Summary
Cette méthode décrit l’utilisation d’une nouvelle méthodologie à haut débit, basée sur des réactions chimiques de gouttelettes, pour l’optimisation rapide et économique des produits radiopharmaceutiques à l’aide de quantités nanomoles de réactifs.
Abstract
Les radiosynthétiseurs automatisés actuels sont conçus pour produire de grands lots cliniques de produits radiopharmaceutiques. Ils ne sont pas bien adaptés à l’optimisation de la réaction ou au développement de nouveaux produits radiopharmaceutiques, car chaque point de données implique une consommation importante de réactifs et la contamination de l’appareil nécessite du temps pour la désintégration radioactive avant la prochaine utilisation. Pour remédier à ces limitations, une plate-forme permettant d’effectuer des réseaux de réactions miniatures à base de gouttelettes en parallèle, chacune confinée dans un piège de tension superficielle sur une « puce » de silicium recouverte de polytétrafluoroéthylène à motifs, a été développée. Ces puces permettent des études rapides et pratiques des paramètres de réaction, y compris les concentrations de réactifs, le solvant de réaction, la température et le temps de réaction. Cette plate-forme permet de compléter des centaines de réactions en quelques jours avec une consommation minimale de réactifs, au lieu de prendre des mois à l’aide d’un radiosynthétiseur conventionnel.
Introduction
Les produits radiopharmaceutiques de tomographie par émission de positons (TEP) sont largement utilisés comme outils de recherche pour surveiller des processus biochimiques in vivo spécifiques et étudier des maladies, ainsi que pour le développement de nouveaux médicaments et thérapies. De plus, la TEP est un outil essentiel pour diagnostiquer ou stadification de la maladie et surveiller la réponse d’un patient au traitement1,2,3. En raison de la courte demi-vie des radio-isotopes TEP (p. ex. 110 min pour les produits radiopharmaceutiques marqués au fluor 18) et des dangers liés aux rayonnements, ces composés sont préparés à l’aide de systèmes automatisés spécialisés fonctionnant derrière le blindage contre les rayonnements et doivent être préparés juste avant utilisation.
Les systèmes actuels utilisés pour synthétiser des produits radiopharmaceutiques sont conçus pour produire de grands lots qui sont divisés en plusieurs doses individuelles pour partager le coût de production. Bien que les systèmes actuels conviennent à la production de radiotraceurs largement utilisés comme[18F]FDG (parce que plusieurs balayages de patients et expériences de recherche peuvent être programmés en une seule journée), ces systèmes peuvent être gaspilleurs pour la production de nouveaux radiotraceurs au cours du développement précoce, ou de radiotraceurs moins couramment utilisés. Les volumes utilisés par les systèmes conventionnels se situent généralement entre 1 et 5 mL, et les réactions nécessitent des quantités de précurseurs de l’ordre de 1 à 10 mg. De plus, l’utilisation de radiosynthétiseurs conventionnels est généralement lourde lors des études d’optimisation puisque l’appareil est contaminé après utilisation et que l’utilisateur doit attendre que la radioactivité se désintègre avant d’effectuer l’expérience suivante. Outre le coût de l’équipement, le coût du radio-isotope et des réactifs peut donc devenir très important pour les études nécessitant la production de plusieurs lots. Cela peut se produire, par exemple, lors de l’optimisation des protocoles de synthèse pour les nouveaux radiotraceurs afin d’obtenir un rendement et une fiabilité suffisants pour les études d’imagerie in vivo initiales.
Les technologies microfluidiques ont été de plus en plus utilisées en radiochimie pour capitaliser sur plusieurs avantages par rapport aux systèmes conventionnels4,5,6. Les plates-formes microfluidiques, y compris celles basées sur des volumes de réaction de 1 à 10μL 7,8,9,ont montré une réduction significative des volumes de réactifs et de la consommation de précurseurs coûteux, ainsi que des temps de réaction courts. Ces réductions conduisent à des coûts plus faibles, à des étapes de chauffage et d’évaporation plus rapides, à une purification en aval plus courte et plus simple, à un processus chimique global « plus vert »10,et à une activité molaire plus élevée des radiotraceurs produits11. Ces améliorations rendent plus pratique la production d’études d’optimisation plus approfondies en réduisant le coût des réactifs de chaque synthèse. D’autres avantages peuvent être obtenus en effectuant plusieurs expériences à partir d’un seul lot de radio-isotopes en une seule journée. Par exemple, les radiosynthétiseurs de chimie d’écoulement microfluidique fonctionnant en « mode découverte » peuvent effectuer séquentiellement des dizaines de réactions, chacune utilisant seulement 10s de volume de réaction μL12.
Inspiré par ces avantages, une puce de réseau de gouttelettes multi-réactions dans laquelle les réactions de microvolume sont confinées à un réseau de pièges de tension superficielle sur une surface de silicium, créée à l’aide d’un revêtement en téflon à motifs, a été développée. Ces puces permettent d’effectuer simultanément plusieurs réactions à l’échelle de 1 à 20 μL, ouvrant la possibilité d’explorer 10s de différentes conditions de réaction par jour, chacune avec plusieurs répétitions. Dans cet article, l’utilité de cette nouvelle approche à haut débit pour effectuer des optimisations de radiochimie rapides et à faible coût est démontrée. L’utilisation de puces de gouttelettes multi-réactions permet une exploration pratique de l’impact des concentrations de réactifs et du solvant de réaction, et l’utilisation de plusieurs puces pourrait permettre l’étude de la température et du temps de réaction, tout en consommant de très faibles quantités de précurseurs.
