Summary
עבודה זו מציגה פרוטוקול כדי לחקור את ההשפעה נגד השמנת יתר של שני צמחים המשמשים יחד, במשך 5 שבועות. היה ממשל משולב של תמצית דיאטה עתירת שומן (HFD) בעכברים שמנים. השיטה יכולה לקדם את היתרונות של צמחים בטיפול בהשמנת יתר.
Abstract
מספר מחקרים הראו כי התוכן הפיטוכימי של צמחים הם סוכנים פוטנציאליים נגד השמנת יתר. במחקר זה אנו בוחנים את ההשפעה של שימוש בשילוב של כפתורים יבשים מ Syzygium ארומטיום וזרעים מן cyminum כמון (CC) על עכברים C57BL6 /J המושרה עם השמנת יתר באמצעות דיאטה עתירת שומן (HFD). מטרת מחקר זה היא להוכיח כי השיטה המוצעת במחקר הפחיתה השמנת יתר באופן משמעותי לאחר מספר שבועות של ניסויים. התמצית משני הצמחים הוצאה באמצעות אולטרסאונד כדי לשפר את החילוץ של פיטוכימיקלים. תנאי החילוץ האופטימליים התקבלו עם אתנול כדלקמן: 50:50 v / v מים עם כוח אולטרסאונד של 300 W, וזמן ultrasonication של 30 דקות. הממשל בו זמנית של תמצית CC ב- HFD במשך 5 שבועות הוביל לוויסות פרופילי השומנים (כולסטרול וטריגליצרידים), הפחתת צריכת המזון, עלייה במשקל, רקמת שומן ומשקל כבד. ממצאים שהתקבלו על ידי מודל זה שמנים עולה כי תמצית CC יכול למנוע השמנת יתר. בהשוואה לשיטת 16 השבועות המסורתית (8 שבועות כדי לקבל שומן, ו 8 שבועות לרדת במשקל), תוצאות דומות התקבלו במחקר הנוכחי מודל שמנים בפחות זמן של ניסויים.
Introduction
הצטברות שומן גוף עודף הוא מאפיין של השמנת יתר. חוסר שיווי המשקל בין צריכת האנרגיה לצריכה מוביל לאחסון אנרגיה עודפת באדיפוציטים, הקשורה לגורמי סיכון מטבוליים להיפרגליקמיה ולעמידות לאינסולין בסוכרת מסוג 2, יתר לחץ דם, היפרכולסטרולמיה ומחלות לב וכלידם 1,2.
מוצרים טבעיים עם תופעות לוואי מינימליות ועלות נמוכה קיבלו תשומת לב מוגברת מאז מחקרים קודמים דיווחו על פיטוכימיקלים ביו-אקטיביים וסוכנים פוטנציאליים נגד השמנת יתר עם מנגנונים שהופכים או מעכבים תסמונת מטבולית ופתולוגיות נלוות8.
מספר צמחי מרפא נחקרו כדי למנוע השמנת יתר ומחלות נלוות. ביניהם, Syzygium ארומטיקום נחקרה על הפוטנציאל שלה נגד השמנת יתר בטיפול במבחנה על 3T3-L1 תאים בטיפול vivo על עכברים האכילו עם דיאטה עתירת שומן11. בנוסף, השפעות משמעותיות נגד עודף משקל נצפו בניסוי פתוח רב מרכזי של כמוינום cyminum על נושאים שמנים מאוד12. במחקר זה, עכברי C57BL6/J שימשו כדי לחקור את המודל המהיר הניסיוני כדי להעריך סוכן נגד השמנת יתר פוטנציאלי באמצעות שילוב של שני צמחים אכילים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הניסויים בבעלי חיים של Escuela Nacional de Ciencias Biologicas (IPN; פרוטוקול מס' 2732).
1. הכנת תמצית השילוב של ציפורן וכמון
הערה: הצמחים האכילים, סיזיגיום ארומטיקום (ציפורן) וצימינום כמון (כמון) נרכשו ממרכז דה אבסטוס CDMX, מקסיקו.
