Summary
Detta arbete presenterar ett protokoll för att utforska anti-fetma effekten av två växter som används tillsammans, under en 5-veckors varaktighet. Det fanns en kombinerad administrering av extraktet och fettrik kost (HFD) hos de feta mössen. Metoden kan främja fördelarna med växter vid behandling av fetma.
Abstract
Flera studier har visat att växternas fytokemiska innehåll är potentiella antifetmamedel. I denna studie undersöker vi effekten av att använda en kombination av torra knappar från Syzygium aromaticum och frön från Cuminum cyminum (CC) på C57BL6/J möss inducerad med fetma via fettrik kost (HFD). Syftet med denna studie är att visa att den metod som föreslås i studien minskade fetma avsevärt efter flera veckors experiment. Extraktet från båda växterna extraherades med ultraljud för att förbättra utvinningen av fytokemikalier. Optimala extraktionsförhållanden erhölls med etanol enligt följande: 50:50 v/v vatten med en ultraljud effekt på 300 W och ultraljud tid på 30 minuter. Samtidig administrering av CC-extraktet i HFD i 5 veckor ledde till reglering av lipidprofiler (kolesterol och triglycerider), minskning av matintag, viktökning, fettvävnad och levervikt. Resultaten som erhållits av denna överviktiga modell indikerar att CC extrakt kan förhindra fetma. Jämfört med den traditionella 16 veckor metoden (8 veckor för att få fett, och 8 veckor att gå ner i vikt), liknande resultat erhölls i den nuvarande studien överviktig modell i mindre tid av experiment.
Introduction
Överskott av kroppsfett ackumulering är ett kännetecken för fetma. Obalansen mellan energiintag och konsumtion leder till lagring av överskottsenergi i adipocyter, vilket är relaterat till metabola riskfaktorer för hyperglykemi och insulinresistens vid typ 2-diabetes, högt blodtryck, hyperkolesterolemi ochhjärt-kärlsjukdom 1,2.
Naturliga produkter med minimala biverkningar och låg kostnad har fått ökad uppmärksamhet sedan tidigare studier har rapporterat bioaktiva fytokemikalier och potentiella antifetmamedel med mekanismer som vänder eller fördröjer metaboliskt syndrom och tillhörandepatologier 8.
Flera medicinska växter har studerats för att förhindra fetma och relaterade sjukdomar. Bland dem har Syzygium aromaticum undersökts för sin anti-fetma potential i in vitro behandling på 3T3-L1 celler och in vivo behandling på möss som matas med en fettrik diet11. Dessutom observerades signifikanta anti-överviktiga effekter i en multi-center öppen studie av Cuminum cyminum på extremt överviktiga ämnen12. I denna studie användes C57BL6/J möss för att undersöka den experimentella snabbmodellen för att utvärdera ett potentiellt antifetmamedel med hjälp av en kombination av båda ätbara växter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av Escuela Nacional de Ciencias Biologicas (IPN; Protokoll nr 2732).
1. Beredning av extrakt av kombinationen av kryddnejlika och spiskummin
OBS: De ätbara växterna, Syzygium aromaticum (kryddnejlika) och Cuminum cyminum (spiskummin) köptes från Central de Abastos CDMX, Mexiko.
- Mala 500 g frön från växterna och utför ultraljudsassisterad extraktion. Sonicate dem (320 Watt; 24 kHz frekvens, 30 min) med etanol:vatten (60:40 v/v) vid ett temperaturområde på 30 ± 4 °C.
- Filtrera fasta ämnen med Whatman nummer 2 filterpapper under vakuum och koncentrera extraktet med en roterande förångare.
- Mät UV-vis-spektrumet av extraktet av båda växterna (CC).
2. Djur
- Använd hanmöss C57BL6/J som är sex veckor gamla (48 totalt, kroppsvikt 24-29 g) för studien.
- Hus djuren i grupper om åtta i standard laboratorieförhållanden: temperatur (20-22 ± 1 °C), relativ fuktighet (45-54 ± 2%), belysning (08:00-20:00 h) med mat och vatten ad libitum. Acklimatisera mössen under dessa förhållanden i en vecka före experimentet.