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Protocol
ATTENTION : Ce protocole implique la manipulation de matières radioactives. Les expériences ne devraient pas être entreprises sans la formation et l’équipement de protection individuelle nécessaires et sans l’approbation du bureau de radioprotection de votre organisation. Les expériences doivent être effectuées derrière un blindage contre les rayonnements, de préférence dans une cellule chaude ventilée
1. Fabrication de puces multi-réactions
REMARQUE : Les lots de puces de microgouttelettes multi-réactions sont fabriqués à partir de plaquettes de silicium de 4 po à l’aide de techniques de photolithographie standard, comme décrit précédemment10 (Figure 1). Cette procédure produira 7 puces chacune avec 4 x 4 matrices de sites de réaction.
- Placez la plaquette de silicium sur le mandrin spin-coater, en vous assurant qu’il est centré. Déposer 3 mL de solution de polytétrafluoroéthylène au centre de la plaquette avec une pipette de transfert et recouvrir la plaquette à 1000 tr/min pendant 30 s (rampe de 500 tr/min).
- Pour solidifier le revêtement, placez la plaquette sur une plaque chauffante à 160 °C pendant 10 min, puis transférez-la sur une plaque chauffante à 245 °C pendant 10 min.
- Recuit le revêtement dans un four à haute température à 340 °C pendant 3,5 h sous atmosphère d’azote, suivi d’un refroidissement à 70 °C à une rampe de 10 °C/min.
- Placez la plaquette de silicium sur le mandrin spin-coater, en vous assurant qu’il est centré. Versez 2 mL de photorésine positive au centre de la plaquette à l’aide d’une pipette de transfert, puis effectuez un revêtement à 3000 tr/ min pendant 30 s (rampe de 1000 tr / min).
- Solidifier la photorésine en effectuant une cuisson douce de la plaquette sur une plaque chauffante à 115 °C pendant 3 min.
- Installez la plaquette et le photomasque dans un aligneur de masque et effectuez une exposition de 14 s à 12 mW/cm2 intensité de lampe et une longueur d’onde de 356 nm en mode contact dur. Cette étape utilise un masque de transparence contenant le motif de polytétrafluoroéthylène final négatif, c’est-à-dire un motif de 4 » de diamètre de 4 copies de la puce à 16 réactions, avec des sites de réaction transparents et toutes les autres régions de couleur opaque.
- Submerger la plaquette à l’aide de 20 mL de solution de révélateur de photorésine dans un récipient en verre pendant 3 min avec une légère agitation pour développer le motif exposé.
- Rincer la solution en développement en plongeant la plaquette dans un récipient en verre avec 20 mL d’eau DI pendant 3 min avec une légère agitation. Séchez la plaquette avec un pistolet à azote.
- Retirer les régions exposées de polytétrafluoroéthylène par gravure ionique réactive (RIE) avec du plasma d’oxygène dans les conditions suivantes : exposition de 30 s, pression de 100 mTorr, puissance de 200 W et débit d’oxygène de 50 sccm.
- Dés la plaquette en puces individuelles (7 au total par tranche) à l’aide d’un coupe-plaquette en silicium.
- Plonger chaque puce dans de l’acétone pendant 1 min pour enlever la photorésine, puis de l’isopropanol pendant 1 min. Enfin, séchez chaque puce avec un pistolet à azote.
- Placez les copeaux secs dans un récipient en verre et couvrez de papier d’aluminium pour les stocker jusqu’à utilisation.
2. Planification de l’étude d’optimisation
REMARQUE : Dans ce protocole, la synthèse du produit radiopharmaceutique[18F]fallypride est utilisée comme exemple pour illustrer l’optimisation à haut débit (Figure 2). Avec une seule puce, 16 réactions simultanées peuvent être effectuées, par exemple, avec une concentration de précurseur variée (8 concentrations différentes, n = 2 répliques chacune). Les conditions sont cartographiées aux sites de réaction à la figure 3A. Des ajustements peuvent être apportés à ce protocole pour optimiser d’autres paramètres de réaction (par exemple, solvant de réaction, volume de réaction, quantité de TBAHCO3,etc.) ou d’autres produits radiopharmaceutiques.
- Sélectionnez le ou les paramètres de réaction à modifier, les valeurs spécifiques à utiliser et le nombre de répétitions.
- Calculez le nombre de puces nécessaires pour effectuer l’expérience.
- Pour chaque puce, préparer une carte des conditions de réaction qui seront utilisées à chaque site de réaction pour aider à la préparation des réactifs et à l’exécution des réactions des gouttelettes.