- לטחון 500 גרם של זרעים מן הצמחים ולבצע מיצוי בסיוע קולי. Sonicate אותם (320 וואט; תדר 24 kHz, 30 דקות) עם אתנול:מים (60:40 v /v) בטווח טמפרטורות של 30 ± 4 °C(63 °F).
- מסננים את המוצקים באמצעות נייר מסנן Whatman מספר 2 תחת ואקום ולרכז את התמצית עם מאייד סיבובי.
- למדוד את הספקטרום UV-vis של התמצית של שני הצמחים (CC).
2. בעלי חיים
- השתמש זכר C57BL6 / J עכברים של שישה שבועות (48 בסך הכל, משקל גוף 24-29 גרם) למחקר.
- בית בעלי החיים בקבוצות של שמונה בתנאי מעבדה סטנדרטיים: טמפרטורה (20-22 ± 1 °C (1 °F), לחות יחסית (45-54 ± 2%), תאורה (08:00-20:00 שעות) עם ליביטום מודעת מזון ומים. התאקלמות העכברים בתנאים אלה במשך שבוע לפני הניסוי.
3. הליך ניסיוני
- הכן את דיאטה עתירת שומן14 כמו בטבלה 1.
- בתחילת הבדיקה, נושא כל אחת מהקבוצות נוצרו (n = 8) לטיפולים שונים: קבוצת הזנה 1 על תזונה נורמלית; קבוצה 2, על דיאטה עתירת שומן; קבוצה 3, על דיאטה עתירת שומן + 100 מ"ג / קילוגרם של תמצית CC; קבוצה 4, על דיאטה עתירת שומן + 250 מ"ג/ק"ג של תמצית CC; קבוצה 5, על דיאטה עתירת שומן + 450 מ"ג / קילוגרם של תמצית CC; קבוצה 6, על דיאטה עתירת שומן + phentermine (תרופה נגד פוביות המשמשת כשליטה חיובית)15.
- להאכיל את כל קבוצות העכברים במשך 5 שבועות ולתעד את כמות המזון הנצרך מדי יום.
- במבחנה עם פקק, הומוגניזציה של התמצית או התרופה עם מינון המים המתאים לקבוצה שאליה הטיפול מנוהל. זה נעשה עם שייקר מערבולת.
- לאחר הומוגניזציה, להוסיף את כל הטיפול המתאים לתוך השתיין של כל קבוצה.
4. אוסף לדוגמה
- למדוד הן את צריכת המזון והן את משקל הגוף פעם בשבוע. תריץ את העכברים למשך 5 שבועות.
- להקריב אותם על ידי נקע בצוואר הרחם ונמק.
- לאחר שהעכברים הוקרבו, שתק אותם בתנוחה על-חושית.
- באמצעות מלקחיים כירורגיים נקיים ומספריים, לאתר ולהרים את העור המרכזי ליד איברי המין ולעשות חתך קטן 0.2 מ"מ.
- הכנס את המספריים השטוחים אופקית לתוך החתך והפרד בזהירות את עור הבטן מקיר הבטן.
- עם המלקחיים, להרים את העור המרכזי עם מספריים כירורגיים לחתוך אותו ברמה של כלוב הצלעות. ואז לחתוך את העור מעל שני הגפיים האחוריות כדי להקל על איסוף של רקמת שומן.
- להבטיח את האוסף של כל רקמת השומן מהגוף על ידי ניתוח בוטה עם מספריים ומלקחיים. לאחר איסוף, מניחים את רקמת השומן בנייר אלומיניום. זכור לאסוף את השומן סביב איברי הרבייה. הימנע הצטברות של שיער ועור כדי לא לשנות את התוצאות.
- כדי לגשת לרקמת השומן הקרביים, לחתוך את שריר הבטן עם מספריים כירורגיים מאיברי המין לכלוב הצלעות, ביצוע חתך בשרירי הבטן מאיברי המין לכיוון הגב של העכבר.