3. Experimentellt förfarande
- Förbered fettrik kost14 som i tabell 1.
- I början av testet, försök var och en av de grupper som bildas (n = 8) till olika behandlingar: Fodergrupp 1 på en normal kost; Grupp 2, på fettrik kost; Grupp 3, på fettrik kost + 100 mg/kg CC-extrakt; Grupp 4, på fettrik kost + 250 mg/kg CC-extrakt; Grupp 5, på fettrik kost + 450 mg/kg CC-extrakt; Grupp 6, på fettrik kost + fentermin (ett antiobesitetsläkemedel som används som positiv kontroll)15.
- Mata alla grupper av möss i 5 veckor och registrera mängden mat som konsumeras dagligen.
- Homogenisera extraktet eller läkemedlet i ett provrör med proppen med den dos vatten som motsvarar den grupp som behandlingen administreras till. Detta görs med virvelskak.
- När du har homogeniserat, tillsätt all motsvarande behandling i drinkaren i varje grupp.
4. Provtagning
- Mät både matintag och kroppsvikt en gång i veckan. Snabb mössen över natten under en 5-veckorsperiod.
- Offra dem genom livmoderhalsförskjutning och obduktion.
- När mössen har offrats, immobilisera dem i en supin position.
- Använd rena kirurgiska tångar och saxar, lokalisera och lyft den centrala huden nära könsorganen och gör ett litet snitt på 0,2 mm.
- För in den platta saxen horisontellt i snittet och separera försiktigt bukhuden från bukväggen.
- Lyft den centrala huden och skär den med den kirurgiska saxen med tången i nivå med bröstkorgen. Skär sedan huden ovanför båda bakbenen för att underlätta insamlingen av fettvävnad.
- Se till att all fettvävnad från kroppen uppsamlingen genom trubbig dissekering med sax och tång. När den har samlats in, placera fettvävnaden i aluminiumfolie. Kom ihåg att samla fettet runt reproduktionsorganen. Undvik ackumulering av hår och hud för att inte ändra resultaten.
- För att komma åt den viscerala fettvävnaden, skär bukmuskeln med kirurgisk sax från könsorganen till revbenskorgen, vilket gör ett snitt i bukmusklerna från könsorganen mot musens rygg.
- Utför en hepatektomi för att ta bort 100% av levern. För att externalisera levern, ta bort onödiga organ och skär levervenerna och artärerna för att separera levern från resten av kroppen. Som det sista steget, extrahera gallblåsan från levern16.
- Mät hyperkolesterolemi (kolesterol) och hypertriglyceridemi (triglycerider) med hjälp av kommersiella analyssatser enligt tillverkarens indikationer.
5. Statistisk analys
OBS: Alla experimentella resultat ska vara representativa från tre oberoende analyser, uttryckta som ± standardavvikelse.
- Beräkna standardfel med en enkelvägs ANOVA-analys av varians följt av Tukeys intervalltest. Betrakta en P< 0,05 som statistiskt signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ultraljudsassisterad extraktion
Det optimala extraktionsförhållandet för extraktionen var etanol:vatten (50:50, v/v) med en ultraljudseffekt på 300 W och en ultraljudstid på 30 min. På så sätt var extraktionen snabbare än konventionella extraktionsmetoder (tabell 2). Extraktet visade en intensiv absorptionstopp vid 320 nm i UV-synligt spektra (Figur 1).
Matintag och kroppsvikt
Förändringarna i mössens kroppsvikt med tanke på olika koncentrationer av extraktet (100, 200 och 450 mg/kg) under 5 veckor visas i figur 2A. Procentsatserna för viktminskning i grupperna 3, 4 och 5 var 12,2%, 30% respektive 41%. Detta visar att den lägsta kroppsviktsökningen observerades i alla grupper; HFD-gruppen hade dock en ökning på 2,1x jämfört med den normala fettdietgruppen. Dessa data tyder på att en dos på 450 mg/kg CC är effektivare än 30 mg/kg fentermin (39% minskning) för att minska kroppsviktsökningen.