3. Préparation de réactifs et de matériaux pour optimiser la radiosynthèse de [18F]fallypride
NOTA : La radiosynthèse à base de gouttelettes de[18F]fallypride (figure 2) commence par l’ajout de[18F]fluorure et de catalyseur de transfert de phase (TBAHCO3)au site de réaction, suivi d’un chauffage pour évaporer l’eau et laisser un résidu séché. Ensuite, une gouttelette de précurseur (tosyl-fallypride) dans le solvant de réaction (alcool théxylique et acétonitrile) est ajoutée et chauffée pour effectuer la réaction de radiofluorination. Enfin, le produit brut est collecté à partir de la puce pour analyse. Les procédures de préparation et de synthèse des réactifs doivent être adaptées si vous effectuez l’optimisation d’un traceur différent.
- Préparer une solution mère du solvant réactionnel, composé d’alcool théxylique et d’acétonitrile dans un mélange 1:1 en volume. Assurez-vous que le volume est suffisant pour créer la série de dilution prévue. Dans cet exemple d’optimisation, ~30 μL est suffisant.
- Préparer une solution mère de précurseur de 30 μL (tosyl-fallypride) dans le solvant réactionnel avec la concentration maximale à explorer (77 mM). Assurez-vous que le volume est suffisant pour effectuer l’expérience planifiée. Dans cet exemple d’optimisation, ~30 μL est suffisant.
- A partir de la solution mère précurseur et du solvant réactionnel, effectuer 2x dilutions en série pour préparer les différentes concentrations de la solution précurseur. Assurez-vous que le volume de chaque dilution est suffisant pour effectuer le nombre souhaité de répétitions pour chaque condition. Dans cet exemple d’optimisation, ~15 μL de chaque concentration est suffisant.
- Préparer des tubes à microcentrifugation pour recueillir chaque produit de réaction brut à l’aide d’un marqueur permanent pour étiqueter chaque tube avec un numéro unique. S’assurer que le nombre total de tubes à microcentrifugation correspond au nombre de conditions multiplié par le nombre de répétitions (8 x 2 = 16).
- Préparer un stock de solution de collecte (10 mL) comprenant du méthanol 9:1 :EAU DI (v/v). Aliquote de 50 μL dans chacun des 16 tubes de microcentrifugation marqués supplémentaires (un par site de réaction sur la puce).
- Préparer une solution mère de[18F]fluorure dans un tube de microcentrifugation de 500 μL en mélangeant[18F]fluorure/[18O]H2O(~260 MBq [7 mCi]) avec une solution de TBAHCO3 de 75 mM (56 μL) et en diluant avec de l’eau DI jusqu’à 140 μL. 8 μL de cette solution seront chargés sur chaque site de réaction (contenant ~15 MBq [0,40 mCi] d’activité et 240 nmol de TBAHCO3).
4. Synthèse parallèle de [18F]fallypride avec différentes concentrations de précurseurs
REMARQUE: La puce est actionnée au sommet d’une plate-forme chauffante (construite comme décrit précédemment13)composée d’un appareil de chauffage en céramique de 25 mm x 25 mm, contrôlé à l’aide d’un régulateur de température on-off utilisant le signal interne du thermocouple pour la rétroaction. Les températures de surface du chauffage ont été étalonnées à l’aide de l’imagerie thermique. Si une telle plate-forme n’est pas disponible, une paire de plaques chauffantes peut être utilisée (une à 105 °C et une à 110 °C).
- Charge[18F]solution mère de fluorure (avec catalyseur de transfert de phase).
- À l’aide d’une micropipette, chargez une gouttelette de 8 μL de[18F]fluorure en solution mère sur le premier point de réaction d’une puce multiréaction. Mesurer l’activité de la puce en la plaçant dans un calibrateur de dose et enregistrer l’heure à laquelle la mesure est effectuée.
- Retirez la puce de l’étalonneur de dose, puis chargez une gouttelette de 8 μL de[18F]fluorure en solution mère sur le deuxième point de réaction. Mesurez l’activité sur la puce en la plaçant à nouveau dans l’étalonneur de dose et enregistrez l’heure à laquelle la mesure est effectuée.
- Répétez l’opération pour tous les autres sites de réaction sur la puce.
- Calculer l’activité chargée par point de réaction en prenant la mesure d’activité après le chargement du radio-isotope et en soustrayant la mesure précédente (corrigée de la désintégration) avant le chargement de ce site.
- Alignez la puce multi-réaction sur le chauffage.
- Ajoutez une fine couche de pâte thermique sur le dessus du chauffage en céramique.
- Placez soigneusement la puce sur le dessus de l’appareil de chauffage à l’aide d’une pince à épiler pour éviter le déversement des gouttelettes, en alignant le coin de référence de la puce avec le coin de référence de l’appareil de chauffage (comme le montre la figure 3B). La puce surplombera l’appareil de chauffage d’une petite quantité.
- Sécher le fluorure[18F] et le catalyseur à transfert de phase.
- Chauffer la puce pendant 1 min en fixant le chauffage à 105 °C dans le programme de contrôle pour évaporer les gouttelettes à sec en laissant un résidu séché de[18F]fluorure et de TBHACO3. Après 1 min, refroidissez la puce en éteignant le chauffage et en allumant le ventilateur de refroidissement avec le programme de contrôle.
- Ajouter la solution précurseur.
- À l’aide d’une micropipette, ajouter une solution de 6 μL de précurseur de fallypride sur le résidu séché sur le premier site de réaction.
- Répétez l’opération pour tous les autres sites de réaction sur la puce. Utilisez le plan d’optimisation pour déterminer quelle concentration de la série de dilution est utilisée pour chaque site de réaction.