- בצע כריתת כבד כדי להסיר 100% מהכבד. כדי להחצין את הכבד, להסיר איברים מיותרים לחתוך את ורידי הכבד והעורקים כדי להפריד את הכבד משאר הגוף. כמו הצעד האחרון, בדיוק לחלץ את כיס המרה מן הכבד16.
- למדוד היפרכולסטרולמיה (כולסטרול) ו hypertriglyceridemia (טריגליצרידים) באמצעות ערכות מבחנים מסחריים על פי אינדיקציות היצרן.
5. ניתוח סטטיסטי
הערה: כל התוצאות הניסיוניות צריכות להיות מייצגות משלוש בדיקות עצמאיות, המתבטאות ככוונה ± סטיית תקן.
- חשב שגיאת תקן באמצעות ניתוח ANOVA חד-כיווני של שונות ואחריו בדיקת הטווח של Tukey. שקול P< 0.05 כמשמעותי סטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חילוץ בסיוע אולטרה סאונד
מצב החילוץ האופטימלי עבור החילוץ היה אתנול:מים (50:50, v / v) עם כוח אולטרסאונד של 300 W וזמן ultrasonication של 30 דקות. בדרך זו, החילוץ היה מהיר יותר מאשר שיטות החילוץ קונבנציונאלי (טבלה 2). התמצית הראתה שיא ספיגה אינטנסיבי של 320 ננומטר בספקטרום UV גלוי (איור 1).
צריכת מזון ומשקל גוף
השינויים במשקל הגוף של העכברים בהינתן ריכוזים שונים של התמצית (100, 200 ו 450 מ"ג / קילוגרם) במשך 5 שבועות מוצגים באיור 2A. אחוזי הירידה במשקל בקבוצות 3, 4 ו-5 היו 12.2%, 30% ו-41%, בהתאמה. זה מראה את העלייה במשקל הגוף הנמוך ביותר נצפתה בכל הקבוצות; עם זאת, הקבוצה HFD היה עלייה של 2.1x לעומת קבוצת דיאטה שומן נורמלי. נתונים אלה מצביעים על כך מינון של 450 מ"ג/ק"ג של CC יעיל יותר מ-30 מ"ג/ק"ג פנטרמין (ירידה של 39%) בהפחתת העלייה במשקל הגוף.
צריכת המזון הממוצעת בסוף הניסוי ב- HFD + CC (450 מ"ג / מ"ל) הייתה נמוכה ב -31% מזו שבקבוצה שמנה (HFD), עם ירידה של 1.3 גרם בצריכת המזון בהשוואה לקבוצה השמנה (איור 2B). צריכת המזון בעכברים שניזונו מ-HFD הייתה גבוהה פי 1.5 מאשר בשליטה הרגילה, ולכן היא ירדה באופן משמעותי (P<0.05) בכל קבוצות ה-CC בטווח של 7.14% עד 31%. שיעור יעילות הדיאטה בקבוצת HFD היה 16%, שהיה שונה באופן משמעותי (P< 0.05) מזה של קבוצת הביקורת (ND) ב 11%. תוצאות אלה מראות כי CC יכול להפחית את העלייה במשקל הגוף הנגרמת על ידי HFD.
רקמת שומן ומשקל כבד
המשקל של WAT epididymal, שומן תת עורי ורקמות שומן WAT perirenal היה גבוה יותר בקבוצה HFD- , אבל לא בקבוצות HFD-CC (טבלה 3). משקל הכבד ירד משמעותית (P<0.05) בקבוצת CC (100 עד 450 מ"ג/ק"ג) עם טווח של 15%-28.4% בהשוואה לאלה של קבוצת HFD(לוח 4).