Det genomsnittliga födointaget i slutet av försöket i HFD + CC (450 mg/ml) var 31 % lägre än i den överviktiga gruppen (HFD), med en minskning av 1,3 g i livsmedelsintag jämfört med den överviktiga gruppen (figur 2B). Födointaget hos de HFD-utfodrade mössen var högre med 1,5 gånger än vid normal kontroll, vilket innebär att det minskade betydligt (P<0,05) i alla CC-grupper i ett intervall på 7,14% till 31%. Dieteffektiviteten i HFD-gruppen var 16%, vilket var signifikant annorlunda (P< 0,05) än för kontrollgruppen (ND) vid 11%. Dessa resultat visar att CC kan minska HFD-inducerad kroppsviktökning.
Fettvävnad och levervikt
Vikten av epididymal WAT, subkutant fett och perirenal WAT fettvävnader var högre i HFD- gruppen, men inte i HFD-CC-grupperna (Tabell 3). Levervikten minskade signifikant (P<0,05) i CC-gruppen (100 till 450 mg/kg) med ett intervall på 15–28,4 % jämfört med HFD-gruppens (tabell 4).
Leverlipider och serum
Nivåerna av serumtriacylglycerol (TG) och totalt kolesterol (TC) efter 5 veckors behandling visas i figurerna 3A respektive 3B. Triglycerider och totala kolesterolnivån höjdes signifikant med 1, 32 gånger respektive 1, 31 gånger i HFD- grupper jämfört med dem i ND- grupperna. De ökade nivåerna av plasma TG och TC i HFD kosten försvagades avsevärt genom administrering av 200 och 450 mg/kg/dag CC extrakt med 18,18% respektive 22,7% för TG och 16,41% och 20,61% för TC, jämfört med kontrollen (ND).
Figur 1. UV-vis spektrum av kryddnejlika och spiskummin extrakt (CC) Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Effekter av CC på: (A) kroppsvikt (g), (B) matintag i fettrik diet C57BL6/J möss vid 4 veckors behandling. Uppgifterna representeras som ± SD. För varje grupp, n=8. Olika brev visade signifikant skillnad (p<0,05). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3. Effekter av CC på: (A) Triglycerider, (B) Totalt kolesterol. Alla experimentella data var Medel ± SD möss (n = 8). Möss behandlades med 100, 200 och 450 mg/kg CC för daglig oral administrering med samtidig utfodring av HFD i 5 veckor. Olika bokstäver tyder på betydande skillnader mellan alla grupper (P < 05). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| ingrediens | Kvantitet (g/kg) |
| kasein | 140 |
| L-Cystein | 1.8 |
| ister | 120 |
| Sojabönolja | 40 |
| Maltodextrin 10 | 150 |
| sackaros | 450 |
| cellulosa | 50 |
| Vitaminer och mineraler | Tablett motsvarighet |
| Kolinbitartrat | 2.5 |
Tabell 1. Fettrik kost för C57BL6/J möss.