- Effectuer une réaction de fluoration.
- Chauffer chaque puce à 110 °C pendant 7 min à l’aide du programme de contrôle pour effectuer une réaction de radiofluoration. Ensuite, refroidissez la puce en éteignant le chauffage et en allumant le ventilateur de refroidissement avec le programme de contrôle.
- Recueillir les produits bruts des sites de réaction.
- Recueillir le produit brut au premier site de réaction en ajoutant 10 μL de solution de collecte du tube de microcentrifugation désigné au moyen d’une micropipette. Après avoir attendu 5 s, utilisez la micropipette (avec la même pointe installée) pour aspirer le produit brut dilué et le transférer dans son tube de microcentrifugation de collecte étiqueté correspondant.
- Répétez ce processus un total de 4 fois en utilisant la même pointe de pipette pour toutes les opérations.
- Répétez le processus de collecte pour tous les autres sites de réaction sur la puce.
5. Analyse de synthèse pour déterminer la performance de la réaction et les conditions optimales
- Déterminer « l’efficacité de la collecte » pour la première réaction sur la puce.
- Placer le tube de microcentrifugation avec le produit brut collecté du premier point de réaction dans l’étalonneur de dose pour mesurer l’activité. Enregistrez la mesure et l’heure de la mesure.
- Calculer l’efficacité de la collecte en divisant l’activité du produit brut collecté par l’activité de départ mesurée pour le même site de réaction (correction de la désintégration des valeurs d’activité au même point de temps).
- Répétez l’opération pour tous les autres sites de réaction sur la puce.
- Analyser la composition (efficacité de la fluoration) de chaque produit brut collecté.
REMARQUE: Pour rendre pratique l’analyse de tous les échantillons dans un court laps de temps, l’efficacité de la fluoration est analysée à l’aide d’une approche de chromatographie sur couche radio-mince (radio-TLC) à haut débit décrite précédemment14. Cette technique permet de traiter jusqu’à huit échantillons en parallèle en les repérant puis côte à côte (pas de 5 mm, 0,5 μL par spot) sur une seule plaque TLC, puis en se développant ensemble, et en effectuant une lecture ensemble à l’aide de l’imagerie Cerenkov14,15. Pour l’exemple d’optimisation avec 16 réactions parallèles, 2 plaques TLC sont nécessaires. Une autre option consiste à utiliser la chromatographie liquide radio-haute performance (radio-HPLC) pour l’analyse, bien que le temps de séparation, de nettoyage et d’équilibrage puisse limiter le nombre d’échantillons pouvant être analysés.- Pour chaque plaque TLC (50 mm x 60 mm), avec un crayon, tracez une ligne à 15 mm d’un bord de 50 mm (en bas) et une autre ligne à 50 mm du même bord. La première ligne est la ligne d’origine ; le second est la ligne de front des solvants. Tracer 8 petits « X » le long de la ligne d’origine à un espacement de 5 mm pour définir la position de repérage de l’échantillon pour chacune des 8 « voies ».
- À l’aide d’une micropipette, transférer 0,5 μL du premier produit brut sur la plaque TLC au « X » de la première voie. Répéter pour d’autres produits bruts (jusqu’à 8 par plaque de CCM). Attendez que les taches de produit brut sèchent sur la plaque TLC.
- Pour chaque plaque TLC, développer en utilisant une phase mobile de 60% MeCN dans 25 mMNH4HCO2 avec 1% TEA (v/v) jusqu’à ce que le front du solvant atteigne la ligne de front du solvant. Attendez que le solvant sur la plaque TLC sèche, puis couvrez-le d’une lame de microscope en verre (76,2 mm x 50,8 mm, 1 mm d’épaisseur).
- Obtenir une image de radioactivité de chaque plaque TLC en plaçant la plaque dans un système d’imagerie Cerenkov pour une exposition de 5 minutes. Effectuez des corrections d’image standard (soustraction de courant d’obscurité, correction de champ plat, filtrage médian et soustraction d’arrière-plan).
- Utilisez l’analyse de la région d’intérêt (ROI) pour la première voie de la première plaque TLC. Dessinez des régions autour de chaque bande visibles dans la voie. Le logiciel calculera la fraction de l’intensité intégrée de chaque région (bande) par rapport à l’intensité intégrée totale de toutes les régions (bandes).
- Avec cette phase mobile, les bandes suivantes sont attendues aux facteurs de rétention indiqués : Rf = 0,0 : Fluorure n’ayant pas réagi[18F]; Rf = 0,9 : [18F]fallypride; Rf = 0,94 : Produit secondaire. Déterminer l’efficacité de la fluoration en tant que fraction d’activité dans la bande[18F]fallypride.
- Répétez cette analyse pour toutes les autres voies sur toutes les plaques TLC.
REMARQUE: Si une chambre d’imagerie Cerenkov n’est pas disponible, un petit système d’imagerie optique in vivo animal (préclinique) peut être utilisé pour imager les plaques TLC. Alternativement, un scanner TLC en 2 dimensions peut être utilisé. Alternativement, si seul un scanner TLC en 1 dimension est disponible, les plaques TLC peuvent être analysées en coupant en bandes avec des ciseaux (1 par voie) et en balayant chaque bande individuellement.