שומנים בכבד וסרום
רמות טריאצילגליסרול בסרום (TG) וכולסטרול כללי (TC) לאחר 5 שבועות של טיפול מוצגים איורים 3A ו 3B, בהתאמה. הטריגליצרידים ורמת הכולסטרול הכוללת היו גבוהים באופן משמעותי על ידי פי 1.32 ופי 1.31, בהתאמה, בקבוצות HFD בהשוואה לאלה בקבוצות ND. רמות גבוהות של פלזמה TG ו TC בתזונת HFD נחלשו באופן משמעותי על ידי הממשל של 200 ו 450 מ"ג / קילוגרם / יום CC לחלץ על ידי 18.18% ו 22.7% עבור TG ו 16.41% ו 20.61% עבור TC, בהתאמה בהשוואה לבקרה (ND).
איור 1. UV-vis ספקטרום של ציפורן ותמצית כמון (CC) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. ההשפעות של CC על: (A) משקל גוף (g), (B) צריכת מזון בדיאטה עתירת שומן C57BL6/J עכברים ב 4 שבועות של טיפול. הנתונים מיוצגים כמשמעותיים ± SD. עבור כל קבוצה, n = 8. מכתב אחר הראה הבדל משמעותי (p<0.05). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. ההשפעות של CC על: (A) טריגליצרידים, (B) כולסטרול סה"כ. כל הנתונים הניסיוניים היו עכברי SD ± ממוצעים (n = 8). עכברים טופלו עם 100, 200 ו 450 מ"ג / קילוגרם של CC לניהול אוראלי יומי עם האכלה בו זמנית של HFD במשך 5 שבועות. אותיות שונות מצביעות על הבדלים משמעותיים בין כל הקבוצות (P < 05). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מרכיב | כמות (ז/ק"ג) |
| קזאין | 140 |
| ל-ציסטאין | 1.8 |
| שומן שומן | 120 |
| שמן סויה | 40 |
| מלטודקסטרין 10 | 150 |
| סוכרוז (נפת) | 450 |
| תאית | 50 |
| ויטמינים ומינרלים | שווה ערך לטאבלט |
| Bitartrate כולין | 2.5 |
שולחן 1. דיאטה עתירת שומן לעכברי C57BL6/J.
| כח | 370 וואט |
| טמפרטורת המים | 30 °C (86 °F) |
| זמן חילוץ | 30 דקות |
| ריכוז ממס | 50% אתנול/50% מים מזוקקים |
| מספר עקירות | 2 עקירות |
שולחן 2. תנאי אולטרסאונד אופטימליים להכנת תמצית ציפורן וכמון
| קבוצה | אפידימאלי WAT (ז) | וואט פרירנאלי (ז) | שומן תת עורי (ז) | משקל שומן/גוף (g/100) |
| מספר ND | 0.32 ± 0.04a | 0.05 ± 0.06א | 0.08 ± 0.01b | 1.22 ± 0.09a |
| HFD (תב"ד) | 2.30 ± 0.09b | 0.93 ± 0.07b | 0.15 ± 0.04a | 6.38 ± 1.02b |
| HFD + CC 100 מ"ג/ק"ג | 1.26 ± 0.08b | 0.50 ± 0.05b | 0.12 ± 0.02א,b | 5.12 ± 1.93b |
| HFD + CC 200 מ"ג/ק"ג | 0.90 ± 0.05b | 0.35 ± 0.04b | 0.11 ± 0.04a,b | 3.21 ± 0.32b |
| HFD + CC 400 מ"ג/ק"ג | 0.42 ± 0.07א | 0.16 ± 0.02c | 0.09 ± 0.03b | 2.30 ± 0.45c |
| HFD + PHE 30 מ"ג/ק"ג | 0.49 ± 0.05a | 0.19 ± 0.08c | 0.10 ± 0.01b | 2.41 ± 0.18c |
שולחן 3. ההשפעה של CC בעכברים שמנים הנגרמת על ידי דיאטה על משקל רקמת שומן לבן. כל ערך מבוטא כ ממוצע ± SD (n = 8). מכתב אחר הראה הבדל משמעותי (P<0.05) לעומת רקמת שומן לבן (WAT)
| קבוצה | משקל כבד (ז) |
| מספר ND | 1.01 ± 0.05a |
| HFD (תב"ד) | 1.48 ± 0.08b |
| HFD + CC 100 מ"ג/ק"ג | 1.26 ± 0.09b |
| HFD + CC 200 מ"ג/ק"ג | 1.12 ± 0.03b |
| HFD + CC 400 מ"ג/ק"ג | 1.06 ± 0.06א |
| HFD + PHE 30 מ"ג/ק"ג | 1.08 ± 0.07א |
