RT. Opslag van het gevlekte monster is mogelijk gedurende ten minste 4-6 weken bij 4 °C.

3. Hele mount in situ hybridisatie

OPMERKING: Whole-mount in situ-hybridisatie van de SG is aangepast van het orgaan van corti32 en het commerciële RNA fluorescentie in situ protocol (zie Tabel van Materialen). Verkrijg sondes voor de genen van belang en buffers en oplossingen van de leverancier. Alle incubatiestappen worden uitgevoerd bij RT, indien niet anders vermeld. Gebruik steriel PBS. Als u geïnteresseerd bent in het kleuren van meerdere SG in één put, gebruik dan ten minste 150 μL buffers en oplossingen.

  1. Voer dissectie van de SG uit zoals beschreven in stap 1.1-1.13.
  2. Fixeer SG gedurende 1 uur in 200 μL van 4% MeOH-vrije PFA/PBS in één put van een 96-putplaat die op een orbitale shaker is geplaatst.
  3. Was SG drie keer gedurende 30 minuten elk in 0,1% Tween-20/PBS op een orbitale shaker.
  4. Dehydrateer SG in de MeOH/PBS-serie door daaropvolgende incubatie in 50% MeOH/PBS, 70% MeOH/PBS en 100% MeOH gedurende elk 10 minuten op een orbitale shaker.
  5. Bewaar SG 's nachts bij -20 °C in 100% MeOH.
  6. Verwarm de incubator de volgende dag voor tot 40 °C. Controleer de temperatuur met een thermometer.
  7. Rehydrateer SG in omgekeerde MeOH/PBS-serie (100% MeOH, 70% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS) gedurende elk 10 minuten.
  8. Was SG drie keer gedurende 5 minuten elk in PBS.
  9. Begin ondertussen met het voorverwarmen van de sondes door incubatie bij 40 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door koeling gedurende 10 minuten.
  10. Incubeer SG in 200 μL Protease III gedurende 15 min.
  11. Optioneel: Voer een soedanzwarte behandeling uit om autofluorescentie te doven overeenkomstig de punten 2.3, 2.4 en 2.8 van dit protocol als latere immunofluorescentiekleuring is gepland.
  12. Was SG in 200 μL van 0,1% Tween-20/PBS 3x gedurende 5 minuten elk op een orbitale shaker.
  13. Optioneel: Als co-kleuring met meerdere sondes gewenst is, verdun dan Kanaal-2 (50x) en Kanaal-3 sonde (50x) in Kanaal-1 sonde (1x).
  14. Bedek SG met 100 μL sonde voor het gen van belang en incubeer 's nachts bij 40 °C met lichte agitatie. Plaats de 96-putplaat in een natte kamer op 40 °C voor alle incubatiestappen.
    OPMERKING: Neem één SG op als negatieve controle, met behulp van een sonde tegen een bacterieel gen (bijv. dihydro-didiicolinaat reductase, Dapb) om in latere stappen te controleren op niet-specifieke binding van versterkingsreagentia.
  15. Was SG in de meegeleverde wasbuffer 3x gedurende 15 minuten elk op een orbitale shaker.
  16. Verwarm amp1-3, HRP-C1 en HRP-Blocker vooraf op RT. Indien co-kleuring met Kanaal-2 en/of Kanaal-2 sonde gewenst is, pre-warm HRP-C2 en HRP-C3.
  17. Bevestig SG gedurende 10 minuten bij RT in 4% PFA/PBS op een orbitale shaker.
  18. Was SG in 200 μL meegeleverde wasbuffer 3x gedurende 5 minuten elk op een orbitale shaker bij RT.
  19. Voor versterking, incubeer SG met 100 μL Amp1 gedurende 35 min bij 40 °C op een orbitale shaker.
  20. Verwijder voorzichtig alle vloeistof en was SG in 200 μL meegeleverde wasbuffer 3x gedurende 5 minuten elk bij RT op een orbitale shaker.