- Déterminer le rendement radiochimique brut (RCY brut) pour chaque site de réaction.
- Déterminer le RCY brut pour le premier produit brut en multipliant l’efficacité de la collecte par l’efficacité de fluoration.
- Répétez l’opération pour tous les autres sites de réaction.
- Analyser les résultats
- Valeurs agrégées pour toutes les expériences répétées dans un écart moyen et un écart type.
- Tracer l’efficacité de la collecte, l’efficacité de la fluoration et le RCY brut en fonction du paramètre qui a varié (concentration du précurseur dans cet exemple).
- Sélectionnez les conditions optimales en fonction des critères souhaités. Typiquement, il s’agit du RCY brut maximal. En outre, le point est souvent choisi dans une région où la pente du graphique est relativement plate, ce qui indique qu’il est insensible aux petites modifications du paramètre, fournissant un protocole plus robuste.
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Representative Results
Une expérience représentative a été réalisée pour illustrer cette méthode. À l’aide de 16 réactions, des études d’optimisation du produit radiopharmaceutique[18F]fallypride ont été réalisées en faisant varier la concentration de précurseurs (77, 39, 19, 9,6, 4,8, 2,4, 1,2 et 0,6 mM) dans l’alcool thexylique : MeCN (1:1, v/v) comme solvant de réaction. Les réactions ont été réalisées à 110 °C pendant 7 min. L’efficacité de la collecte, la composition de l’échantillon (c.-à-d. les proportions de[18F]fallypride produit, de fluorure non réagi[18F] et de produit secondaire) sont présentées sous forme de tableau dans le tableau 1 et sont résumées graphiquement à la figure 4.
L’étude a montré que l’efficacité de la fluoration (proportion de[18F]fallypride) augmente avec l’augmentation de la concentration de précurseurs, et que le reste du fluorure[18F] n’a pas réagi variait inversement (figure 4A). Il y avait une petite quantité d’un produit secondaire radioactif à de faibles concentrations de précurseurs, mais la proportion a diminué à près de zéro aux concentrations plus élevées de précurseurs (figure 4A). L’efficacité de la collecte était presque quantitative pour la plupart des conditions, bien qu’elle ait légèrement diminué à de faibles concentrations de précurseurs.
À partir de ces résultats, l’ECR le plus élevé peut être atteint avec environ 230 nmol de précurseur (c.-à-d. une concentration de 39 mM dans une gouttelette de 6 μL). Dans ces conditions, l’efficacité de fluoration était de 96,0 ± 0,5 % (n = 2) et le RCY brut était de 87,0 ± 2,7 (n = 2), et aucune formation de produit secondaire radioactif n’a été observée. Bien que l’utilisation d’un précurseur de 77 mM ait donné des résultats similaires, en général, il est souhaitable d’utiliser une quantité plus faible de précurseurs pour réduire les coûts et simplifier les étapes de purification en aval.
Figure 1: Fabrication de puces de microgouttelettes multi-réactions par photolithographie. (A) Photographie de puces de microgouttelettes multi-réactions avec 4 x 4 réseaux de sites de réaction. La puce est constituée de silicium revêtu de polytétrafluoroéthylène avec des régions circulaires de polytétrafluoroéthylène gravées pour créer les sites de réaction hydrophiles. (B) Schéma de la procédure de fabrication. Une plaquette de silicium est recouverte de solution de téflon et cuite au four pour solidifier le revêtement. Ensuite, la photorésine est recouverte de spin et modelée via la photolithographie pour produire un masque de gravure. La photorésine est développée avec une solution de développement de photorésine. Le téflon exposé est ensuite éliminé par gravure sèche avec du plasma d’oxygène. La plaquette est dés en copeaux individuels et la photorésine est dépouillée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Procédure pour les réactions parallèles. Procédé expérimental pour réaliser 16 synthèses parallèles du produit radiopharmaceutique[18F]fallypride sur une puce multi-réaction. Dans cet exemple, la concentration du précurseur est modifiée pour chaque réaction. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Carte des conditions aux sites de réaction. (A)Conception expérimentale pour explorer l’influence de la concentration des précurseurs sur la radiofluorination du fallypride de tosyle à l’aide d’une seule puce à 16 réactions (vue de dessus). Huit concentrations différentes ont été explorées, chacune avec n = 2 répétitions. Les autres conditions de réaction ont été maintenues constantes (température : 110 °C ; durée :7 min ; solvant : alcool théxylique : MeCN ; quantité de TBAHCO3 : 240 nmol). Chaque réaction a été exécutée avec ~14 MBq d’activité. (B) Photographie d’une puce à 16 réactions installée sur la plate-forme de chauffage pendant l’expérience. Les lignes rouges représentent le coin de référence de la puce utilisée pour l’alignement avec le coin de référence de l’appareil de chauffage. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Influence de la concentration du précurseur sur la synthèse des microgouttelettes de[18F]fallypride. (A) Proportion d’espèces radioactives présentes dans le produit de réaction brut recueilli, c’est-à-dire [18F]fallypride, produit secondaire ou fluorure non réagi[18F]. (B) Performance de synthèse. L’efficacité de la collecte, l’efficacité de la fluoration et le RCY brut sont tracés en fonction de la concentration des précurseurs. Dans les deux graphiques, les points de données représentent la moyenne de n=2 répétitions et les barres d’erreur représentent l’écart type. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Concertation précurseur (mM) | Efficacité de la collecte (%) | Efficacité de la fluoration (%) | RCY brut (%) | Fluorure [18F] n’ayant pas réagi (%) | Produit secondaire (%) |
