As nanopartículas lipídicas são desenvolvidas usando uma abordagem de plataforma de mistura microfluida para encapsulamento de mRNA e DNA.
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Artigo de método
Formulando e caracterizando nanopartículas lipídicas para entrega de genes usando uma plataforma de mistura microfluida
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os portadores de medicamentos à base de lipídio têm sido usados para sistemas de entrega clinicamente e comercialmente disponíveis devido ao seu pequeno tamanho, biocompatibilidade e alta eficiência de encapsulamento. O uso de nanopartículas lipídicas (LNPs) para encapsular ácidos nucleicos é vantajoso para proteger o RNA ou DNA da degradação, ao mesmo tempo em que promove a absorção celular. Os LNPs geralmente contêm múltiplos componentes lipídesis, incluindo um lipídio ionizável, lipídio auxiliar, colesterol e lipídio conjugado de polietileno glicol (PEG). Os LNPs podem facilmente encapsular ácidos nucleicos devido à presença lipídica ionizável, que em pH baixo é cationic e permite a complexação com RNA ou DNA carregados negativamente. Aqui os LNPs são formados por encapsular o RNA mensageiro (mRNA) ou DNA plasmídeo (pDNA) usando a mistura rápida dos componentes lipídicos em uma fase orgânica e o componente ácido nucleico em uma fase aquosa. Esta mistura é realizada usando uma plataforma de mistura microfluida precisa, permitindo a automontagem de nanopartículas enquanto mantém o fluxo laminar. O tamanho hidrodinâmico e a polidispersidade são medidos usando dispersão dinâmica de luz (DLS). A carga de superfície eficaz no LNP é determinada medindo o potencial zeta. A eficiência de encapsulamento é caracterizada usando um corante fluorescente para quantificar o ácido nucleico preso. Os resultados representativos demonstram a reprodutibilidade deste método e a influência que diferentes formulações e parâmetros de processo têm sobre as LNPs desenvolvidas.
Introdução
Os portadores de drogas são usados para proteger e fornecer um terapêutico com propriedades favoráveis típicas, incluindo baixa citotoxicidade, aumento da biodisponibilidade e melhor estabilidade1,2,3. Nanopartículas poliméricas, micelas e partículas à base de lipídios foram previamente exploradas para encapsulamento e entrega de ácido nucleico4,5,6,7. Lipídios têm sido usados em diferentes tipos de sistemas de nanocarrier, incluindo lipossomos e na....
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Protocolo
Um esquema do processo global é fornecido na Figura 1.
1. Preparação de tampões
NOTA: A filtragem estéril dos buffers é altamente sugerida aqui para remover quaisquer partículas que possam impactar o ácido nucleico e a qualidade do LNP.
- Salina Tamponada fosfato (PBS)
- Prepare 1x PBS usando 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl e 2,7 mM KCl em água livre de nuclease e ajuste o pH para 7,4.
- Esterilize por filtragem a vácuo usando um filtro de tamanho de poro de 0,22 μm.
- Tampão de citrato
- ....
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Resultados
Vários lotes de LNPs com a mesma formulação lipídica e razão N/P de 6 foram desenvolvidos em dias separados para demonstrar a reprodutibilidade da técnica. Lote 1 e 2 resultaram em distribuições de tamanho sobrepostas com polidispersidade semelhante(Figura 2A) Nenhuma diferença significativa foi observada no tamanho ou eficiência de encapsulamento entre os dois lotes diferentes(Figura 2B). A eficiência de encapsulamento foi eleva.......
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Discussão
A reprodutibilidade, a velocidade e a triagem de baixo volume são vantagens significativas do uso da mistura microfluida para formar LNPs em comparação com outros métodos existentes (por exemplo, hidratação de filme lipídico e injeção de etanol). Demonstramos a reprodutibilidade deste método sem impacto na eficiência de encapsulamento ou tamanho de partículas observada com diferentes lotes de LNP. Este é um critério essencial para que qualquer terapêutico, incluindo os LNPs, se torne clinicamente disponível.
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Divulgações
Todos os autores são funcionários da Sanofi. Os autores declaram que não têm conflito de interesses ou interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Obrigado a Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger e Philip Zakas por suas orientações e contribuições para o desenvolvimento do LNP.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1,2-dimiristoíl-rac-glicero-3-metoxipolietilenoglicol-2000 (C-14 PEG) | Avanti Polar Lipids | 880151P | |
| 10 µ l Pontas de Filtro Graduadas (Livre de RNase, DNase, DNA) | USA Scientific | 1121-3810 | |
| 1000 µ l Pontas de Filtro Graduadas (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1111-2831 | |
| 20 µ l Pontas de Filtro Chanfradas (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-1810 | |
| 200 µ l Pontas de Filtro Graudadas (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-8810 | |
| 3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Colesterol) | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| BD Seringas Estéreis de Ponta Deslizante (seringa de 1 ml) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Seringas Estéreis de Ponta Deslizante (seringa de 3 ml) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-436 | |
| Agulhas de Seringa de Uso Geral BD Vacutainer (Agulha de Enchimento Blunt BD 18G) | Thermo Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Centrífuga | de Bancada Beckman Coulter | ||
| Black placas de 96 poços | Thermo Fisher Scientific | 14-245-177 | |
| BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, tubos de microcentrífuga livres de DNA (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 14-380-813 | |
| Ácido Cítrico | Fisher Scientific | 02-002-611 | |
| Corning 500ml Filtro de Vácuo/Garrafa de Armazenamento, poro de 0,22 um | Corning | 430769 | |
| Células capilares dobradas descartáveis | Malvern | DTS1070 | |
| , Puro 200 prova | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Marca Fisher Semi-Micro Cubeta | Thermo Fisher Tubos | da Scientific 14955127 | |
| (15 mL) (DNase-RNase-free) | Thermo Fisher Scientific | AM12500 | |
| MilliporeSigma Amicon Ultra Unidades de Filtro Centrífugo | Thermo Fisher Scientific | UFC901024 | |
| NanoAssemblr Benchtop | Precision Nanyosystems | ||
| Água livre de nuclease | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Tampão com Fosfato Salino (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen Kit de Ensaio de RNA | Thermo Fisher Scientific | R11490 | |
| Cloreto de Sódio | Fisher Scientific | 02-004-036 | |
| Citrato de Sódio, Di-hidratado, granular | Fisher Scientific | 02-004-056 | |
| SpectraMax i3x | Dispositivos Moleculares | ||
| Zetasizer Nano | Malvern |
Referências
- Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
- Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M.
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Reimpressões e permissões