  21. Incubeer SG met 100 μL Amp2 gedurende 35 min bij 40 °C op een orbitale shaker.
  22. Herhaal stap 3.18.
  23. Incubeer SG met 100 μL Amp3 gedurende 20 min bij 40 °C op een orbitale shaker.
  24. Herhaal stap 3.18.
  25. Incubeer SG met 100 μL meegeleverde Multiplex FL v2 HRP-C1 gedurende 20 min bij 40 °C op een orbitale shaker.
  26. Herhaal stap 3.18.
  27. Bereid opaal-geconjugeerd secundair antilichaam 1:1.000 in 200 μL van de meegeleverde TSA-buffer en incubeer SG gedurende 35 minuten bij 40 °C op een orbitale shaker. Bescherm tegen licht tijdens incubatie en tegen deze stap.
  28. Herhaal stap 3.18.
  29. Incubeer SG in 100 μL meegeleverde Multiplex FL v2 HRP-blocker gedurende 15 min bij 40 °C op een orbitale shaker.
  30. Herhaal stap 3.18.
  31. Optioneel: Herhaal de stappen 3.25-3.30 met meegeleverde Multiplex FL v2 HRP-C2 voor co-kleuring met kanaal-2-sonde.
  32. Optioneel: Herhaal de stappen 3.25-3.30 met meegeleverde Multiplex FL v2 HRP-C3 voor co-kleuring met kanaal-3-sonde.
  33. Voer in het geval van daaropvolgende immunofluorescente kleuring de stappen 2.13-2.25 van dit protocol uit.
  34. Incubeer in 1% BSA/PBS gedurende 30 min op een orbitale shaker.
  35. Incubeer SG gedurende 30 min in 1 μg/ml bisbenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst-kleuring) in 1% BSA/PBS als nucleaire kleuring gewenst is en/of voeg Alexa-gekoppelde tarwekiemagglutinine (WGA, 1:500) toe op een orbitale shaker.
  36. Herhaal stap 3.18.
  37. Insluiten zoals beschreven in stap 2.19-2.22.

4. Beeldvorming en analyses van murine stellate ganglia

  1. Voer confocale microscopie van embedded SG uit in de lokale beeldvormingsfaciliteit.
  2. Als celgrootte metingen nodig zijn, beeld SG gekleurd voor tyrosine hydroxylase (zie tabel van materialen)op 200x vergroting en neem 4-6 willekeurige beelden van elke SG.
  3. Analyseer afbeeldingen met behulp van ImageJ33-software om de celgrootte te schatten (bijvoorbeeld met een pentabel, zie Tabel met materialen). Gebruik vrije handselectie,cirkel elke cel en klik op Analyseren | Meten om celgebied te verkrijgen. Zorg ervoor dat u alleen intacte, volledig zichtbare cellen opneemt die zich ver binnen de SG bevinden.
  4. Voer met deze methode een meting uit van ongeveer 100 cellen per SG.
  5. Laat een blinde onderzoeker stap 4.2-4.3 uitvoeren als u SG van verschillende muizen wilt vergelijken. Gebruik een frequentieverdeling in statistische software om grootteverschillen tussen groepen34te visualiseren .

5. Moleculaire analyses van murine stellate ganglia

OPMERKING: Voeg besturingselementen toe, afhankelijk van uw experimentele ontwerp. Dit kan SG zijn met verschillende genotypen en ziekteachtergrond en/of andere autonome ganglia, zoals het sympathische superieure cervicale ganglion (gelegen in het nekgebied, zie gedetailleerde beschrijving in Ziegler et al.35) of parasympathische ganglia (zoals intracardiale ganglia, zie Jungen et al.4).

  1. Bereid per dier een buis van 2 ml met 500 μL fenol/guanidinethiocyanaatoplossing (bv. Qiazol) en houd vloeibare stikstof klaar voor schokken of overweeg commerciële oplossingen voor de bescherming van RNA (facultatief, zie materiaaltabel)36. Werk snel voor RNA-isolatie.
  2. Voer dissectie van de SG uit zoals beschreven in stap 1.1-1.13.
  3. Dompel beide SG onmiddellijk onder in één buis met fenol/guanidine thiocyanaatoplossing en shock-frost buis in vloeibare stikstof.
