Summary
Dette arbejde præsenterer en protokol til at udforske anti-fedme effekt af to planter, der anvendes sammen, for en 5-ugers varighed. Der var en kombineret administration af ekstraktet og fedtfattig kost (HFD) hos overvægtige mus. Metoden kan fremme fordelene ved planter i behandlingen af fedme.
Abstract
Flere undersøgelser har vist, at planternes fytokemiske indhold er potentielle anti-fedme-midler. I denne undersøgelse undersøger vi effekten af at bruge en kombination af tørre knapper fra Syzygium aromaticum og frø fra Cuminum cyminum (CC) på C57BL6/J mus induceret med fedme via fedtfattig kost (HFD). Formålet med denne undersøgelse er at påvise, at den metode, der foreslås i undersøgelsen reduceret fedme betydeligt efter flere ugers eksperimenter. Ekstraktet fra begge planter blev ekstraheret ved hjælp af ultralyd for at forbedre udvindingen af fytokemikalier. Optimale ekstraktionsforhold blev opnået med ethanol som følger: 50:50 v / v vand med en ultralydseffekt på 300 W og ultralydsindikeringstid på 30 minutter. Samtidig administration af CC-ekstraktet i HFD i 5 uger førte til regulering af lipidprofiler (kolesterol og triglycerider), reduktion af fødeindtagelse, vægtforøgelse, fedtvæv og levervægt. Resultater opnået ved denne fede model viser, at CC ekstrakt kan forebygge fedme. Sammenlignet med den traditionelle 16 ugers metode (8 uger til at få fedt, og 8 uger til at tabe sig), lignende resultater blev opnået i denne undersøgelse fede model i mindre tid af eksperimenter.
Introduction
Overskydende kropsfedt ophobning er karakteristisk for fedme. Ubalancen mellem energiindtag og forbrug fører til opbevaring af overskydende energi i adipocytter, som er relateret til metaboliske risikofaktorer for hyperglykæmi og insulinresistens i type 2-diabetes, hypertension, hypercholesterolmi og hjerte-kar-sygdom1,2.
Naturlige produkter med minimale bivirkninger og lave omkostninger har fået øget opmærksomhed, siden tidligere undersøgelser har rapporteret bioaktive fytokemikalier og potentielle anti-fedme-midler med mekanismer, der vender eller forsinker metabolisk syndrom og tilknyttede patologier8.
Flere medicinske planter er blevet undersøgt for at forebygge fedme og relaterede sygdomme. Blandt dem er Syzygium aromaticum blevet undersøgt for sit anti-fedmepotentiale i in vitro-behandling på 3T3-L1-celler og in vivo-behandling på mus fodret med en fedtrig kost11. Derudover blev der observeret signifikante anti-overvægtige virkninger i et multicenter åbent forsøg med Cuminum cyminum på ekstremt overvægtige forsøgspersoner12. I denne undersøgelse blev C57BL6/J mus brugt til at undersøge den eksperimentelle hurtige model til at evaluere et potentielt anti-fedme middel ved hjælp af en kombination af begge spiselige planter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af Dyreforsøgskomitéen i Escuela Nacional de Ciencias Biologicas (IPN; protokol nr.
1. Fremstilling af ekstrakt af kombinationen af nelliker og spidskommen
BEMÆRK: De spiselige planter, Syzygium aromaticum (fed) og Cuminum cyminum (spidskommen) blev købt fra Central de Abastos CDMX, Mexico.
- Grind 500 g frø fra planterne og udfør ultralydsassisteret ekstraktion. Sonikere dem (320 Watt; 24 kHz frekvens, 30 min) med ethanol:vand (60:40 v/v) ved et temperaturområde på 30 ± 4 °C.13
- Filtrer faste stoffer ved hjælp af Whatman nummer 2 filterpapir under vakuum og koncentrere ekstraktet med en roterende fordamper.
- Måle UV-vis spektret af ekstraktet af begge planter (CC).
2. Dyr
- Brug han-C57BL6/J-mus på seks uger (i alt 48, kropsvægt 24-29 g) til undersøgelsen.