| 77 | 91,8 ± 2,1 | 96,7 ± 2,0 | 88,8 ± 3,9 | 3.3 ± 2.0 | 0,0 ± 0,0 |
| 39 | 90,6 ± 2,4 | 96,0 ± 0,5 | 87,0 ± 2,7 | 4,0 ± 0,5 | 0,0 ± 0,0 |
| 19 | 91,1 ± 0,5 | 81,1 ± 0,3 | 73,9 ± 0,7 | 8.4 ± 1.2 | 10,5 ± 2,0 |
| 9.6 | 90,9 ± 0,6 | 62,7 ± 0,9 | 57,0 ± 0,5 | 23.3 ± 2.1 | 14,0 ± 0,9 |
| 4.8 | 88,4 ± 0,8 | 37,0 ± 1,5 | 32,8 ± 1,6 | 47,3 ± 0,8 | 15,7 ± 1,0 |
| 2.4 | 87,6 ± 2,0 | 21,0 ± 2,1 | 18.4 ± 2.2 | 67,4 ± 2,1 | 11,6 ± 1,0 |
| 1.2 | 82,3 ± 1,6 | 12,7 ± 0,3 | 10,4 ± 0,1 | 72,8 ± 0,7 | 14,5 ± 1,0 |
| 0.6 | 81.2 ± 3.7 | 6,3 ± 0,8 | 5,1 ± 0,5 | 84,3 ± 0,2 | 9,4 ± 1,0 |
Tableau 1 : Données obtenues à partir de l’étude de la concentration de précurseurs. Toutes les valeurs sont des moyennes ± des écarts types calculés à partir de n=2 répétitions.
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Discussion
En raison des limites des systèmes de radiochimie conventionnels qui ne permettent qu’une ou un petit nombre de réactions par jour et consomment une quantité importante de réactifs par point de données, seule une infime partie de l’espace global des paramètres de réaction peut être explorée dans la pratique, et de nombreuses fois les résultats sont rapportés sans répétition (n = 1). Par rapport aux systèmes conventionnels, cette plate-forme de radiosynthèse de gouttelettes à réactions multiples permet d’effectuer des études plus complètes et plus rigoureuses des conditions de radiosynthèse tout en consommant très peu de temps et de quantité de précurseurs, ce qui permet potentiellement de nouvelles informations sur les paramètres qui ont un impact sur le rendement du produit et la formation du produit secondaire. L’information peut être utilisée pour choisir les conditions qui se traduisent par le rendement de produit le plus élevé ou la synthèse la plus robuste. La faible consommation de précurseurs peut être particulièrement utile dans la mise au point précoce de nouveaux radiotraceurs lorsque seule une petite quantité de précurseurs peut être disponible ou lorsque le précurseur est coûteux. Bien que la nature ouverte des puces contribue à un temps de synthèse rapide et à une facilité d’accès via la pipette, elle peut entraîner des pertes substantielles de molécules volatiles et peut ne pas être pratique lors de l’optimisation de la synthèse de produits radiopharmaceutiques contenant des précurseurs volatils, des intermédiaires ou des produits.
En raison du risque d’exposition aux rayonnements, il convient de rappeler que ces expériences ne devraient être effectuées qu’avec une formation et des approbations appropriées et devraient être menées derrière un blindage contre les rayonnements, de préférence dans une cellule chaude ventilée. En raison de la courte demi-vie des radio-isotopes, il est important d’effectuer les expériences rapidement et efficacement. Le pipetage des réactifs à la puce et la collecte des produits de la puce doivent être pratiqués dans des conditions non radioactives pour se familiariser avec l’accès et la visibilité réduits dans une cellule chaude. De même, l’installation et le retrait de la puce et la mesure de la puce avec l’étalonneur de dose doivent également être pratiqués. De plus, il est essentiel d’être organisé, avec une carte d’expérience détaillée (c.-à-d. des conditions de réaction spécifiques à chaque site sur la puce). Il est également utile de préparer à l’avance un tableau des résultats à remplir au fur et à mesure des mesures. Pour assurer la reproductibilité, en particulier avec la possibilité d’erreur humaine, plusieurs répétitions de chaque ensemble de conditions doivent être effectuées. Il est important d’être particulièrement prudent pendant l’étape du prélèvement des échantillons de brut de la puce afin d’éviter de déverser du liquide à l’extérieur du site de réaction et de causer une contamination croisée avec les sites de réaction adjacents. Si des erreurs sont remarquées, il est important de signaler ces sites de réaction afin que les données puissent être exclues de l’analyse éventuelle.
Dans cet exemple d’étude, la quantité de précurseur consommée pour 16 points de données était de 1,1 mg (~70 μg chacun), comparativement à 4 mg par point de données à l’aide d’un radiosynthétiseur conventionnel. En outre, chacun des 16 réactions a été accompli en 25 minutes toutes dans une seule expérience. En comparaison, la synthèse du brut[18F]fallypride sur un radiosynthétiseur classique nécessite ~15-20 min par réaction16,17.