שולחן 4. ההשפעה של CC בעכברים שמנים הנגרמת על ידי דיאטה על משקל רקמת הכבד. כל ערך מבוטא כ ממוצע ± SD (n = 8). מכתב שונה הראה הבדל משמעותי (P<0.05) לעומת רקמת שומן לבנה (WAT).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה הערכנו, בפעם הראשונה, את ההשפעה של ניהול אוראלי של שילוב של ציפורן וכמון (CC) תמצית על פרופילי השומנים והשמנת יתר בעכברים האכילו עם דיאטה עתירת שומן במשך 5 שבועות. הממצאים הצביעו על כך שקבוצות HFD הראו עלייה משמעותית במשקל הגוף בהשוואה לקבוצת ND, שהראתה כי אינדוקציה של השמנת יתר במודל השמנת יתר היה מוצלח. המינון המנוהל של CC (100, 200 ו 450 מ"ג / קילוגרם / יום) הפיק ירידה בצריכת המזון ומשקל הגוף. כתוצאה מכך, הירידה בצריכת המזון חייבת לנבע מירידה בתיאבון של בעלי החיים.
הפחתת דיסליפידמיה חשובה מאוד כדי למנוע הפרעות הקשורות להשמנה. במחקר שלנו, רמות הכולסטרול הכולל וטריגליצרידים היו נמוכים יותר בקבוצת CC בהשוואה לאלה בקבוצות HFD ו phentermine המשמשים כשליטה חיובית. הממצאים הראו כי CC עלול לעכב היפרליפידמיה וסיבוכים שלה.
המחקר שלנו הראה כי הקבוצה HFD גדל שומן הגוף, כולל שומן בטן וכבד אשר הופחתו באופן משמעותי על ידי תוספי תמצית CC. זה מראה כי הטיפול תמצית CC על העכברים HFD מפחית את ספיגת השומנים בשל פעילות אנטי adipogenic שלה.
במחקר זה, הערכנו מודל מהיר כדי לקבוע את ההשפעה נגד השמנת יתר של תמצית משילוב של צמחים אכילים, Syzygium ארומטיום (ציפורן) ו כמון cyminum (כמון) על C57BL6 / J עכברים, אשר פיתחה במהירות השמנת יתר עם דיאטה עתירת שומן. הטיפול CC מנע באופן משמעותי את התפתחות השמנת יתר היפרליפידמיה ameliorated הנגרמת על ידי HFD שניתנו לעכברים. בסך הכל, הממצאים במחקר זה מספקים ראיות מוצקות כי שיטה מהירה זו של משך 5 שבועות שפותחה במעבדה שלנו יכול לשמש כדי להעריך אם צמח יש את היכולת להיות סוכן פוטנציאלי לטיפול בהשמנת יתר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על ניגוד עניינים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מכון פוליטקניקו נאסיונאל מקסיקו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled Water | Any vendor | n/a | Available for other vendors as well |
| Ethanol | Fermont | 6063 | 99.8% purity |
| Diet Ingredients | |||
| Casein | Any vendor | n/a | |
| Cellulose | Any vendor | n/a | |
| Centrum balance multivitamin | Pfizer | n/a | |
| Choline Bitartrate | Any vendor | n/a | |
| L- cystein | Sigma Aldrich | 168149 | Available for other vendors as well |
| Lard | Any vendor | n/a | |
| Maltodextrin 10 | Any vendor | n/a | |
| Pellets Nutricubos | Purina | n/a | Available for other vendors as well |
| Soybean Oil | Any vendor | n/a | |
| Sucrose | Any vendor | n/a | |
| Extraction Equipment | |||
| Rotavapor | Buchi | R-300 | |
| Shimadzu UV-1800 UV/Visible Scanning Spectrophotometer | Cole Parmer | T-83400-20 | Available for other vendors as well |
| Ultrasonic Unit | Elma | TI-H-20 | Available for other vendors as well |
| Vacuum pump | Buchi | V-100 |
References
- Singla, P., Bardoloi, A., Parkash, A. A. Metabolic effects of obesity: A review. World Journal of Diabetes. 1 (1), 76-88 (2010).