- Dyrene anbringes i grupper på otte under standardlaboratorieforhold: temperatur (20-22 ± 1 °C), relativ luftfugtighed (45-54 ± 2%), belysning (08:00-20:00 h) med mad og vand ad libitum. Akklimatisere musene under disse forhold i en uge før eksperimentet.
3. Forsøgsprocedure
- Forbered fedtfattig kost14 som i tabel 1.
- I begyndelsen af testen udsættes hver af de dannede grupper (n = 8) for forskellige behandlinger: Feed Group 1 på en normal diæt; Gruppe 2, om fedtfattig kost; Gruppe 3, på fedtfattig kost + 100 mg/kg CC-ekstrakt; Gruppe 4, på fedtfattig kost + 250 mg/kg CC-ekstrakt; Gruppe 5, på fedtfattig diæt + 450 mg/kg CC-ekstrakt; Gruppe 6, på fedtrig kost + phentermine (et antiobesity stof, der anvendes som positiv kontrol)15.
- Foder alle grupper af mus i 5 uger og registrere mængden af mad, der forbruges dagligt.
- I et reagensglas med prop homogeniseres ekstraktet eller lægemidlet med den vanddosis, der svarer til den gruppe, som behandlingen administreres til. Dette gøres med vortex shaker.
- Når homogeniseret, tilsæt alle de tilsvarende behandling i drikkeren af hver gruppe.
4. Prøveindsamling
- Mål både fødeindtagelse og kropsvægt en gang om ugen. Spol musene natten over i en 5-ugers periode.
- Ofre dem ved livmoderhalskræft dislokation og obduktion.
- Efter at musene er blevet ofret, immobilisere dem i en liggende position.
- Brug rene kirurgiske pincet og saks, lokalisere og løfte den centrale hud i nærheden af kønsorganerne og gøre en lille 0,2 mm snit.
- Sæt den flade saks vandret ind i snittet og adskil forsigtigt mavehuden fra bugvæggen.
- Med tangen løftes den centrale hud og med den kirurgiske saks skæres den på niveauet af brystkassen. Skær derefter huden over begge bagbenene for at lette indsamlingen af fedtvæv.
- Sørg for indsamling af alle fedtvæv fra kroppen ved stump dissektion med saks og pincet. Når det er indsamlet, skal du placere fedtvævet i aluminiumsfolie. Husk at indsamle fedt omkring de reproduktive organer. Undgå akkumulering af hår og hud for ikke at ændre resultaterne.
- For at få adgang til det viscerale fedtvæv skal du skære mavemusklen med kirurgisk saks fra kønsorganerne til brystkassen, hvilket gør et snit i mavemusklerne fra kønsorganerne mod musens ryg.
- Udfør en hepatektomi for at fjerne 100% af leveren. For at eksternalisere leveren skal du fjerne unødvendige organer og skære de leverårer og arterier for at adskille leveren fra resten af kroppen. Som det sidste trin skal du netop udtrække galdeblæren fra leveren16.
- Mål hypercholesterolemi (kolesterol) og hypertriglyceridæmi (triglycerider) ved hjælp af kommercielle assay kits i henhold til producentens indikationer.
5. Statistisk analyse
BEMÆRK: Alle forsøgsresultater skal være repræsentative for tre uafhængige analysemetoder, udtrykt som middel ± standardafvigelse.
- Beregn standardfejl med en envejs ANOVA-analyse af varians efterfulgt af Tukeys områdetest. Overvej en P< 0,05 som statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ultralydassisteret ekstraktion
Den optimale ekstraktionstilstand for ekstraktionen var ethanol:vand (50:50, v/v) med en ultralydseffekt på 300 W og en ultralydsscanningstid på 30 min. På denne måde var udvindingen hurtigere end konventionelle ekstraktionsmetoder (tabel 2). Ekstraktet viste en intens absorptionsspids ved 320 nm i UV-synlige spektre (Figur 1).
Fødeindtagelse og kropsvægt
Ændringerne i musenes kropsvægt i ekstraktets forskellige koncentrationer (100, 200 og 450 mg/kg) i 5 uger er vist i figur 2A. Procentdelene for vægttab i gruppe 3, 4 og 5 var henholdsvis 12,2%, 30% og 41%. Dette viser den laveste kropsvægtøgning blev observeret i alle grupper; HFD-gruppen havde dog en stigning på 2,1x sammenlignet med den normale fedtdiætgruppe. Disse data tyder på, at en 450 mg/kg dosis CC er mere effektiv end 30 mg/kg phentermin (39% reduktion) til at reducere kropsvægtøgning.