  4. Bewaren bij -80 °C tot verdere verwerking.
  5. Laat voor weefsellyse buizen met SG ontdooien totdat fenol/guanidine thiocyanaatoplossing vloeibaar is en voeg twee roestvrijstalen kralen van 7 mm toe. Koel de metalen delen van weefselhomogenisator (kogel- of mengmolen, bijv. Tissue Lyser II) af op droogijs en centrifugeer bij 4 °C.
  6. Centrifugeer buizen op 500 x g gedurende 1 min bij 4 °C zodat SG zich aan de onderkant van de buis bevindt.
  7. Doe buizen in de metalen delen van de Tissue Lyser en lyse gedurende 1 min bij 20 Hz.
  8. Herhaal stap 5.6 en 5.7 tot 5 keer totdat er geen intact weefsel kan worden gedetecteerd.
  9. Breng de vloeistof over in een verse buis van 1,5 ml.
  10. Voer RNA-isolatie uit met een op kolommen gebaseerde RNA-isolatiekit (bijv. miRNeasy minikit) volgens de instructies van de fabrikant.
  11. Elute RNA in 20 μL RNase-vrij water en meet de concentratie met behulp van een spectrofotometer.
    OPMERKING: Om verontreiniging van het gezuiverde RNA met genomisch DNA uit te sluiten, stellen we voor om een polymerasekettingreactie uit te voeren met genomische primers en 1 μL RNA als sjabloon, in plaats daarvan minus reverse transcriptasecontrole. Dit bespaart een aanzienlijke hoeveelheid RNA. Als RNA verontreinigd is, gebruik dan exon-intron grensprimers of intron flankerende primers voor daaropvolgende kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie.
  12. Gebruik 250 ng SG RNA om cDNA-synthese uit te voeren en gevestigde protocollen te gebruiken. Hier werd een cDNA reverse transcription kit met hoge capaciteit gebruikt volgens de instructies van de fabrikant.
  13. Verdun tot een eindconcentratie van 2,5 ng/μL cDNA en voer kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie uit met de juiste sondes volgens de vastgestelde protocollen. Hier werd TaqMan Assay (zie Tabel van Materialen) uitgevoerd met behulp van 10 ng cDNA per reactie.
    OPMERKING: Voer geen sjablooncontrole uit voor elk gen om vals-positieve resultaten uit te sluiten.
  14. Normaliseer de genexpressie van uw interesse gen op een huishoudgen (bijv. Cdkn1b) om de relatieve genexpressie tussen verschillende groepen SG te vergelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 visualiseert hoe de SG te identificeren en te ontleden. Figuur 1A toont een schematische tekening van de locatie, terwijl figuur 1B het zicht in de thorax weergeeft na verwijdering van het hart-long-pakket. De linker en rechter longus colli spieren mediaal van de SG en de ribbenkast zijn belangrijke oriëntatiepunten voor oriëntatie. Dissectie wordt uitgevoerd langs de stippellijnen tussen spieren en de eerste rib. De SG en ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het begrip van cellulaire en moleculaire processen in neuronen en gliacellen van het sympathische zenuwstelsel die voorafgaan aan het begin van VA is van groot belang, omdat plotselinge hartstilstand wereldwijd de meest voorkomende doodsoorzaak blijft5. Daarom bieden we in het huidige manuscript een basisrepertoire van methoden om de murine SG – een murien element binnen dit netwerk – te identificeren en daaropvolgende analyses uit te voeren op RNA-, eiwit- en cellulair niveau.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Hartwig Wieboldt bedanken voor zijn uitstekende technische bijstand en de UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) van het Universitair Medisch Centrum Hamburg-Eppendorf voor het leveren van microscopen en ondersteuning. Dit onderzoek werd gefinancierd door het DZHK (Duits Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek) [FKZ 81Z4710141].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96-well plateTPP92097RNAscope
Adhesion Slides SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mmR. Langenbrinck03-0060Microscopy
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil.Serva11924.03Whole mount staining
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAB2261Whole mount staining
Chicken anti neurofilamentEMD MilliporeAB5539Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Merck, KGA, Darmstadt, GermanyD8418Whole mount staining