- Ojulari, O. V., Lee, S. G., Nam, J. O. Beneficial Effects of Natural Bioactive Compounds from Hibiscus sabdariffa L. on Obesity. Molecules. 24 (1), 210 (2019).
- Bahmani, M., et al. Obesity phytotherapy: review of native herbs used in traditional medicine for obesity. Journal of Evidence-Based Integrative Medicine. 21 (3), 228-234 (2016).
- Ríos-Hoyo, A., Gutiérrez-Salmeán, G. New Dietary Supplements for Obesity: What We Currently Know. Current Obesity Reports. 5 (2), 262-270 (2016).
- Hasani-Ranjbar, S., Nayebi, N., Larijani, B., Abdollahi, M. A systematic review of the efficacy and safety of herbal medicines used in the treatment of obesity. World Journal Gastroenterology. 15 (25), 3073-3085 (2009).
- Hardeman, W., Griffin, S., Johnston, M., Kinmonth, A. L., Wareham, N. J. Interventions to prevent weight gain: a systematic review of psychological models and behaviour change methods. Nternational Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders. 24 (1), 131-143 (2000).
- Dinda, B., Dinda, M., Roy, A., Dinda, S. Dietary plant flavonoids in prevention of obesity and diabetes. Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. 120, 159-235 (2020).
- Mayer, M. A., Hocht, C., Puyo, A., Taira, C. A.
- Rafie, A. Z. M., Syahir, A., Ahmad, W. A. N. W., Mustafa, M. Z., Mariatulqabtiah, A. R. 2018 supplementation of stingless bee honey from heterotrigona itama improves antiobesity parameters in high-fat diet induced obese rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 6371582 (2018).
- Song, J., et al. Anti-obesity effects of the flower of prunus persica in high-fat diet-induced obese mice. Nutrients. 11, 2176 (2019).
- Jung, C. H., Ahn, J., Jeon, T. -I., Kim, T. W., Ha, T. Y. Syzygium aromaticum ethanol extract reduces high-fat diet-induced obesity in mice through downregulation of adipogenic and lipogenic gene expression. Experimental and Therapeutic Medicine. 4 (3), 409-414 (2012).
- Said, O., Saad, B., Fulder, S., Khalil, K., Kassis, E. Weight Loss in Animals and Humans Treated with "Weigh level", a Combination of Four Medicinal Plants Used in Traditional Arabic and Islamic Medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 874538 (2011).
- Anaya-Esparza, L. M., Ramos-Aguirre, D., Zamora-Gasga, V. M., Yahia, E., Montalvo-Gonzalez, E. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of phenolic compounds from Justicia spicigera leaves. Food Science and Biotechnology. 27 (4), 1093-1102 (2018).
- Ayoub, R. M., et al. The effect of anthocyanin-rich purple vegetable diets on metabolic syndrome in obese Zucker. Journal of Medical Food. , (2017).
- Go, R., et al. Effects of anti-obesity drugs, phentermine and mahuang, on the behavioral patterns in Sprague-Dawley rat model. Laboratory of Animals Research. 30 (2), 73-78 (2014).
- Tan, P., Pepin, É, Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA analysis. Journal of Visualized Experiments. (13), e57026 (2018).
- Bjorndal, B., Burri, L., Staalesen, V., Skorve, J., Berge, R. K. Different adipose depots: Their role in the development of metabolic syndrome and mitochondrial response to hypolipidemic agents. Journal of Obesity. 2011, 490650 (2011).