Den gennemsnitlige fødeindtagelse ved forsøgets afslutning i HFD + CC (450 mg/mL) var 31% lavere end i den fede gruppe (HFD) med en reduktion på 1,3 g i fødeindtagelse sammenlignet med den fede gruppe (Figur 2B). Fødeindtagelsen i de HFD-fodrede mus var højere med 1,5 gange end i den normale kontrol, og dermed faldt den betydeligt (P<0,05) i alle CC-grupper i et interval på 7,14% til 31%. Kosteffektiviteten i HFD-gruppen var 16%, hvilket var væsentligt anderledes (P< 0,05) end kontrolgruppens (ND) med 11%. Disse resultater viser, at CC kan reducere HFD-induceret kropsvægtøgning.
Fedtvæv og levervægt
Vægten af epididymal WAT, subkutant fedt og perirenalt WAT-fedtvæv var højere i HFD-gruppen, men ikke i HFD-CC-grupperne (tabel 3). Levervægten blev signifikant (P<0,05) reduceret i CC-gruppen (100 til 450 mg/kg) med et interval på 15-28,4% sammenlignet med HFD-gruppens(tabel 4).
Lever lipider og serum
Niveauerne af serum triacylglycerol (TG) og total kolesterol (TC) efter 5 ugers behandling er vist i henholdsvis figur 3A og 3B. Triglycerider og det samlede kolesteroltal blev signifikant forhøjet med henholdsvis 1,32 gange og 1,31 gange i HFD-grupper sammenlignet med dem i ND-grupperne. De øgede niveauer af plasma-TG og TC i HFD-kosten blev signifikant svækket ved indgift af 200 og 450 mg/kg/km/dag CC-ekstrakt med henholdsvis 18,18% og 22,7% for TG og 16,41% og 20,61% for TC sammenlignet med kontrollen (ND).
Figur 1. UV-vis spektrum af fed og spidskommen ekstrakt (CC) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Cc's virkninger på: (A) kropsvægt (g), (B) fødeindtagelse i fedtfattig kost C57BL6/J mus ved 4 ugers behandling. Data repræsenteres som middelværdi ± SD. For hver gruppe er n=8. Forskellige bogstaver viste signifikant forskel (s<0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Virkninger af CC på: (A) Triglycerider, (B) Total kolesterol. Alle eksperimentelle data var Middel ± SD-mus (n = 8). Mus blev behandlet med 100, 200 og 450 mg/kg CC til daglig oral indgift med samtidig fodring af HFC i 5 uger. Forskellige bogstaver angiver betydelige forskelle mellem alle grupperne (P < 05). Klik her for at se en større version af dette tal.
| ingrediens | Mængde (g/kg) |
| kasein | 140 |
| L-Cystein | 1.8 |
| fedt | 120 |
| sojaolie | 40 |
| Maltodextrin 10 | 150 |
| saccharose | 450 |
| cellulose | 50 |
| Vitaminer og mineraler | Tablet-ækvivalent |
| Cholin Bitartrate | 2.5 |
Tabel 1. Fedtrig kost til C57BL6/J mus.