Donkey anti chicken IgY Alexa 647 Merck, KGA, Darmstadt, GermanyAP194SA6Whole mount staining
Donkey anti goat IgG Alexa 568 Thermo Fisher ScientificA11057Whole mount staining
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 Thermo Fisher ScientificA21206Whole mount staining
Drying block 37-100 mmWhatman (Sigma Aldrich)WHA10310992 Whole mount staining
Eosin YSigma AldrichE4009Whole mount staining
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %)Th.Geyer2212.5000Whole mount staining
Eukitt mounting mediumAppliChem253681.0008Whole mount staining
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Whole mount staining
Fluoromount-G + DAPISouthern Biotech0100-20Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferaseEMD MilliporeAP144PWhole mount staining
H2O2 30% (w/w)Merck, KGA, Darmstadt, GermanyH1009Whole mount staining
Heparin Sodium 25.000 UI / 5mlRotexmedicaPZN: 3862340Preparation SG
High-capacity cDNA reverse transctiption kitLife technologies 4368813RNA isolation
Isoflurane (Forene)Abbott Laboratories2594.00.00Preparation SG
Mayer's hemalum solutionMerck1.09249.0500Whole mount staining
MethanolSigma-Aldrich34860Whole mount staining
Microscope cover glasses 20x20 mm or smallerMarienfeld0101040Whole mount staining
miRNeasy Mini KitQiagen217004RNA isolation
NanoDrop 2000cThermo Fisher ScientificND-2000CRNA isolation
Opal 570 Reagent PackAkoya BioscienceFP1488001KTRNAscope
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free Alfa Aesar43368Whole mount staining
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mmTh.Geyer7691202Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tabletsGibco18912-014Whole mount staining
Pinzette Dumont SS ForcepsFineScienceTools11203-25Preparation SG
QIAzol Lysis ReagentQiagen 79306RNA isolation
Rabbit anti tyrosine hydroxylaseEMD MilliporeAB152Whole mount staining
RNAlaterMerckR0901-100MLRNA isolation (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2biotechne (ACD)323100RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2biotechne (ACD)431738-C2RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3biotechne (ACD)423391RNAscope
Stainless steel beads 7 mm Qiagen 69990RNA isolation
Sudan black BRoth0292.2Whole mount staining
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan mastermixApplied biosystems4370074Gene Expression analysis 
Tissue Lyser IIQiagen85300RNA isolation
Triton X-100 10% solutionSigma-Aldrich93443-100mlWhole mount staining
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100MLRNAscope
Wacom bamboo penWacomCTL-460/KCell size measurements
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2Sigma-AldrichWHA10311647Whole mount staining
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 ConjugateThermo Fisher ScientificW21404RNAscope

Referenties

  1. Goldberger, J. J., Arora, R., Buckley, U., Shivkumar, K. Autonomic nervous system dysfunction: JACC focus seminar. Journal of the American College of Cardiology. 73 (10), 1189-1206 (2019).
  2. Jänig, W. Neurocardiology: a neurobiologist's perspective. The Journal of Physiology. 594 (14), 3955-3962 (2016).
  3. Meng, L., Shivkumar, K., Ajijola, O. Autonomic Regulation and Ventricular Arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 20 (5), (2018).
  4. Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155(2017).
  5. Al-Khatib, S. M., et al. AHA/ACC/HRS Guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), 272(2018).
  6. Yusuf, S., Wittes, J., Friedman, L. Overview of results of randomized clinical trials in heart disease: I. treatments following myocardial infarction. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 260 (14), 2088-2093 (1988).
  7. Sapp, J. L., et al. Ventricular tachycardia ablation versus escalation of antiarrhythmic drugs. New England Journal of Medicine. 375 (2), 111-121 (2016).
  8. Yasunaga, K., Nosaka, S. Cardiac sympathetic nerves in rats: Anatomical and functional features. The Japanese Journal of Physiology. 29 (6), (1979).