| kraft | 370 watt |
| vattentemperatur | 30 °C (86 °F) |
| Extraktionstid | 30 min |
| Koncentration av lösningsmedel | 50% etanol/50% destillerat vatten |
| Antal extraktioner | 2 extraktioner |
Tabell 2. Optimala ultraljud villkor för beredning av kryddnejlika och spiskummin extrakt
| grupp | Epididymal WAT (g) | Perirenal WAT (g) | Subkutant fett (g) | Fett/kroppsvikt (g/100) |
| Nd | 0.32 ± 0.04a | 0,05 ± 0,06a | 0,08 ± 0,01b | 1.22 ± 0.09a |
| HFD (HFD) | 2.30 ± 0.09b | 0,93 ± 0,07b | 0.15 ± 0.04a | 6.38 ± 1.02b |
| HFD + CC 100 mg/kg | 1.26 ± 0.08b | 0,50 ± 0,05b | 0.12 ± 0.02a,b | 5.12 ± 1.93b |
| HFD + CC 200 mg/kg | 0,90 ± 0,05b | 0,35 ± 0,04b | 0.11 ± 0.04a,b | 3.21 ± 0.32b |
| HFD + CC 400 mg/kg | 0.42 ± 0.07a | 0,16 ± 0,02c | 0,09 ± 0,03b | 2.30 ± 0.45c |
| HFD + PHE 30 mg/kg | 0.49 ± 0.05a | 0,19 ± 0,08c | 0,10 ± 0,01b | 2.41 ± 0.18c |
Tabell 3. Effekten av CC i dietinducerade överviktiga möss på vit fettvävnad vikt. Varje värde uttrycks som medelvärdet ± SD (n = 8). Olika brev visade betydande skillnad (P<0,05) jämfört med vit fettvävnad (WAT)
| grupp | Levervikt (g) |
| Nd | 1.01 ± 0.05a |
| HFD (HFD) | 1.48 ± 0.08b |
| HFD + CC 100 mg/kg | 1.26 ± 0.09b |
| HFD + CC 200 mg/kg | 1.12 ± 0.03b |
| HFD + CC 400 mg/kg | 1.06 ± 0.06a |
| HFD + PHE 30 mg/kg | 1.08 ± 0.07a |
Tabell 4. Effekten av CC i dietinducerade överviktiga möss på levervävnadens vikt. Varje värde uttrycks som medelvärdet ± SD (n = 8). Olika brev visade betydande skillnad (P<0,05) jämfört med vit fettvävnad (WAT).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie utvärderade vi för första gången effekten av oral administrering av en kombination av kryddnejlika och kumminextrakt (CC) på lipidprofiler och fetma hos möss som matas med en fettrik kost i 5 veckor. Resultaten visade att HFD-grupperna visade en betydligt högre kroppsviktökning jämfört med ND-gruppen, som visade att induktion av fetma i den överviktiga modellen var framgångsrik. Den administrerade dosen CC (100, 200 och 450 mg/kg/dag) gav en minskning av födointaget och kroppsvikten. Följaktligen måste minskningen av livsmedelsintaget bero på en minskad aptit hos djuren.
Minskningen av dyslipidemi är mycket viktig för att förhindra fetmarelaterade störningar. I vår studie var de totala kolesterolnivåerna och triglycerider lägre i CC-gruppen jämfört med de i HFD- och fenterminsgrupper som används som positiv kontroll. Resultaten föreslog att CC kan hämma hyperlipidemi och dess komplikationer.
Vår studie visade att HFD gruppen hade ökat kroppsfett, inklusive buken och leverfett som minskades avsevärt av CC extrakt tillskott. Detta visar att CC-extraktbehandlingen på HFD-mössen minskar lipidabsorptionen på grund av dess anti-adipogenic aktivitet.
I denna studie utvärderade vi en snabb modell för att bestämma antifetmaeffekten av ett extrakt från en kombination av ätbara växter, Syzygium aromaticum (kryddnejlika) och Cuminum cyminum (spiskummin) på C57BL6/J möss, som snabbt utvecklade fetma med en fettrik diet. CC-behandlingen förhindrade avsevärt utvecklingen av fetma och ameliorated hyperlipidemi inducerad av HFD ges till mössen. Sammantaget ger resultaten i denna forskning solida bevis för att denna snabba metod på 5 veckors varaktighet som utvecklats i vårt laboratorium kan användas för att bedöma om en anläggning har kapacitet att vara ett potentiellt medel för behandling av fetma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författare förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av Instituto Politécnico Nacional México.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled Water | Any vendor | n/a | Available for other vendors as well |
| Ethanol | Fermont | 6063 | 99.8% purity |
| Diet Ingredients | |||
| Casein | Any vendor | n/a | |
| Cellulose | Any vendor | n/a | |
| Centrum balance multivitamin | Pfizer | n/a | |
| Choline Bitartrate | Any vendor | n/a | |
| L- cystein | Sigma Aldrich | 168149 | Available for other vendors as well |
| Lard | Any vendor | n/a | |
| Maltodextrin 10 | Any vendor | n/a | |
| Pellets Nutricubos | Purina | n/a | Available for other vendors as well |
| Soybean Oil | Any vendor | n/a | |
| Sucrose | Any vendor | n/a | |
| Extraction Equipment | |||
| Rotavapor | Buchi | R-300 | |
| Shimadzu UV-1800 UV/Visible Scanning Spectrophotometer | Cole Parmer | T-83400-20 | Available for other vendors as well |
| Ultrasonic Unit | Elma | TI-H-20 | Available for other vendors as well |
| Vacuum pump | Buchi | V-100 |
References
- Singla, P., Bardoloi, A., Parkash, A. A. Metabolic effects of obesity: A review. World Journal of Diabetes. 1 (1), 76-88 (2010).