Cette expérience représentative a démontré l’utilité d’une puce de microgouttelettes multi-réactions avec 16 réactions pour optimiser les conditions de radiosynthèse du produit radiopharmaceutique[18F]fallypride en explorant 8 concentrations de précurseurs différentes (n = 2 répétitions pour chaque condition) d’une manière rapide et économique. D’autres variables qui peuvent être facilement optimisées à l’aide d’une puce multi-réaction comprennent la quantité de radioactivité, le type de catalyseur de transfert de phase, la quantité de catalyseur de transfert de phase, les conditions d’évaporation / séchage (par exemple, le nombre d’étapes de séchage azéotropes), le solvant de réaction, etc. En utilisant plusieurs puces multi-réactions, il est également possible d’explorer l’influence de la température et du temps de réaction de réaction, en plus de conditions telles que la température et le temps d’évaporation / séchage. De telles études devraient être effectuées séquentiellement à l’aide du chauffage unique ou pourraient être parallélisées en faisant fonctionner plusieurs appareils de chauffage en même temps.
La méthode sous-jacente de synthèse des gouttelettes s’est avérée compatible avec une large gamme de 18produits radiopharmaceutiques marqués F, tels que[18F]fallypride10, [18F]FET18, [18F]FDOPA19, [18F] FBB20 et elle peut être utilisée pour l’optimisation de la majorité des 18autres composés marqués F et composés marqués avec d’autres isotopes. De plus, les réactions optimisées à base de gouttelettes qui en résultent exploitent intrinsèquement les avantages de la radiochimie des microvolumes, notamment la réduction de la consommation de précurseurs, des temps de traitement plus rapides et une instrumentation compacte, et peuvent offrir ces mêmes avantages pour la production de routine de gros lots. Les lots plus volumineux nécessitent simplement une augmentation de la quantité d’activité initialement chargée au début de la réaction. Pour préparer un traceur adapté à une utilisation dans des essais in vitro ou in vivo, le produit brut doit être purifié (par exemple, à l’aide de CLHP à l’échelle analytique) et formulé (par exemple par évaporation ou échange de solvant en phase solide21)Alternativement, il peut être possible d’adapter les conditions optimales de l’échelle des gouttelettes à un radiosynthétiseur conventionnel à base de flacons. L’enquête sur cette possibilité est en cours.
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Disclosures
Les régents de l’Université de Californie ont concédé sous licence à Sofie, Inc. une technologie qui a été inventée par le Dr van Dam, et ont pris des participations dans Sofie, Inc. dans le cadre de la transaction de licence. Le Dr van Dam est l’un des fondateurs et consultants de Sofie, Inc. Les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts. Ces travaux ont été soutenus en partie par le National Cancer Institute (R33 240201).
Acknowledgments
Nous remercions l’installation biomédicale de cyclotron de l’UCLA et les Drs Roger Slavik et Giuseppe Carlucci d’avoir généreusement fourni du fluorure[18F] pour ces études et le NanoLab de l’UCLA pour son soutien avec de l’équipement pour la fabrication de puces.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-dimethyl-2-butanol (thexyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 594-60-5 | 98% |
| Acetone | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Ammonium formate (NH4HCO2) | Sigma-Aldrich | 540-69-2 | 97% |
| Anhydrous acetonitrile (MeCN) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | 99.80% |
| Ceramic heater | Watlow | Utramic CER-1-01-0093 | 25 mm x 25 mm |
| Cerenkov imaging chamber | Custom built | Other instruments can be used for TLC plate readout including: small animal in vivo optical imaging system, 2D radio-TLC scanner, 1D radio-TLC scanner | |
| DI water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| Disposable transfer pipets, 3 mL | Falcon | 13-680-50 | |
| Dose calibrator | Capintec, Inc. | CRC-25 PET | |
| Fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1560.0010.000 | Fallypride reference standard, >95% |
| [18F]fluoride in [18O]H2O | UCLA Ahmanson Biomedical Cyclotron Facility | Due to short half-life this must be obtained from local radiochemistry lab or commercial radiopharmacy | |
| Glass cover plates (76.2 mm x 50.8 mm x 1 mm thick) | C&A Scientific | 6101 | |
| Headway spin coater | Headway Research, Inc. | PWM50-PS-R790 Sipinner system | PWM50-control box, PS-motor, R790-bowl |
| High temperature oven | Carbolite | HTCR 6 28 | |
| Hot plate | Thermo Scientific | Super-Nuova HP133425 | |
| Isopropanol (IPA) | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Mask aligner | Karl Suss | MA/BA6 | |
| Methanol (MeOH) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | ≥99.9% |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 0030 123.301 | 500 µL, colorless, polypropylene |
| Micropipette (0.5-10 µL) | Labnet | BioPette P3940-10 | |
| Micropipette (100-1000 µL) | Labnet | BioPette P3940-1000 | |
| Micropipette (10-100 µL) | Labnet | BioPette P3940-100 | |
| Micropipette tips (0.1-10 µL) | USA Scientific Inc Tips | 11113810 | |
| Micropipette tips (2-200 µL) | BrandTech | 13-889-143 | |
| Micropipette tips (50-1000 µL) | BrandTech | 13-889-145 | |
| Photoresist developer solution | MicroChem | MEGAPOSIT MF-26A | |
| Positive photoresist | MicroChem | MEGAPOSIT 220-7.0 | |
| Reactive-ion etcher (RIE) | Oxford Instruments | Plasma Lab 80 Plus | |
| Silicon wafer cutter | Euro Tool | CSCB-431.00 | |
| Silicon wafer; 4" diameter | Silicon Valley Microelectronics Inc. | 0017227-048 | P type, boron doped, thickness 525 ± 25 µm |
| Teflon AF 2400 | Chemours | D14896765 | 1% solids |
| Tetrabutylammonium bicarbonate (TBAHCO3) | ABX Advanced Biochemical Compounds | 808 | Aqueous solution stabilized with ethanol, 0.075 M |
| Themal conducting paste | OMEGA | OT-201-2 | |
| TLC plates | Merck KGaA | 1.05554.0001 | Silica gel 60 F254, 50 mm x 60 mm, aluminum back |
| Tosyl-fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1550.004.000 | Fallypride precursor, >90% |
| Trimethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 75-50-3 | ≥ 99% |
| Tweezers | Cole-Parmer | UX-07387-08 | Stainless steel, fine tip |
References
- Matthews, P. M., Rabiner, E. A., Passchier, J., Gunn, R. N. Positron emission tomography molecular imaging for drug development. British Journal of Clinical Pharmacology. 73 (2), 175-186 (2012).
- Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (22), 9232-9258 (2014).
- Cherry, S. R., Sorenson, J. A., Phelps, M. E. Physics in Nuclear Medicine. , Elsevier Saunders. Philadelphia, PA, USA. (2012).
- Knapp, K. -A., Nickels, M. L., Manning, H. C. The current role of microfluidics in radiofluorination chemistry. Molecular Imaging and Biology. 22 (3), 463-475 (2020).
- Rensch, C., et al. Microfluidics: A groundbreaking technology for PET tracer production. Molecules. 18 (7), 7930-7956 (2013).
- Pascali, G., Watts, P., Salvadori, P. A. Microfluidics in radiopharmaceutical chemistry. Nuclear Medicine and Biology. 40 (6), 776-787 (2013).
- Keng, P. Y., van Dam, R. M. Digital microfluidics: A new paradigm for radiochemistry. Molecular Imaging. 14, 579-594 (2015).
- Wang, J., Chao, P. H., Janet, S., van Dam, R. M. Performing multi-step chemical reactions in microliter-sized droplets by leveraging a simple passive transport mechanism. Lab on a Chip. 17 (24), 4342-4355 (2017).
- Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M. Ultra-compact, automated microdroplet radiosynthesizer. Lab on a Chip. (19), 2415-2424 (2019).
- Rios, A., Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M. A novel multi-reaction microdroplet platform for rapid radiochemistry optimization. RSC Advances. 9 (35), 20370-20374 (2019).
- Sergeev, M., et al. Performing radiosynthesis in microvolumes to maximize molar activity of tracers for positron emission tomography. Communications Chemistry. 1 (1), 10 (2018).
- Pascali, G., et al. Optimization of nucleophilic 18F radiofluorinations using a microfluidic reaction approach. Nature Protocols. 9 (9), 2017-2029 (2014).
- Lisova, K., et al. Microscale radiosynthesis, preclinical imaging and dosimetry study of [18F]AMBF3-TATE: A potential PET tracer for clinical imaging of somatostatin receptors. Nuclear Medicine and Biology. 61, 36-44 (2018).
- Wang, J., et al. High-throughput radio-TLC analysis. Nuclear Medicine and Biology. 82-83, 41-48 (2020).
- Dooraghi, A. A., et al. Optimization of microfluidic PET tracer synthesis with Cerenkov imaging. Analyst. 138 (19), 5654-5664 (2013).
- Collins, J., et al. Production of diverse PET probes with limited resources: 24 18F-labeled compounds prepared with a single radiosynthesizer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 11309-11314 (2017).
- Lazari, M., et al. Fully automated production of diverse 18F-labeled PET tracers on the ELIXYS multireactor radiosynthesizer without hardware modification. Journal of Nuclear Medicine Technology. 42 (3), 203-210 (2014).
- Lisova, K., et al. Rapid, efficient, and economical synthesis of PET tracers in a droplet microreactor: application to O-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tyrosine ([18F]FET). EJNMMI Radiopharmacy and Chemistry. 5 (1), 1 (2019).
- Wang, J., Holloway, T., Lisova, K., van Dam, R. M. Green and efficient synthesis of the radiopharmaceutical [18F]FDOPA using a microdroplet reactor. Reaction Chemistry & Engineering. 5 (2), 320-329 (2020).
- Lisova, K., Wang, J., Rios, A., van Dam, R. M. Adaptation and optimization of [F-18] Florbetaben ([F-18] FBB) radiosynthesis to a microdroplet reactor. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 62, 353-354 (2019).
- Wang, J., Chao, P. H., Slavik, R., van Dam, R. M. Multi-GBq production of the radiotracer [18F]fallypride in a droplet microreactor. RSC Advances. 10 (13), 7828-7838 (2020).