| magt | 370 watt |
| Vandtemperaturen | 30 °C |
| Udtrækstid | 30 min. |
| Koncentration af opløsningsmidler | 50% ethanol/50% destilleret vand |
| Antal udtræk | 2 ekstraktioner |
Tabel 2. Optimale ultralydsbetingelser til fremstilling af fed og spidskommen ekstrakt
| gruppe | Epididymal WAT (g) | Perirenal WAT (g) | Subkutant fedt (g) | Fedt/kropsvægt (g/100) |
| Nd | 0,32 ± 0,04a | 0,05 ± 0,06a | 0,08 ± 0,01b | 1.22 ± 0,09a |
| HFD | 2.30 ± 0,09b | 0,93 ± 0,07b | 0,15 ± 0,04a | 6.38 ± 1.02b |
| HFD + CC 100 mg/kg | 1,26 ± 0,08b | 0,50 ± 0,05b | 0,12 ± 0,02a,b | 5.12 ± 1.93b |
| HFD + CC 200 mg/kg | 0,90 ± 0,05b | 0,35 ± 0,04b | 0,11 ± 0,04a,b | 3.21 ± 0,32b |
| HFD + CC 400 mg/kg | 0,42 ± 0,07a | 0,16 ± 0,02c | 0,09 ± 0,03b | 2.30 ± 0,45c |
| HFD + PHE 30 mg/kg | 0,49 ± 0,05a | 0,19 ± 0,08c | 0,10 ± 0,01b | 2.41 ± 0,18c |
Tabel 3 . Effekt af CC i kost-induceret fede mus på hvid fedtvæv vægt. Hver værdi udtrykkes som middelværdien ± SD (n = 8). Forskellige bogstaver viste signifikant forskel (P<0,05) vs hvide fedtvæv (WAT)
| gruppe | Levervægt (g) |
| Nd | 1.01 ± 0,05a |
| HFD | 1,48 ± 0,08b |
| HFD + CC 100 mg/kg | 1.26 ± 0,09b |
| HFD + CC 200 mg/kg | 1.12 ± 0,03b |
| HFD + CC 400 mg/kg | 1,06 ± 0,06a |
| HFD + PHE 30 mg/kg | 1,08 ± 0,07a |
Tabel 4 . Effekt af CC i kost-induceret fede mus på levervæv vægt. Hver værdi udtrykkes som middelværdien ± SD (n = 8). Forskellige bogstaver viste signifikant forskel (P<0,05) vs hvide fedtvæv (WAT).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse vurderede vi for første gang effekten af oral administration af en kombination af nelliker og spidskommen (CC) ekstrakt på lipidprofiler og fedme hos mus fodret med en fedtrig kost i 5 uger. Resultaterne viste, at HFD-grupperne viste en betydeligt højere kropsvægtforøgelse sammenlignet med ND-gruppen, hvilket viste, at induktionen af fedme i den overvægtige model var vellykket. Den indgivne dosis CC (100, 200 og 450 mg/kg/dag) medførte en reduktion i fødeindtagelse og kropsvægt. Derfor må faldet i fødeindtagelsen skyldes et fald i dyrenes appetit.
Reduktionen af dyslipidemi er meget vigtigt for at forebygge fedmerelaterede lidelser. I vores undersøgelse var det samlede kolesteroltal og triglycerider lavere i CC-gruppen sammenlignet med dem i HFD- og phentermingrupper, der blev brugt som positiv kontrol. Resultaterne antydede, at CC kan hæmme hyperlipidemi og dens komplikationer.
Vores undersøgelse viste, at HFD-gruppen havde øget kropsfedt, herunder mave- og leverfedt, der blev reduceret betydeligt ved CC-ekstrakttilskud. Dette viser, at CC-ekstraktbehandlingen på HFD-musene reducerer lipidabsorptionen på grund af dens anti-adipogene aktivitet.
I denne undersøgelse evaluerede vi en hurtig model til bestemmelse af anti-fedme-effekten af et ekstrakt fra en kombination af spiselige planter, Syzygium aromaticum (fed) og Cuminum cyminum (spidskommen) på C57BL6 / J mus, som hurtigt udviklede fedme med en fedtrig kost. CC-behandlingen forhindrede i væsentlig grad udviklingen af fedme og forbedret hyperlipidemi induceret af HFD givet til musene. Alt i alt giver resultaterne i denne forskning solid dokumentation for, at denne hurtige metode på 5 ugers varighed udviklet i vores laboratorium kan bruges til at vurdere, om et anlæg har kapacitet til at være et potentielt middel til behandling af fedme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Instituto Politécnico Nacional México.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled Water | Any vendor | n/a | Available for other vendors as well |
| Ethanol | Fermont | 6063 | 99.8% purity |
| Diet Ingredients | |||
| Casein | Any vendor | n/a | |
| Cellulose | Any vendor | n/a | |
| Centrum balance multivitamin | Pfizer | n/a | |
| Choline Bitartrate | Any vendor | n/a | |
| L- cystein | Sigma Aldrich | 168149 | Available for other vendors as well |
| Lard | Any vendor | n/a | |
| Maltodextrin 10 | Any vendor | n/a | |
| Pellets Nutricubos | Purina | n/a | Available for other vendors as well |
| Soybean Oil | Any vendor | n/a | |
| Sucrose | Any vendor | n/a | |
| Extraction Equipment | |||
| Rotavapor | Buchi | R-300 | |
| Shimadzu UV-1800 UV/Visible Scanning Spectrophotometer | Cole Parmer | T-83400-20 | Available for other vendors as well |
| Ultrasonic Unit | Elma | TI-H-20 | Available for other vendors as well |
| Vacuum pump | Buchi | V-100 |
References
- Singla, P., Bardoloi, A., Parkash, A. A. Metabolic effects of obesity: A review. World Journal of Diabetes. 1 (1), 76-88 (2010).
