脂質ナノ粒子は、mRNAおよびDNAカプセル化のためのマイクロ流体混合プラットフォームアプローチを用いて開発される。
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方法論記事
マイクロ流体混合プラットフォームを用いた遺伝子導入のための脂質ナノ粒子の作製と特性化
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
脂質ベースの薬物キャリアは、サイズが小さく、生体適合性、高いカプセル化効率のために、臨床的および商業的に入手可能な送達システムに使用されてきました。核酸をカプセル化する脂質ナノ粒子(LnPs)の使用は、RNAまたはDNAを分解から保護するのに有利であり、細胞の取り込みを促進する。LNPは、多くの場合、イオン化可能な脂質、ヘルパー脂質、コレステロール、ポリエチレングリコール(PEG)結合脂質を含む複数の脂質成分を含みます。LNPは、イオン化可能な脂質存在に起因する核酸を容易に封入することができ、これは低pHでカチオンであり、負に荷電したRNAまたはDNAとの複合体化を可能にする。ここでLNPは、有機相中の脂質成分と核酸成分を水相で迅速に混合してメッセンジャーRNA(mRNA)またはプラスミドDNA(pDNA)を封入することによって形成される。この混合は精密なマイクロ流体混合プラットフォームを使用して行われ、層流を維持しながらナノ粒子自己集合を可能にする。流体力学のサイズと多分散は、ダイナミック光散乱(DLS)を使用して測定されます。LNP上の有効表面電荷はゼータ電位を測定することによって決定される。カプセル化効率は、蛍光色素を使用して、封じ込められた核酸を定量化することを特徴としている。代表的な結果は、この方法の再現性と、異なる製剤およびプロセスパラメータが開発されたLNPに及ぼす影響を示す。
概要
薬物キャリアは、低細胞毒性、バイオアベイラビリティの増加、および安定性の向上1、2、3を含む典型的な好ましい特性を有する治療を保護し、提供するために使用される。ポリマーナノ粒子、ミセル、および脂質ベースの粒子は、核酸カプセル化および送達4、5、6、7について以前に検討されてきた。脂質は、高い安定性8と生体適合性であるため、リポソーム、および脂質ナノ粒子を含む異なるタイプのナノキャリア系で使用されてきた。LNPは遺伝子送達用核酸を容易に封入できる9,10.それらは、全身循環11の間に血清プロテアーゼによる分解から核酸を保護し、特定の部位への送達を改善することができ、LNPの表面地形および物性がそれらの生物分布12に影響を及ぼす。LNPはま....
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プロトコル
全体的なプロセスの概略を図 1に示します。
1. バッファの準備
注:バッファーの滅菌フィルタリングは、核酸およびLNP品質に影響を与える可能性のある微粒子を除去するために、ここで非常に推奨されています。
- リン酸緩衝生理食塩分 (PBS)
- 8 mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137 mM NaCl、およびヌクレアーゼフリー水で2.7 mM KClを使用して1x PBSを準備し、pHを7.4に調整します。
- 0.22 μmの細孔サイズフィルターを使用して真空濾過により滅菌します。
- クエン酸バッファ
- クエン酸ナトリウム5mM、クエン酸5mM、ヌクレアーゼフリー水中の塩化ナトリウム150mMを使用してクエン酸緩衝液を調製し、pH 4.5に調整します。
- 0.22 μmの細孔サイズフィルターを使用して真空濾過により滅菌します。
注: クエン酸バッファーは、mRNA が LNP にカプセル化される核酸である場合にのみ準備する必要があります。DNAがカプセル化される場合は、1.2をスキップし、1.3に進みます。
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結果
同じ脂質製剤と6のN/P比を有するLNPの複数のバッチを別々の日に開発し、この技術の再現性を実証した。バッチ1と2は、類似した多分散性を有する重なり合うサイズ分布をもたらした(図2A)2つの異なるバッチ間のサイズまたはカプセル化効率に有意な差は認められなかった(図2B)。カプセル化効率はバッチ毎に高く(>98.5%)、サイズは77 nm LNP直径と類似していた。粒子は、バッチ1の平均多分散指数(PDI)0.15、バッチ2の0.18で均一であった。
製剤パラメータの変化は、N/P比、使用されるイオン化可能脂質、および核酸をカプセル化することに関して、いくつかの小さく、まだ統計的に有意な差を示した。違いが議論されているが、生成されたすべてのLNPは、ほとんどの製剤が95%を超え、粒子サイズが110nm未満で80%を超えるカプセル化.......