  9. Pardini, B. J., Lund, D. D., Schmid, P. G. Organization of the sympathetic postganglionic innervation of the rat heart. Journal of the Autonomic Nervous System. 28 (3), 193-201 (1989).
  10. Meyer, C., Scherschel, K. Ventricular tachycardia in ischemic heart disease: The sympathetic heart and its scars. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 549-551 (2017).
  11. Cao, J. M., et al. Relationship between regional cardiac hyperinnervation and ventricular arrhythmia. Circulation. 101 (16), 1960-1969 (2000).
  12. Ren, C., et al. Nerve sprouting suppresses myocardial Ito and IK1 channels and increases severity to ventricular fibrillation in rat. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 144 (1-2), 22-29 (2008).
  13. Zipes, D. P., et al. Treatment of ventricular arrhythmia by permanent atrial pacemaker and cardiac sympathectomy. Annals of Internal Medicine. 68 (3), 591-597 (1968).
  14. Kusumoto, F. M., et al. Systematic review for the 2017 AHA/ACC/HRS guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), (2018).
  15. Cronin, E. M., et al. 2019 HRS/EHRA/APHRS/LAHRS Expert Consensus Statement on Catheter Ablation of Ventricular Arrhythmias: Executive Summary. Heart Rhythm. , (2019).
  16. Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation in patients with refractory ventricular arrhythmias or electrical storm: Intermediate and long-term follow-up. Heart Rhythm. 11 (3), 360-366 (2014).
  17. Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation for refractory ventricular arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 69 (25), 3070-3080 (2017).
  18. Ajijola, O. A., et al. Inflammation, oxidative stress, and glial cell activation characterize stellate ganglia from humans with electrical storm. JCI insight. 2 (18), 1-11 (2017).
  19. Rizzo, S., et al. T-cell-mediated inflammatory activity in the stellate ganglia of patients with ion-channel disease and severe ventricular arrhythmias. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 224-229 (2014).
  20. Kanazawa, H., et al. Heart failure causes cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130-signaling cytokines in rodents. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 408-421 (2010).
  21. Olivas, A., et al. Myocardial infarction causes transient cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130. Journal of Neuroscience. 36 (2), 479-488 (2016).
  22. Yu, L., et al. Optogenetic Modulation of Cardiac Sympathetic Nerve Activity to Prevent Ventricular Arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 70 (22), 2778-2790 (2017).
  23. Jungen, C., et al. Increased arrhythmia susceptibility in type 2 diabetic mice related to dysregulation of ventricular sympathetic innervation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 317 (6), 1328-1341 (2019).
  24. Hedger, J. H., Webber, R. H. Anatomical study of the cervical sympathetic trunk and ganglia in the albino rat (Mus norvegicus albinus). Acta Anatomica. 96 (2), 206-217 (1976).
  25. Furlan, A., et al. Visceral motor neuron diversity delineates a cellular basis for nipple- and pilo-erection muscle control. Nature Neuroscience. 19 (10), 1331-1340 (2016).
  26. Al Khafaji, F. A. H., Anderson, P. N., Mitchell, J., Mayor, D. The permeability of the capsule of autonomic ganglia to horseradish peroxidase. Journal of Anatomy. 137 (4), 675-682 (1983).
  27. Armour, J. A., Murphy, D. A., Yuan, B. X., Macdonald, S., Hopkins, D. A. Gross and microscopic anatomy of the human intrinsic cardiac nervous system. Anatomical Record. 247 (2), 289-298 (1997).
  28. Fedoroff, S., Richardson, A., Johnson, M. I. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. (11051), 71-94 (2003).
  29. Scherschel, K., et al. Cardiac glial cells release neurotrophic S100B upon catheter-based treatment of atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (493), 1-12 (2019).
  30. Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
  31. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
  32. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Bassil, G., et al. Pulmonary vein ganglia are remodeled in the diabetic heart. Journal of the American Heart Association. 7 (23), (2018).
  35. Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2018).