- Ojulari, O. V., Lee, S. G., Nam, J. O. Beneficial Effects of Natural Bioactive Compounds from Hibiscus sabdariffa L. on Obesity. Molecules. 24 (1), 210 (2019).
- Bahmani, M., et al. Obesity phytotherapy: review of native herbs used in traditional medicine for obesity. Journal of Evidence-Based Integrative Medicine. 21 (3), 228-234 (2016).
- Ríos-Hoyo, A., Gutiérrez-Salmeán, G. New Dietary Supplements for Obesity: What We Currently Know. Current Obesity Reports. 5 (2), 262-270 (2016).
- Hasani-Ranjbar, S., Nayebi, N., Larijani, B., Abdollahi, M. A systematic review of the efficacy and safety of herbal medicines used in the treatment of obesity. World Journal Gastroenterology. 15 (25), 3073-3085 (2009).
- Hardeman, W., Griffin, S., Johnston, M., Kinmonth, A. L., Wareham, N. J. Interventions to prevent weight gain: a systematic review of psychological models and behaviour change methods. Nternational Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders. 24 (1), 131-143 (2000).
- Dinda, B., Dinda, M., Roy, A., Dinda, S. Dietary plant flavonoids in prevention of obesity and diabetes. Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. 120, 159-235 (2020).
- Mayer, M. A., Hocht, C., Puyo, A., Taira, C. A.
- Rafie, A. Z. M., Syahir, A., Ahmad, W. A. N. W., Mustafa, M. Z., Mariatulqabtiah, A. R. 2018 supplementation of stingless bee honey from heterotrigona itama improves antiobesity parameters in high-fat diet induced obese rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 6371582 (2018).
- Song, J., et al. Anti-obesity effects of the flower of prunus persica in high-fat diet-induced obese mice. Nutrients. 11, 2176 (2019).
- Jung, C. H., Ahn, J., Jeon, T. -I., Kim, T. W., Ha, T. Y. Syzygium aromaticum ethanol extract reduces high-fat diet-induced obesity in mice through downregulation of adipogenic and lipogenic gene expression. Experimental and Therapeutic Medicine. 4 (3), 409-414 (2012).
- Said, O., Saad, B., Fulder, S., Khalil, K., Kassis, E. Weight Loss in Animals and Humans Treated with "Weigh level", a Combination of Four Medicinal Plants Used in Traditional Arabic and Islamic Medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 874538 (2011).
- Anaya-Esparza, L. M., Ramos-Aguirre, D., Zamora-Gasga, V. M., Yahia, E., Montalvo-Gonzalez, E. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of phenolic compounds from Justicia spicigera leaves. Food Science and Biotechnology. 27 (4), 1093-1102 (2018).
- Ayoub, R. M., et al. The effect of anthocyanin-rich purple vegetable diets on metabolic syndrome in obese Zucker. Journal of Medical Food. , (2017).
- Go, R., et al. Effects of anti-obesity drugs, phentermine and mahuang, on the behavioral patterns in Sprague-Dawley rat model. Laboratory of Animals Research. 30 (2), 73-78 (2014).
- Tan, P., Pepin, É, Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA analysis. Journal of Visualized Experiments. (13), e57026 (2018).
- Bjorndal, B., Burri, L., Staalesen, V., Skorve, J., Berge, R. K. Different adipose depots: Their role in the development of metabolic syndrome and mitochondrial response to hypolipidemic agents. Journal of Obesity. 2011, 490650 (2011).