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ディスカッション
再現性、速度、および低体積スクリーニングは、マイクロ流体混合を用いて、他の既存の方法(例えば、脂質フィルム水和およびエタノール注入)と比較してLNPを形成する重要な利点である。我々は、異なるLNPバッチで観察されるカプセル化効率または粒子サイズに影響を与えなく、この方法の再現性を実証した。これは、Lnpsを含むあらゆる治療が臨床的に利用可能になるための不可欠な基準です。
ここで説明する技術は、わずかな数分の時間スケールでLNP形成をもたらす、ずらしたヘリンボーン微小流体混合を採用しています。この混合は、制御と短縮時間27を混合するために有利である混沌とした対流を使用しています。このミキサーは水相と有機相が互いに効果的に27を包み込むのを可能にする。ずらしてヘリンボーン混合を用いて、以前の研究では、粒子が最小の熱力学的に安定なサイズ32で形成されることを示しており、これは、組成がLNPs27、32、33
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開示事項
著者は全員サオブフィの従業員です。著者らは、利益相反や競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
アトゥル・サルヤ、ヤティン・ゴカーン、マリア・テレサ・ペラッキア、ウォルター・シュヴェンゲル、フィリップ・ザカスの指導とLNP開発への貢献に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1,2-ジミリストイル-RAC-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール-2000 (C-14 PEG) | Avanti Polar Lipids | 880151P | |
| 10 & micro;l 目盛り付きフィルターのヒント (RNase-、DNase-、DNAフリー) | USAサイエンティフィック | 1121-3810 | |
| 1000 µl 目盛り付きフィルターチップ (RNase-,DNase-, DNAフリー) | USA Scientific | 1111-2831 | |
| 20 µl 斜めフィルターチップ (RNase-,DNase-, DNAフリー) | USA Scientific | 1120-1810 | |
| 200 µl 目盛り付きフィルターチップ (RNase-,DNase-, DNAフリー) | USA Scientific | 1120-8810 | |
| 3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-436 | |
| BD Vacutainer 汎用シリンジニードル (BD Blunt Fill Needle 18G) | Thermo Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| 卓上遠心分離機 | Beckman Coulter | ||
| Black 96 well plates | Thermo Fisher Scientific | 14-245-177 | |
| BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA フリー微量遠心チューブ (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 14-380-813 | |
| クエン酸 | フィッシャーサイエンティフィック | 02-002-611 | |
| コーニング 500ml 真空フィルター/保存ボトルシステム、0.22 um ポア | コーニング | 430769 | |
| 使い捨て折り畳み毛細血管細胞 | マルバーン | DTS1070 | |
| エチルアルコール、ピュア 200 プルーフ | シグマ アルドリッチ | 459844 | |
| フィッシャー ブランド セミマイクロ キュベット | サーモフィッシャーScientific | 14955127 | |
| Invitrogen コニカルチューブ (15 mL) (DNase-RNase-free) | Thermo Fisher Scientific | AM12500 | |
| MilliporeSigma Amicon Ultra 遠心フィルターユニット | Thermo Fisher Scientific | UFC901024 | |
| NanoAssemblr Benchtop | Precision Nanyosystems | ||
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | R11490 | |
| 塩化ナトリウム | Fisher Scientific | 02-004-036 | |
| クエン酸ナトリウム・二水和物・粒状 | Fisher Scientific | 02-004-056 | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | ||
| Zetasizer Nano | Malvern |
参考文献
- Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
- Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M.
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再版と許可