- Ojulari, O. V., Lee, S. G., Nam, J. O. Beneficial Effects of Natural Bioactive Compounds from Hibiscus sabdariffa L. on Obesity. Molecules. 24 (1), 210 (2019).
- Bahmani, M., et al. Obesity phytotherapy: review of native herbs used in traditional medicine for obesity. Journal of Evidence-Based Integrative Medicine. 21 (3), 228-234 (2016).
- Ríos-Hoyo, A., Gutiérrez-Salmeán, G. New Dietary Supplements for Obesity: What We Currently Know. Current Obesity Reports. 5 (2), 262-270 (2016).
- Hasani-Ranjbar, S., Nayebi, N., Larijani, B., Abdollahi, M. A systematic review of the efficacy and safety of herbal medicines used in the treatment of obesity. World Journal Gastroenterology. 15 (25), 3073-3085 (2009).
- Hardeman, W., Griffin, S., Johnston, M., Kinmonth, A. L., Wareham, N. J. Interventions to prevent weight gain: a systematic review of psychological models and behaviour change methods. Nternational Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders. 24 (1), 131-143 (2000).
- Dinda, B., Dinda, M., Roy, A., Dinda, S. Dietary plant flavonoids in prevention of obesity and diabetes. Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. 120, 159-235 (2020).
- Mayer, M. A., Hocht, C., Puyo, A., Taira, C. A.
- Rafie, A. Z. M., Syahir, A., Ahmad, W. A. N. W., Mustafa, M. Z., Mariatulqabtiah, A. R. 2018 supplementation of stingless bee honey from heterotrigona itama improves antiobesity parameters in high-fat diet induced obese rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 6371582 (2018).
- Song, J., et al. Anti-obesity effects of the flower of prunus persica in high-fat diet-induced obese mice. Nutrients. 11, 2176 (2019).
- Jung, C. H., Ahn, J., Jeon, T. -I., Kim, T. W., Ha, T. Y. Syzygium aromaticum ethanol extract reduces high-fat diet-induced obesity in mice through downregulation of adipogenic and lipogenic gene expression. Experimental and Therapeutic Medicine. 4 (3), 409-414 (2012).
- Said, O., Saad, B., Fulder, S., Khalil, K., Kassis, E. Weight Loss in Animals and Humans Treated with "Weigh level", a Combination of Four Medicinal Plants Used in Traditional Arabic and Islamic Medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 874538 (2011).
- Anaya-Esparza, L. M., Ramos-Aguirre, D., Zamora-Gasga, V. M., Yahia, E., Montalvo-Gonzalez, E. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of phenolic compounds from Justicia spicigera leaves. Food Science and Biotechnology. 27 (4), 1093-1102 (2018).
- Ayoub, R. M., et al. The effect of anthocyanin-rich purple vegetable diets on metabolic syndrome in obese Zucker. Journal of Medical Food. , (2017).
- Go, R., et al. Effects of anti-obesity drugs, phentermine and mahuang, on the behavioral patterns in Sprague-Dawley rat model. Laboratory of Animals Research. 30 (2), 73-78 (2014).
- Tan, P., Pepin, É, Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA analysis. Journal of Visualized Experiments. (13), e57026 (2018).
- Bjorndal, B., Burri, L., Staalesen, V., Skorve, J., Berge, R. K. Different adipose depots: Their role in the development of metabolic syndrome and mitochondrial response to hypolipidemic agents. Journal of Obesity. 2011, 490650 (2011).
