O presente artigo detalha um protocolo passo-a-passo para eletroantennogramas bem sucedidos e de baixo ruído em vários gêneros de mosquitos, incluindo fêmeas e machos.
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Artigo de método
Um guia passo-a-passo para eletroantennografia de mosquitos
Neste artigo
Resumo
Resumo
As fêmeas de mosquitos são os animais mais mortais do planeta, ceifando a vida de mais de 1 milhão de pessoas todos os anos devido aos patógenos que transmitem ao adquirir uma refeição de sangue. Para localizar um hospedeiro para se alimentar, os mosquitos dependem de uma ampla gama de pistas sensoriais, incluindo visuais, mecânicas, térmicas e olfativas. O estudo detalha uma técnica, a eletroantennografia (EAG), que permite aos pesquisadores avaliar se os mosquitos podem detectar produtos químicos individuais e misturas de produtos químicos de maneira dependente da concentração. Quando acoplada à cromatografia gasosa (GC-EAG), esta técnica permite expor as antenas a uma mistura completa de headspace/complexo e determina quais produtos químicos presentes na amostra de interesse, o mosquito pode detectar. Isso é aplicável a odores corporais do hospedeiro, bem como buquês florais de plantas ou outros odores ecologicamente relevantes (por exemplo, locais de oviposição, odorantes). Aqui, descrevemos um protocolo que permite longas durações de tempo de resposta ao preparo e é aplicável a mosquitos fêmeas e machos de vários gêneros, incluindo mosquitos Aedes, Culex, Anopheles e Toxorhynchites . Como o olfato desempenha um papel importante nas interações mosquito-hospedeiro e na biologia do mosquito em geral, EAGs e GC-EAG podem revelar compostos de interesse para o desenvolvimento de novas estratégias de controle de vetores de doenças (por exemplo, iscas). Complementado com ensaios comportamentais, a valência (por exemplo, atrativo, repelente) de cada produto químico pode ser determinada.
Introdução
Os mosquitos são os organismos mais mortais do planeta, ceifando a vida de mais de um milhão de pessoas por ano e colocando mais da metade da população mundial em risco de exposição aos patógenos que transmitem, ao picar1. Esses insetos dependem de uma ampla gama de pistas (térmicas, visuais, mecânicas, olfativas, auditivas) para localizar um hospedeiro para se alimentar (tanto vegetal quanto animal), para acasalamento e oviposição, bem como para evitar predadores nas fases larval e adulta 2,3. Dentre esses sentidos, o olfato desempenha um papel crítico nos comportamentos acima menciona....
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Protocolo
1. Preparação da solução salina
- Prepare o soro fisiológico com antecedência e guarde na geladeira.
- Siga Beyenbach e Masia26 para preparar a solução.
NOTA: Receita salina em mM: 150,0 NaCl, 25,0 HEPES, 5,0 glicose, 3,4 KCl, 1,8 NaHCO3, 1,7 CaCl 2 e 1,0 MgCl2. O pH é ajustado para 7,1 com NaOH 1 M. Não adicione glicose ou sacarose à preparação neste momento para aumentar o armazenamento na prateleira. Adicione a quantidade necessária ao soro fisiológico antes de executar os EAGs (cerca de 50 mL por experimento).
2. Preparação e armazenamento de odores
- ....
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Resultados
A eletroantennografia é uma ferramenta poderosa para determinar se um produto químico ou mistura de produtos químicos é detectado por uma antena de inseto. Ele também pode ser usado para determinar o limiar de detecção para um determinado produto químico usando um aumento gradual da concentração (ou seja, resposta da curva de dose, Figura 4B). Além disso, é útil testar os efeitos do repelente na resposta a odores relacionados ao hospedeiro29.
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Discussão
Os comportamentos mediados pelo olfato são afetados por muitos fatores, incluindo fisiológicos (por exemplo, idade, hora do dia) e ambientais (por exemplo, temperatura, umidade relativa)30. Assim, ao realizar EAGs, é essencial utilizar insetos que estejam no mesmo estado fisiológico (i.e., monitoramento da idade, fome, acasalamento)31 e também manter um ambiente quente e úmido ao redor da preparação para evitar a dessecação. Uma temperatura em torno de 25 °C é ideal e 60% a.......
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Divulgações
O autor não tem nada a revelar.
Agradecimentos
Sou grato ao Dr. Clément Vinauger e ao Dr. Jeffrey Riffell pelas discussões úteis. Os seguintes reagentes foram obtidos através da BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, Strain STE2, MRA-128, contribuição de Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, contribuição de David W. Severson; Culex quinquefasciatus, Cepa JHB, Ovos, NR-43025. O autor agradece ao Dr. Jake Tu, Dr. Nisha Duggal, Dr. James Weger e Jeffrey Marano pelo fornecimento de ovos de mosquito Culex quinquefasciatus e Anopheles stephensi (cepa: Liston). Aedes albopictus e Toxorhynchites rutilus septentrionalis são derivados d....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Mesa de ar Bancada limpa | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Redutor de ruído |
| Placa analógica-digital | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | Para anestesiar mosquitos |
| Instrumento Sutter capilar de vidro borosilicado | B100-78-10 | Para fazer o registro e referências capilares | |
| Produtos | Químicos Sigma Aldrich | Benzaldeído: 418099-100 mL; Ácido butírico: B103500-100mL; 1-hexanol: 471402-100mL; Óleo mineral: M8410-1L | Produtos químicos usados para os experimentos aqui apresentados CO2 |
| Airgas ou Praxair | N/A | Para anestesiar mosquitos | |
| Fonte de Luz Fria | Volpi | NCL-150 | |
| Seringas descartáveis | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Cabos de eletrodo | World Precision Instruments | 5371 | |
| Gel de eletrodo sem sal | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Gaiola de Faraday | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Redutor de ruído Medidores |
| vazão | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | Um de cada |
| frascos e tampas GCMS | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | Para preparar diluições de odor |
| Seringas de vidro (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | Para entrega de odor para a preparação EAG |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Redutor |
| Jack de 2 mm, Estreito, 90 graus, Com Fio | A-M Systems | 675748 | Suporte de eletrodo |
| Bases magnéticas | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Caixas | de ferramentasMathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | Para fornecer os pulsos |
| Ar médico | Airgas ou Praxair | N/A | Para a companhia aérea principal |
| Microscópio | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipuladores Micromanipulador Compacto Grosso/Fino de Três Eixos | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Amplificador de microeletrodo com headstage | A-M Systems | Modelo 1800 | |
| Suprimentos de criação de mosquitos | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Agulhas | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pipetas Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-6A | Para entrega de odor à preparação EAG |
| Tubulação de PTFE de diferentes diâmetros | Mc Master Carr | N/A | Para conectar a válvula solenóide, medidor de vazão, ect da linha aérea. |
| 30V/5A DC Fonte de Alimentação | Dr. Medidor | PS-305DM | |
| R versão 3.5.1 | R projeto | https://www.r-project.org/ | Para análises de dados |
| Relé para válvula solenóide | N/A | Fio de prata feito sob medida | |
| 0,01" | A-M Systems | 782500 | |
| Válvula solenóide (3 vias) | A Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | Para gravação EAG |
| Whatman papel | Cole Parmer | UX-06648-03 | Para carregar produtos químicos em seringa de vidro / pipeta Pasteur |
Referências
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , Geneva. (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes....
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Reimpressões e permissões