  36. Bayles, R. G., et al. Transcriptomic and neurochemical analysis of the stellate ganglia in mice highlights sex differences. Scientific Reports. 8 (1), 8963(2018).
  37. Morales, M. A., et al. Localization of choline acetyltransferase in rat peripheral sympathetic neurons and its coexistence with nitric oxide synthase and neuropeptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11819-11823 (1995).
  38. Jimnez, B., Mora-Valladares, E., Zetina, M. E., Morales, M. A. Occurrence, co-occurrence and topographic distribution of choline acetyl transferase, met-enkephalin and neurotensin in the stellate ganglion of the cat. Synapse. 43 (3), 163-174 (2002).
  39. Ruit, K. G., Osborne, P. A., Schmidt, R. E., Johnson, E. M., Snider, W. D. Nerve growth factor regulates sympathetic ganglion cell morphology and survival in the adult mouse. Journal of Neuroscience. 10 (7), 2412-2419 (1990).
  40. Guo, J., et al. Involvement of P2Y 12 receptor of stellate ganglion in diabetic cardiovascular autonomic neuropathy. Purinergic Signalling. 14 (4), 345-357 (2018).
  41. Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
  42. Hinrichs, S., et al. Precursor proadrenomedullin influences cardiomyocyte survival and local inflammation related to myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (37), 8727-8736 (2018).
  43. Westermann, D., et al. Reduced degradation of the chemokine MCP-3 by matrix metalloproteinase-2 exacerbates myocardial inflammation in experimental viral cardiomyopathy. Circulation. 124 (19), 2082-2093 (2011).
  44. Johnsen, D., Olivas, A., Lang, B., Silver, J., Habecker, B. Disrupting protein tyrosine phosphatase σ does not prevent sympathetic axonal dieback following myocardial infarction. Experimental Neurology. 276, 1-4 (2016).
  45. Manousiouthakis, E., Mendez, M., Garner, M. C., Exertier, P., Makita, T. Venous endothelin guides sympathetic innervation of the developing mouse heart. Nature Communications. 5, 3918(2014).
  46. Wink, J., et al. Human adult cardiac autonomic innervation: Controversies in anatomical knowledge and relevance for cardiac neuromodulation. Autonomic Neuroscience. 227, 102674(2020).
  47. Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
  48. Schäfer, M. K. H., Schütz, B., Weihe, E., Eiden, L. E. Target-independent cholinergic differentiation in the rat sympathetic nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4149-4154 (1997).
  49. Chen, Y., et al. Effect of a Stellate Ganglion block on acute lung injury in septic rats. Inflammation. 41 (5), 1601-1609 (2018).
  50. Lipov, E. G., et al. Effects of stellate-ganglion block on hot flushes and night awakenings in survivors of breast cancer: a pilot study. The Lancet Oncology. 9 (6), 523-532 (2008).
  51. Mo, N., Wallis, D. I., Watson, A. Properties of putative cardiac and non-cardiac neurones in the rat stellate ganglion. Journal of the Autonomic Nervous System. 47 (1-2), 7-22 (1994).
  52. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
  53. Hanani, M. Satellite glial cells in sympathetic and parasympathetic ganglia: In search of function. Brain Research Reviews. 64 (2), 304-327 (2010).
  54. Larsen, H. E., Lefkimmiatis, K., Paterson, D. J. Sympathetic neurons are a powerful driver of myocyte function in cardiovascular disease. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  55. Hasan, W., et al. Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell NGF synthesis following myocardial infarction in rats. Brain Research. 1124 (1), 142-154 (2006).
  56. Lorentz, C. U., et al. Heterogeneous ventricular sympathetic innervation, altered β-adrenergic receptor expression, and rhythm instability in mice lacking the p75 neurotrophin receptor. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (6), 1652-1660 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Sympathisch zenuwstelselhartritmestoornissenmuisedissectieimmunofluorescente kleuringtyrosinehydroxylasegliacellenin situ hybridisatiecelgroottemetingneuronale remodellering
Locatie, dissectie en analyse van het Murine Stellate Ganglion
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.